科技部補助
大專學生研究計畫研究成果報告
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計 畫 :
名 稱
開發精準標訂和主動吸引 PEG 奈米藥物的雙功能抗體 以產生加成抗癌療效
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執行計畫學生: 王景禾
學生計畫編號: MOST 103-2815-C-041-013-B
研 究 期 間 : 103 年 07 月 01 日至 104 年 02 月 28 日止,計 8 個月 指 導 教 授 : 呂玉玲
處理方式: 本計畫涉及專利或其他智慧財產權,2 年後可公
開查詢
執 行 單 位: 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學藥學系(含碩
士班)
中華民國 104 年 03 月 31 日
科技部補助
大專學生研究計畫研究成果報告
計畫名稱:
Developing bi-functional antibody for synergistic anticancer effects by precise targeting and accumulation of PEGylated drugs
執行計畫學生:王景禾
學生計畫編號:103-2815-C-041 -013-B
研 究 期 間 :103 年 7 月 1 日至 104 年 2 月底止,共計 8 個月 指 導 教 授 :呂玉玲 教授
處理方式(請勾選):□立即公開查詢
█涉及專利或其他智慧財產權,□一年█二年後可公開查詢
執 行 單 位:高雄醫學大學生物醫學暨環境生物學系
中華民國 104 年 02 月 28 日
Developing bi-functional antibody for synergistic anticancer effects by precise targeting and accumulation of PEGylated drugs
開發精準標訂和主動吸引 PEGylated 奈米藥物的雙功能抗體以產 生加成抗癌療效 摘要
標靶抗體是目前癌症治療的趨勢,抗體治療的優點是可以專一性辨認乳癌或大腸癌腫瘤上 過 度 表 現 的 生 長 激 素 受 體 。 如 : HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 或 是 EGFR(epidermal growth factor receptor),進而抑制癌細胞增生但抗體藥物的缺點是腫瘤細胞會 對專一性抗體產生高度的抗藥性,導致抗體無法有效殺死腫瘤,目前研發的 PEGylated 奈米藥 物可以有效的治療癌症,PEGylated 奈米藥物具有很好的毒殺腫瘤的療效但不具有腫瘤專一性,
無法有效的在腫瘤區累積,而會在身體其它部位累積,對正常組織造成傷害,且兩種藥物一 貣使用,無法達成加成的療效,所以如何有效提升標靶抗體結合 PEGylated 奈米藥物的加成療 效(1+1≧2),將是我們的目標。因此,我們的實驗策略是開發雙邊功能的抗體,一端保留臨 床上常用的標靶抗體的特性可以專一性辨認腫瘤,另一端我們在臨床標靶抗體其 C 端接上 anti-PEG 的單鏈抗體(scFv)藥物,可以辨認 PEGylated 奈米藥物,使得本策略可以有雙重毒殺 腫瘤的功效,第一重是由雙功能抗體專一性辨認癌細胞上過度表現的腫瘤標記(如:HER2,
EGFR…),同時抗體另一端的 anti-PEG scFv 具有辨認聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的 能力,因此能夠辨認任何修飾上 PEG 的藥物,提升 PEG 藥物累積在腫瘤區域的能力,anti-PEG 的單鏈抗體能有效吸引 PEGylated drugs 積聚於腫瘤區域作用形成第二重攻擊,以雙重攻擊 (double hit)的策略達到加成毒殺腫瘤之抗癌療效。
預期結果
雙功能結合臨床標靶抗體以及PEGylated drugs的加成療效(1+1>2)(圖一);這 種創新雙重攻擊腫瘤策略的成功,極具臨床醫療價值,相信未來可快速轉譯至醫療產業市場。(圖一)雙功能抗體加成攻 擊
第一重專一性辨認上腫瘤細胞,
尾端修飾上 αPEG scFv 可吸引 PEGylated 奈米藥物以達第二重 攻擊。
二、研究動機與研究問題
標靶抗體
藥物為目前治療癌症的主要方法,藉由標靶抗體的專一性辨認,抑制了大腸 癌或是乳癌細胞上過度表現的人類上皮受體(Human Epidermal Receptor,HER),使得癌細胞 生長路徑受到阻斷進而抑制癌細胞生長。另外,抗體 Fc的部份又能藉著ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity)、CDC(complement dependent cytotoxicity)等機制吸引免疫細胞,如:自然殺手細胞,進而引貣免疫反應達到毒殺癌細胞的效果,但使用標靶藥物也是有缺點 的,癌細胞會對標靶藥物產生高度的抗藥性,因為當癌細胞過度表現之HER被標靶藥阻斷生 長路徑後,癌細胞會尋求另一條生長路徑,使得原先標靶抗體的治療方式失效。因此臨床上 會結合奈米藥物治療以提高毒殺癌細胞的效果。
PEGylated奈米藥物
是將化療包裹在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)中形成奈 米藥,而美國FDA已證實經由聚乙二醇修飾之藥物可提高分子的(1)生物相容性、(2)安全性 及(3)療效,因此聚乙二醇修飾之抗癌藥增加了藥物在人體吸收及提高在體內的半衰期,但 缺點是PEGylated奈米藥不具有對腫瘤的專一性,使得奈米藥除了毒殺癌細胞外亦會影響正 常細胞,因而導致副作用的產生,所以若能有效提升PEGylated奈米藥物累積在腫瘤的能力 是非常重要的!我們想結合標靶抗體和PEGylated奈米藥物的優點,並將缺點改善,所以我們想出把兩種 結合成
雙功能抗體,
為了提升標靶抗體結合PEGylated奈米藥物的加成療效,因此,我 們在臨床標靶抗體其C端接上anti-PEG的單鏈抗體(scFv),此策略還保留了臨床標靶抗體藥 物原有的專一性辨認癌細胞上過度表現的腫瘤標記(如:HER2,EGFR…)的能力,而另一端 結的anti-PEG scFv能辨認聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG),使得用聚乙二醇修飾之化學 治療藥物能專一性的被該雙功能抗體抓取,使治療保有原本的標靶抗體專一性並同時能主動 地抓取PEGylated奈米藥物進入癌細胞,所以此實驗設計可克服目前臨床聯合治療的缺點,並達到加成治療(圖二)。
(圖二)雙功能抗體構形
雙功能抗體是利用臨床上常用的標靶抗體 (Herceptin、Erbitux…etc)並在其 C 端利用 一段 linker 接上 αPEG scFv,此雙功能標 靶抗體保留了標靶藥物的專一性辨認,尾端 能藉由 αPEG scFv 吸引 PEGylated drugs 累積到患部達成雙重攻擊之加成療
三、 文獻回顧與探討
表皮生長因子受體屬於細胞表面接受體 ErbB 家族的成員之一 1,而當表皮生長因子受體與配 體結合後,造成細胞過度生長、抑制細胞凋亡,增加血管新生及增加腫瘤的侵犯,但是臨床研究 HER1(or EGFR)過度表現之大腸癌患者約佔了 10%-20%2,而 HER2 過度表現之乳癌患者約佔了 20%-25%,因此臨床上使用的標靶抗體(例如:Herceptin、Erbitux○R)即是針對過度表現表皮生長因 子受體之癌症病患進行治療,藉由抗體專一性的辨認表皮生長因子受體後,進而阻斷表皮生長因 子受體所引發之生長訊號而抑制癌細胞增生,以及誘發細胞凋亡(apoptosis)3,同時,抗體 Fc 部 份 則 能 吸 引 免 疫 細 胞 對 癌 細 胞 進 行 細 胞 毒 性 免 疫 效 應 (antibody dependent cellular cytotoxicity,ADCC)及 CDC 而達到毒殺癌細胞的作用4,然而標靶抗體會抗藥性的問題,而抗藥性 原因可能為當癌細胞生長路徑不斷受到抑制後,會引貣 Kras 突變,使得標靶抗體的治療效果大 幅降低,而擁有 Kras 突變病人佔了約 34%5,因此臨床上常會搭配上化學治療6,以增強癌細胞毒 殺的效果。
目前臨床使用化學治療藥常修飾上甲基化聚乙二醇(mPEG)以增加藥物在人體的吸收,由於 PEG 無毒及良好的生物相容性,因此 PEG 已被 FDA 批准可作為體內注射藥用聚合物,而修飾 上 mPEG 的藥物(1)在體內的溶解度提昇;(2)半衰期延長;(3)酶降解作用減少,免疫原性及抗 原性減少;(4)毒性減弱,雖然擁有以上種種的優點 7,但是 mPEG 修飾的藥物存在著”非專一 性”的問題,因為化學治療藥物藉著血管在腫瘤位置的新生以及細胞間質變得鬆散而得以累積 (Enhanced Permeability and Retention effect,EPR effect)8,以達到毒殺的效果,但是化療藥物同時 也會累積在正常細胞位置使得正常細胞死亡,所以在 combine therapy 中化療藥物會帶來很大的 副作用,使得病患無法得到良好的治療。
我們開發出一雙功能抗體,使得抗體一端保留標靶抗體藥物對於癌症病患上過度表現之腫瘤 標記(如:HER2,EGFR…)專一性辨認的功能,並在抗體的另一端利用 linker 結合上能專一性辨 認 mPEG 的 scFv,使得利用 mPEG 修飾的化學治療藥能專一且主動地被抓取到癌症部位,進而 增加了化學治療的專一性,而減少了化學治療對正常細胞的傷害,此雙功能抗體結合了標靶抗體 藥及化學治療藥的優點,因此我們希望此雙功能抗體能達到 1+1≧2 的加成治療療效。
此雙功能抗體優點:(1)專一性的結合到大腸癌細胞位置; (2)保留抗體 Fc 部份能吸引免疫細 胞對癌細胞進行細胞毒性免疫效應;(3)主動地抓取 mPEG 修飾的化學治療藥物進入癌細胞,增 強毒殺的效果,且降低了化療藥物非專一性累積而造成副作用的問題。
圖四
四、研究方法及步驟
已完成部份:
1 .設計雙功能抗體的質體
目的
:利用 PCR 建構出雙功能抗體的序列方法
:設計雙功能抗體 DNA 序列,使得抗體一端保留標靶抗體藥物對於過度表現之 EGFR 專一性 辨認的功能,並在抗體的另一端結合上能專一性辨認 PEG 的 scFv,中間再以 linker(GGGSGGG) 相連接。2. 建構攜帶雙功能抗體序列的載體
目的
: 將雙功能抗體基因接入 pLKO-AS2載體中。方法
:(1)將 PCR 出來的雙功能抗體序列接入到 pLKO-AS2載體中。
(2)再來用 Nhe1 和 Asc1 兩個限制酶切位確認我們的基因有順利接進去。
(A)
結果:
(A 圖)我們要的片段大小,αEGFR Ab 大小約為 2300bp,
αEGFR Ab+αPEG scFv 以及 αEGFR Ab+αDNS 的基因大 小約為 3000bp,pLKO_AS2 質體大小約為 7200bp ,大小 符合預期。
3.利用細胞短暫表現雙功能抗體並測試其表現
目的:
利用 western blot 測試細胞表現後雙功能抗體的結構與表現方法:
(1)先將 293T cell seed 1.2x106 into 6-well plate for 24hrs (2)利用 TransIT 將 plasmid 送入 293T 細胞裡面
(3)經 4~6 小時後,將 DMEM+10%BCS 的 medium 換成 serum free medium (4)經 48hrs 後,收上清液及細胞
(5)跑 Western bloting
結果:
(A)圖為 non-redcing PAGE,αEGFR Ab 大小約為 180kDa、
αEGFR Ab +αPEG scFv 和 αEGFR Ab +αDNS 大小約 為 220kDa。(B) 圖為
reducingPAGE , αEGFR Ab 大小約為 90kDa、αEGFR Ab + αPEG scFv 和 αEGFR Ab +αDNS 大小約為 110kDa,以上 兩張圖都有壓到我所要的大小。
討論
在(B)圖 reducingPAGE 中,αEGFR Ab +αPEG 的 mediunm 部份的 band 並不是這麼明顯,推測 是濃度太低。4.利用 flow cytometry 測試細胞的表現
目的:
測試 HT-29、SW480 及 SkBr3,三株細胞的 EGFR 表現,以便選擇用於評估in vitro 及 in vivo 實驗之 cell line方法:
(1)將 SW480、HT-29、SkBr3 處理成 2x105/管
(2)Wash by 3ml PBS+0.05%BSA/次 at 4℃ for 1500rpm、3mins ,共兩次 (3)加入一抗(Erbitux) on ice for 50mins
(4)Wash by 3ml PBS+0.05%BSA/次 at 4℃ for 1500rpm、3mins ,共三次 (5)加入 GoatαHuman IgG FITC on ice for 50mins
(6)Wash by 3ml PBS+0.05%BSA/次 at 4℃ for 1500rpm、3mins ,共三次 (7)回溶 pellet by 0.3ml PBS+0.05%BSA+PI
(8)上機
結果:
由此三張 flow 的結果可以發現 SW480 的 EGFR 表現相較於 HT-29 和 SkBr3 的 EGFR 表現還要好,
所以我們選用 SW480 這株細胞來做 cell-based ELISA。
5. 利用 cell-based ELISA 測試雙功能抗體單雙邊功能
目的:
利用 cell-based ELISA 測試雙功能抗體單雙邊的功能方法:
(1) Coating poly-D-lysine/PBS in 96-well plate
(2) Seed 1x105/well 的 SW480 細胞 in 96-well plate for 24hrs (3) 加入雙功能抗體
(4) αEGFR 單邊功能組別直接加入二抗(GoatαHuman IgG Fc-γ-HRP)
(5) 雙邊功能組別加入 PEG 奈米藥物(Lipo-dox)再加入 AGP4-biotin,最後加入 SA-HRP (6) 兩個組別都加入 ABTS 進行呈色。
(7) ELISA reader(OD405nm).
結果
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
單邊功能
αEGFR Ab
αEGFR Ab.+αPEG scFv
αEGFR Ab.+αDNS scFv
單邊功能組別可以看到αEGFR Ab 和 αEGFR Ab.+αDNS scFv 的 bar 沒有很高,那麼在雙邊功能組 別,雖然圖型符合預期,但是兩張 data 圖的縱軸值都偏低,這部份會再重調 condition 再重新一次。
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
雙邊功能
αEGFR Ab. αEGFR Ab.+αPEG scFv αEGFR Ab.+αDNS scFv
未來進度:
1. 藉由 Expi 293 系統小量製備出雙功能抗體
目的:用 expi 293 小量製備雙功能抗體
方法:
(1) 將雙功能抗體的 plasmid 送入到 expi 293 細胞裡 (2) 數天之後將我們的 medium 收貣來離心
(3) 離心後取上清
2.利用 Protein A column 純化雙功能抗體
目的:
純化出雙功能抗體方法:
(1)大量收集穩定表現雙功能抗體的 CHO-DG44 細胞上清液做為蛋白質的樣本 (2)將含有雙功能抗體的上清液通 Protein A affinity column 進行純化
(3)利用 SDS-PAGE 去測純化後雙功能抗體蛋白質純度及分子量
3.In vitro
證明結合雙功能抗體及 PEG 藥物對癌細胞具有加成療 效
目的
:是否雙功能抗體可以結合 PEG 奈米藥物抑制癌細胞生長方法:
(1) 培養腫瘤細胞(SW480)
(2) 依序加入雙功能抗體及 PEG 奈米藥物(如:lipo-DOX),加藥完後六小時移除藥物。(雙功能 抗體+Lipo-Dox、Lipo-Dox+Herceptin)
(3) 過了 72 小時後,利用 ATPlite 檢測細胞的存活率,並觀察是否有加成療效?
4.測試雙功能抗體是否具有antibody-dependent cell-mediated
cytotoxicity (ADCC) 及complement dependent cytotoxicity (CDC)
的效果
目的:
測試雙功能抗體是否具有引貣 ADCC 及 CDC 的效果。方法:
將雙功能抗體及 PBMC(或 Human serum)加入 tumor cell 中經過 6 小時 後,利用 LDH assay kit 測試 cell lysis 的程度。
5.In vivo證明雙功能抗體在活體具有加成性療效 目的:
是否雙功能抗體能有效抑制腫瘤大小方法:
(1)
建立 SW480 腫瘤動物模式(2)
等腫瘤長到一定程度後,將雙功能抗體及 PEGylated 奈米藥(如:lipo-DOX)打入老鼠體內。(PBS、control、雙功能抗體,三個組別)
(3)
觀察老鼠腫瘤是否有變小(4)
五、 結論
(5) 大腸癌為目前國人癌症死亡人數第一名,而臨床上標靶抗體(αEGFR Ab.)用藥 Erbitux
○R用於臨床病人存活平均時間為(the median survival time)為 6.9 個月,合 併化學治療後平均存活期達兩年,而乳癌則為國人女性中發生率為第一名,臨 床標靶用藥 Herceptin
○R,合併化學治療後腫瘤惡化時間從 3.6 個月延長到 7.6 個月。因此,我們想要升大腸癌以及乳癌病患的存活期,更進一步的抑制癌細 胞的生長後,有利於手術的切除,同時,降低化療藥物所帶來的副作用,例如 化療藥物 Doxorubicin
(6) 會使病人心血管方面、代謝或腎臟等方面會有副作用,使得目前臨床上使用之 結合型治療的非專一性、抗藥性以及副作用得到解決,並提昇治療專一性,同 時擁有化學治療及標靶治療並使得治療效果能夠1+1≧2 。所以我們開發了雙功 能抗體,把臨床上常用的標靶抗體(αEGFR Ab.)和PEGylated奈米藥物做結合。
(7) 首先我們先建構雙功能抗體基因,再來將質體轉染到細胞中,利用西方點 墨法測定抗體表現,接下用cell-based ELISA測試雙功能抗體的功能,未來建立 穩定細胞株、純化出雙功能抗體,然後再in vitro和in vivo上進行治療。
(8) 目前進度已用PCR完成基因的建立,並用cloning確認基因是否正確無誤,再
來送進細胞表現出我們所開發的雙功能抗體,利用western blot測試雙功能抗體
的表現及結構,再來利用cell-based ELISA測試雙功能抗體的單雙邊功能,不過
在這個實驗前先做flow cytometry選擇我們在in vitro及in vivo的細胞株。
(9) 在未來確定了雙功能抗體的單雙邊功能後,先建立穩定細胞株並純化出我們 的雙功能抗體,再來做細胞毒殺看是否能抑制癌細胞生長,接下來確定雙功能 抗體是否具有ADCC和CDC的效果,希望雙功能抗體能主動吸引PEG奈米藥物 且不影響Fc端的免疫反應,最後進到活體實驗看是否能抑制腫瘤大小。
(10) 如果這一切成功的話,對癌症治療是有很大的貢獻:
(11) (1)延長癌症病患的生命
(12) (2)大幅降低PEGylated奈米藥物副作用並提高累積在患部的量 (13) (3)解決腫瘤細胞對標靶抗體產生抗藥性進而導致療效降低。
六、參考文獻
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doi:10.1016/j.drudis.2006.07.005 (2006).