成大研發快訊 - 文摘
成大研發快訊 第十一卷 第九期 - 2009年十二月十一日 [ http://research.ncku.edu.tw/re/articles/c/20091211/1.html ]
利用表面電漿子共振技術於細菌抗藥性之檢測
林奇宏1、陳顯禎2*、陳浩夫3
1國立陽明大學微生物及免疫學研究所
2國立成功大學工程科學系
3國立陽明大學生醫光電工程研究所 sheanjen@mail.ncku.edu.tw
Y.-L. Chiang, C.-H. Lin, M.-Y. Yen, Y.-D. Su, S.-J. Chen, H.-F. Chen, “Innovative antimicrobial susceptibility testing method using surface plasmon resonance,” Biosensors & Bioelectronics, vol. 24, no. 7, pp. 1905-1910, March 2009.
表面電漿子(surface plasmons,SPs)在1957年首先由Ritchie預測出來,在1968 年由Otto使用光束來激發表面電漿子共振(surface plasmon resonance,SPR)。過去 數十年來,經由光所激發的SPR已經被廣泛的應用在生物檢測及其分子動力學的研 究上,其中包括生物感測器、免疫診斷、和抗體及抗原反應動態分析。藉由抗原與 相對應的抗體之化學結合專一性,SPR於生物醫學科學研究上,主要運用在抗體抗 原之間化學結合的動態分析。其衍生的應用包括生物分子存在的檢測、特定致病細 菌亞種的檢測、及特定病毒的檢測和分類。其中生物分子存在的檢測是目前SPR在
生物醫學科學研究上最主要的衍生應用,對於特定致病細菌亞種的檢測、及特定病毒的檢測和分類,是最 近幾年才逐漸開發出的應用。
感染性疾病對住院病人的發病率以及致死率有非常大的影響,也是首要的原因之一,因此臨床微生物檢驗 實驗室必須快速的檢驗出導致病人感染的微生物,並且盡快找出有效的抗生素來消滅微生物。在農業使用 上,快速檢驗微生物的抗藥性可以防止農業經濟上的重大損失與影響。而且,微生物檢驗實驗室通常被要 求的不只是有效率的完成檢驗工作,同時,在這個實驗經費削減的時代,也要減少因為檢驗工作所造成的 支出。目前在臨床實驗室上最常被使用來檢驗細菌抗藥性的方式有兩種,分別為濾紙擴散法(Kirby-Bauer disk diffusion)和微量肉湯稀釋法(variations of broth microdilution method),這兩種測試在臨床實驗室中 通常需要十八至二十四小時才能得到測驗結果,而這段時間對於需要進一步治療的病人來説不算短。
本文我們報告一種與傳統細菌抗藥性檢驗法不同的方式,運用SPR系統並整合生物程序以及現在光學科技 來進行微生物抗藥性實驗。結果顯示,對青黴素(ampicillin)有感受性的E. coli菌種可以在大約ㄧ個小時 的測量時間內與對青黴素有抗藥性的E. coli菌種作區分。這也是首次嘗試在不使用抗體抗原之化學結合 下,將SPR運用在生物醫學科學的領域中。
我們不需要使用抗體來檢測細菌的抗藥性,只需要把待測細菌貼附在金膜上,在距離金膜表面100奈米內 的細菌組織,如細胞壁、細胞膜、部分細胞質及胞器,其折射率因抗生素而變化時,表面電漿子的共振角 會隨之改變,由此變化量大小即可知該細菌對該抗生素是否具有抗藥性。依據本實驗,利用SPR可以減少 檢驗時間,在抗生素作用後一個小時內即可測出結果。抗生素對細胞壁的改變或傷害,會改變細菌的成分 和細菌的形狀,因此也改變的細菌表面的折射率。
在多聚賴氨酸(poly-L-lysine)固定聚合在金膜上後將滅菌的去離子水注入微流道中約三十分鐘,使系統 穩定,固定及穩定程序完成後,將在培養箱中培養細菌的肉汁注入微流道約三小時使細菌覆蓋住金膜表面 後用注入滅菌的去離子水洗去沒有經由多聚賴氨酸固定在金膜上的細菌,之後將抗生素溶液流入,整個實
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驗過程都由SPR系統紀錄隨著時間及折射率變化的表面電漿子之共振角。
圖一 抗藥性菌種及感受性菌種的表面電漿子之共振角位移。
使用SPR系統測量具抗藥性的菌種,其實驗曲線表示於圖一(a),而使用SPR系統測量不具抗藥性(具感受性) 的菌種,其實驗曲線表示於圖一(b)。如圖一(a)所示,當細菌注入微流道後表面電漿子之共振角增加,當細 菌覆蓋固定在金膜上且曲線顯示飽和後,注入無菌的去離子水移除沒有固定的細菌,在這個過程中表面電 漿子之共振角減少,之後流入濃度為3μg/ml青黴素溶液,隨著細菌改變而不同的折射率經運算後紀錄為隨 時間改變的表面電漿子之共振角,圖一(b)為依照同樣過程作對抗生素有感受性的菌種曲線,結果顯示,在 抗生素作用30分鐘後,抗藥性菌種對感受性菌種的表面電漿子之共振角位移分別為−0.00154度對−0.01608 度,兩者間表面電漿子之共振角位移相差約有十倍以上,顯示出青黴素造成感受性細菌細胞壁的結構鬆散 甚至破裂,因此減少了感受性菌種的折射率,而有抗藥性菌種則對青黴素有抗藥機制作用,所以減少的折 射率較感受性菌種少。
圖二 具抗生素抗藥性和感受性的菌種在抗生素作用30分鐘的掃描式電子顯微鏡影像。
抗生素感受性細菌受青黴素的破壞程度由掃描式電子顯微鏡(SEM)檢驗,圖二(a)為E. coli還沒有經抗生 素作用時的狀態,具抗生素抗藥性和感受性的菌種狀態分別顯示於圖二(b)和圖二(c),由掃描式電子顯微鏡 的圖片分別比較具抗生素抗藥性和感受性的菌種狀態可以看出並沒有明顯的不同,推測SPR感測系統較掃 描式電子顯微鏡靈敏,由SPR系統可以偵測到的改變無法由掃描式電子顯微鏡圖片上顯現。抗生素作用五 小時後,抗生素在感受性菌種的作用可由掃描式電子顯微鏡圖片上顯現。
我們使用SPR系統建構出檢測細菌抗藥性的新方法,在此研究中,SPR系統能正確且快速的分辨出E. coli JM109之抗藥性及感受性菌種,可以在幾小時內區分出對抗生素有抗藥性及感受性的菌種,如果縮短細菌
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貼附時間,則有減少偵測時間少於一小時並且得到檢驗結果的潛力,SPR系統或許可以減少檢驗所需的支 出及時間,並且增加病人的存活率。
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