行政院國家科學委員會補助
大專學生參與專題研究計畫研究成果報告
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計 畫 ：
名 稱
以葉酸受器作為標的之抗癌標靶藥物
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執行計畫學生： 劉盛忠
學生計畫編號： NSC 99-2815-C-041-005-E
研 究 期 間 ： 99 年 07 月 01 日至 100 年 02 月 28 日止，計 8 個月 指 導 教 授 ： 蕭明達
處理方式： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公
開查詢
執 行 單 位： 嘉南藥理科技大學生物科技系（所）
中華民國 100 年 03 月 30 日
研究計畫摘要 研究計畫摘要 研究計畫摘要 研究計畫摘要： ： ： ：
本研究將計劃擬將PEOH與葉酸利用脫水方式結合，形成具靶向作用的高分 子載體。利用FT-IR、NMR確定高分子載體的化學結構，並測試其相關之物化及 生化性質，如複合體之表面電位、粒徑大小、細胞毒性、緩衝能力及轉染效力。
研究動機及研究問題 研究動機及研究問題 研究動機及研究問題 研究動機及研究問題： ： ： ：
葉酸(Folate,FA)是人體所必須的維生素。哺乳動物無法在體內自行合成所需 之葉酸，所以必須靠外在環境攝取獲得。獲得的方法之一是利用細胞膜表面的特 殊蛋白質(Folate binding protein,FBP 或 Folate receptor,FR)當作細胞攝取葉酸的 入口，此種蛋白質對葉酸有很高的親和活性。在研究的文獻中顯示[1] [2]，FR 基本 上可以分為三種不同的形式，FR-α、FR-β 與 FR-γ，隨著不同的組織而有不同的 分佈。FR-α，在一般正常狀況下會表現在組織的上皮細胞中，例如腎臟、胎盤、
眼球的視網膜等，但其表現量皆不大；反之，在一些上皮細胞癌組織上，則會有 很大的表現量，例如卵巢癌、子宮癌、腦癌、腎臟癌等。FR-β，則是在一些非上 皮細胞癌會有所表現。而 FR-γ，則是在造血細胞上才會有表現。
從以上結果我們可以發現，FR 在癌細胞上的表現量遠比一般正常細胞的表 現要多，因此，我們便可以利用這個特性來達到標的的目的，並且藉由葉酸受器 為媒介的細胞內噬作用(Receptor-mediated endocytosis)，可以有效的把含有藥物的 複合體送進細胞內，是一個更好的將藥物送進細胞的方法。
以葉酸接受器做為媒介的細胞內噬作用圖[3]
文獻回顧與探討 文獻回顧與探討 文獻回顧與探討 文獻回顧與探討： ： ： ：
通常癌組織會分泌出比正常細胞多的血管增生因子，因為癌組織需要較多 的養分與空氣，所以造成腫瘤組織附近血管比起正常的血管滲透性要來的高，導 致分子體積大的高分子藥物載體，也能輕易的滲透、經過癌組織。日本熊本大學
前田浩教授所提出的 EPR 效應(Enhanced Permeation and Retention effect)，說明了 癌細胞會破壞淋巴系統，造成高分子停留在腫瘤組織附近時間會比較長，經由此 發現，若能將抗癌藥物接合在高分子載體上，可以使高分子藥物載體達到治療的 目標。由於 EPR 效應，使得高分子複合體即使沒有標的的官能基也可以大量的 累積於癌組織中。如下圖所示。
癌組織的 EPR 效應[4]
利用標的官能基與細胞受器的結合，如抗體-抗原間的專一性或是某些組織 上特有的受器，而達到標的作用，即為強制標的。此種方式具有高度專一性與選 擇性。帶有標的物的複合體，即可利用此特性直接攻擊目標細胞，如此不僅可以 縮短複合體在身體循環滯留的時間，亦可降低被免疫系統辨識的危險性，更能有 效率的直接到達目標，大幅降低對其他細胞的影響，是種較為安全且有效的攜帶 藥物治療的方式。
從將葉酸受器作為標的物的研究中，也有人提出質疑，由於葉酸接受器在一 般組織細胞上仍有些許表現量，認為這樣的標的物在標的癌細胞的同時，也會有 機會傷害到正常組織。在文獻[1]中研究指出，大部分標的有葉酸的物質是可以集 中到達癌組織的，只有一部分會對肝及腎臟產生鍵結。在肝臟的表現方面，會有 這樣的情形發生是因為一些由於發炎的刺激，造成葉酸與活化的巨噬細胞表面的 葉酸接受器鍵結，但這些活化的巨噬細胞，會被其餘的巨噬細胞所取代，並且其 餘的巨噬細胞是沒有鍵結葉酸能力的。而在腎臟的表現，則是因為腎臟的葉酸接
合成 PEOH
合成FA-PEOH
受器是位於皮髓部近曲小管的頂端，或是面對尿液的小管細胞表面，可以促進尿 液裡葉酸的再吸收，所以接枝有葉酸的物質，只會在一些腎臟發生異常，或是蛋 白尿的患者，才會有機會到達葉酸接收器。
因此，綜合以上所述，接枝有葉酸的物質，並不會對正常組織造成嚴重的 健康危害。
研究方法及步驟 研究方法及步驟 研究方法及步驟 研究方法及步驟： ： ： ：
1.1 1.1 1.1
1.1 材料材料材料：材料：： ：
a. 1,4-Diaminobutane
b. Glycidyl methacrylate(GMA) c. 6-Amino-1-hexanol 97%
d. Dicyclohexylcarbodiimide(DCC) e. N-hydroxysuccinimide(NHS) f. Folate(FA)
g. N,N-Dimethylformamide(DMF) h. Acetone
i. Ethyl acetate
j. 透析膜(3500 MWCO) k. DNA(pCMV-βgal) 1.2
1.2 1.2
1.2 實實實驗儀器實驗儀器驗儀器：驗儀器：： ：
(1) 紫外光/可見光分光度計(UV-Visible Recording Spectrometer) (2) 傅立葉紅外線光譜儀(Fourier transfer infrared,FT-IR)
(3) 核磁共振光譜儀(Nuclear magnetic resonance,NMR) (4) 冷凍乾燥機
(5) 真空冷凝減壓濃縮器
(6) 凝膠滲透層析儀(Gel permeation chromatography,GPC)
1.3 1.3 1.3
1.3 FFFFAAA----PEOHAPEOHPEOH之合成與生化性質PEOH之合成與生化性質之合成與生化性質：之合成與生化性質：：： 1.3.1
1.3.1 1.3.1
1.3.1 實驗流程圖實驗流程圖實驗流程圖實驗流程圖：：：：合成反應合成反應式如合成反應合成反應式如式如式如圖一所示圖一所示圖一所示。圖一所示。。 。
偵測 FA-PEOH 完成度：
a. UV b. IR c. NMR d. GPC
FA-PEOH(高分子載體)/DNA複合體，物理、化學性質測試：
a. 細胞毒性測試-MTT 分析 b. 膠體電泳分析
c. 基因傳遞體外試驗
合成 FA-PEOH(高分子載體)/DNA 複合體
將 GMA 與 1,4-Diaminobutane 以莫耳比 2：1 混合。
抽真空後再注入氮氣以隔絕水氣，維持在10~19℃下反應，持續16~18 小時。(合成之產物為EOD)
將 EOD 與 6-Amino-1-hexanol 以莫耳比 1：1 混合在無水 DMF 中。
置於 80~90℃油浴之反應環境中，持續反應 8~12 小時。
(合成之產物為 PEOH)
純化 PEOH；加入大量乙醚使 PEOH 沉澱出來，重複沖洗數次後以旋 轉濃縮機將殘存的乙醚抽除，再乾燥保存於 4℃冰箱中。
純化 EOD；利用丙酮與乙酸乙酯比例為 2：1 做管柱分離，移除未反 應物，然後以旋轉濃縮機將殘存丙酮與乙酸乙酯抽除，再乾燥保存於 4℃冰箱中。
1.3.1.1 1.3.1.1 1.3.1.1
1.3.1.1 PEOHPEOHPEOH的合成步驟PEOH的合成步驟的合成步驟的合成步驟：：：：
Folate、DCC/NHS，in DMF FA-PEOH
純化 FA-PEOH PEOH 1.3.1.2 FA-PEOH的合成的合成的合成的合成：：：：
將PEOH、DCC、NHS、Folate(避光)，以莫耳比1：1：1：1混合。
1.4 1.4 1.4
1.4 高分子之酸高分子之酸高分子之酸----鹼滴定分析高分子之酸鹼滴定分析鹼滴定分析鹼滴定分析：：：：
藉 由 酸 鹼 滴 定 法 來 得 知 高 分 子 之 緩 衝 能 力 範 圍 。 將 高 分 子 載 體 溶 於 NaCl 溶 液 (150 mM)，加 入 1.0M NaOH 溶 液，待 確 定 溶 液 呈 鹼 性 後 記 錄 其 pH 值。接 著 以 0.1N HCl 溶 液 滴 定 此 高 分 子 溶 液，並 記 錄 其 pH 質 變 化 ， 即 可 得 知 高 分 子 的 緩 衝 能 力 。 高 分 子 結 構 中 氨 基 被 質 子 化 能 力 無 法 含 蓋 在 pH 5.5 到 7.5， 則 會 減 少 複 合 體 進 入 到 細 胞 質 ， 因 質 子 海 綿 體 效 應 (proton sponge effect)。
1.5 電 位 及 粒 徑 大 小 分 析電 位 及 粒 徑 大 小 分 析電 位 及 粒 徑 大 小 分 析電 位 及 粒 徑 大 小 分 析 :
高 分 子 /DNA 複 合 體 的 粒 子 大 小 與 攜 帶 DNA 之 轉 染 效 率 成 反 比 ， 而 與 攜 帶 之 正 電 荷 成 正 比 ， 但 有 一 最 適 當 值 (Optimal value)。 透 過 DLS(Dynamic light scattering)來 量 測 在 水 溶 液 或 緩 衝 溶 液 中 不 同 濃 度 的 高 分 子 與 質 體 DNA 的 作 用 下 ， 其 自 組 裝 所 形 成 的 奈 米 尺 度 複
反應條件
1. 反應溫度 室溫
2.反應時間 18 hr
3.反應容器 圓底燒瓶、單頸瓶
4.反應環境 磁石攪拌，真空、填氮氣
5.反應溶劑 DMF
6.產物純化方式 大量乙醚沉降
7.產物取得方式 冷凍乾燥
100µL cell solution(105 cell/well)
Incubated 24H Added 100µL sample
Added 20µL MTT solution
Added 100µL DMSO
ELISA Reader assay 570 nm
Incubated 1H
Incubated 4H
Incubated 0.5H
合 物 之 水 力 半 徑 及 利 用 高 分 子 /DNA 複 合 體 在 電 場 中 的 Elect rop ho retic mo bi lit y 來 量 測 其 帶 的 電 荷 及 程 度 。
1.6 膠體電泳分析膠體電泳分析膠體電泳分析：膠體電泳分析：：：
DNA電泳分析主要利用DNA帶負電的特性，於電場中會穿越膠體，而朝向 正極移動。因為不同分子量的DNA於膠體的孔隙中移動的速率會有差異，藉此 可將不同大小DNA分開。在電極中，DNA移動速率與DNA分子量大小成對數反 比，而與DNA序列的組成鹼基無關。藉由膠體電泳分析，分析FA-PEOH/DNA複 合體的完成度。
膠體電泳分析[5]
1.7 細胞毒性測試細胞毒性測試細胞毒性測試：細胞毒性測試：：：
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
cell(COS-7) solution(5 mg/mL in PBS, pH7.4)take 25mg add 5mL PBS, cell concentration:100000 cell/mL。Sample 必須對細胞不造成危害。
1.8基因傳遞體外試驗基因傳遞體外試驗基因傳遞體外試驗：基因傳遞體外試驗：：：
細胞在受到轉染pCMV-βgal後會表現出半乳糖分解酵素(β-galactosid-ase)。
而 此 酵 素 可 經 由 化 學 染 色 法 來 觀 察 其 表 現 量 。 半 乳 糖 分 解 酵 素 可 將 受 質 ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactoside)分解ONPG成為O-nitrophenol與galactose，前 者為黃色。藉著ONPG染色法及可用ELISA Reader測定OD 405 nm的吸收值，來 評估轉染效果。
結果與討論 結果與討論 結果與討論 結果與討論： ： ： ：
I.高分子之結構鑑定高分子之結構鑑定高分子之結構鑑定高分子之結構鑑定：：：：
由IR圖譜(圖二) 結果顯示主要官能基確實合成存在，利用NMR進一步分
析。由H1-NMR圖(圖三)結果顯示確認合成成功，再藉由GPC分析出polymer的分
子量。接著參考文獻[8]製備出葉酸的檢量線，進而算出葉酸的接枝率。
葉酸溶液的紫外光吸收圖[8]
II. 高分子之酸高分子之酸高分子之酸高分子之酸-鹼滴定分析鹼滴定分析鹼滴定分析鹼滴定分析：：：：
酸-鹼滴定檢測於polymers, 用0.1N HCl。由緩衝能力曲線圖(圖四)結 果 顯 示 pH 5.5 到 7. 5含 蓋 在 緩 衝 能 力 中 ， 利 於 質 子 海 綿 體 效 應 。
III. 電 位 及 粒 徑 大 小 分 析電 位 及 粒 徑 大 小 分 析電 位 及 粒 徑 大 小 分 析 : 電 位 及 粒 徑 大 小 分 析
由複合體之表面電為曲線圖(圖五)結果可發現，polymer/DNA complexes 的 淨電荷是帶正電的，將有助於使 polymer/DNA complexes 與帶負電細胞膜互相吸 引靠近，利於被細胞行內噬作用。
由複合體之平均粒徑曲線圖(圖六)結果可發現，polymer/DNA complexes 的 粒徑大小小於一個細胞的大小，如此一來有助於轉染效果。
IV. 膠體電泳分析膠體電泳分析膠體電泳分析：膠體電泳分析：：：
polymers 與 DNA 依不同重量比混合之電泳圖(圖七)。(a)PEOH (b) FA-PEOH.
Lanes 1 為 Marker; Lanes 2 為 Free DNA; Lanes 3~11 為 polymers 與 DNA 之 weight ratio: 1/1, 5/1, 10/1, 50/1, 100/1, 250/1,500/1 ,750/1,1000/1. 由結果可發現，當 FA-PEOH 與 DNA 在 100/1 下， polymers 對 DNA 已有相當包覆能力，使 DNA 不被 EtBr 嵌入。
未來預期結果 未來預期結果 未來預期結果 未來預期結果： ： ： ：
藉由GPC分析出polymer的分子量，再參考文獻[8]推算出葉酸的接枝率。接著 以PEI 25k當對照組，將合成出的polymers做細胞毒性測試，且進一步比較對於不 同細胞的轉染效果。
經由 FA-PEOH 複合體再進一步作為治癌藥物，則可以使標靶藥物快速地到 達適當的地方，並且藉由細胞內噬作用進入到細胞內進行治療，降低藥物對人體 其他組織的副作用，且可以減少藥物的使用量以避免不必要的浪費，達到標靶治 癌藥物的理念。
參考文獻 參考文獻 參考文獻 參考文獻： ： ： ：
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圖一、 FA-PEOH之合成反應式
圖二、FA-PEOH之FT-IR光譜圖
圖三、PA-PEOH之H1-NMR圖
圖四、PEOH、PA-PEOH之緩衝能力曲線圖(以0.1N HCl溶液滴定)
圖五、PEOH、FA-PEOH/DNA 複合體之表面電位曲線圖(結果顯示±SD 值 (n=3))
圖六、PEOH、FA-PEOH/DNA 複合體之平均粒徑曲線圖(結果顯示±SD 值 (n=3))
圖七、PEOH、FA-PEOH/DNA複合體之膠體電泳分析圖
