國立台灣大學醫學院微生物研究所 碩士論文
Graduate Institute of Microbiology College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 的鑑定與功能分析 Characterization and Functional Study of
Topoisomerase II in Giardia lamblia
林柏齊 Bo-Chi Lin
指導教授: 孫錦虹 博士 Advisor: Chin-Hung Sun, Ph.D.
中華民國 100 年 7 月
July 2011
致謝
很高興此刻終於將這份論文在這邊畫下一個句點，回想一開始進入這實驗室時，
對很多實驗器具和藥品很不熟，實驗的操作方式也是不大會，常常要麻煩實驗室 裡的學長姐，實驗的進度也不算是太順利，為了要確定自己研究的方向，確實是 吃了很多苦頭，現在回想起來那段日子還真是不可思議。在這研究所的兩年過程 裡，學到的不只是寄生蟲和分子生物學上了知識和技術，其實更重要的是在這過 程中我知道了我自己做事的缺點，我想這對我來說是很重要的，我想對我以後會 有很大的幫助，所以很感謝老師用一個這麼好的方式在領導他的學生，適時的在 教導我的過程中有一些叮嚀，提醒我一些我所犯的過錯，而這就是讓我知道自己 缺點所在，也很感謝實驗室的立欣學姊、玉嬌學姐和昭成學長在實驗上給予我很 多教導，加偉學弟和紹維學弟也在實驗上給我很大的幫助，也很開心和我一起進 研究所的同學佳妤、盈君、嘉偉、李由，我們一起努力完成了這兩年來大大小小 的考試、專討和報告，當然也包括各自的論文，恭喜大家可以一起畢業，再朝向 下一個目標前進。感謝我的口試委員李財坤老師和詹迺立老師在我的論文內給我 很多很專業的建議和幫助，也謝謝李老師實驗室的王學姐和梁同學，還有詹老師 實驗室的吳學姐，在我實驗上遇到問題時給我的幫助。也很感謝台灣大學給我們 一個好環境，好設備，做我們研究的後盾。最後我要謝謝我的家人，以前從來沒 想過我可以從台大研究所畢業，謝謝你們給我的支持，讓我可以讀書讀到碩士，
在未來我會用我最大的努力來回報你們給我的一切。
摘要
梨形鞭毛蟲是具有鞭毛的單細胞生物，它是全世界造成腹瀉的常見原因之一。根 據16s rRNA 序列分析，梨形鞭毛蟲是非常原始的真核生物。已經有研究發現在 梨形鞭毛蟲的基因體存在有拓樸異構酶-II 的基因。拓樸異構酶-II 的功能是當基 因進行轉錄或是 DNA 複製時負責對 DNA 進行解螺旋和恢復超螺旋結構。先前 研究發現梨形鞭毛蟲Myb2 蛋白是一個重要的轉錄因子之一，負責調節囊體化時 期大量表現之基因。而我們也在梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 基因的啟動子上找到 了Myb2 蛋白的結合位置，所以本研究目標是想要了解在梨形鞭毛蟲囊體化過程 中，拓樸異構酶所扮演的角色。我們發現拓樸異構酶-II 基因在囊體化時期 mRNA 的表現上升，而且拓樸異構酶-II 基因的啟動子活性也在囊體化時期上升，表示 拓樸異構酶-II 在囊體化時期表現量提高，可能在這個時期有某些功能或作用。
而梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 的序列也和真核生物的拓樸異構酶-II 相似。從電泳 位移分析實驗中得知拓樸異構酶-II 和其 C 端部分也具有結合雙股 DNA 的能力，
並且也具有切割雙股 DNA 的能力。從分解 ATP 活性分析中得知拓樸異構酶-II 和其N 端部分也具有分解 ATP 能力。Etoposide 是一種抗腫瘤藥物，在藥物治療 上 此 藥 物 屬 於 拓 樸 異 構 酶-II 的 抑 制 物 。 以 添 加 濃 度 為 400μM 的 抑 制 劑 -eoposide，觀察梨形鞭毛蟲的生長情形，發現加藥後 3~24 小時滋養體數目明顯 少於對照組。表示eoposide 可以抑制滋養體的生長。在進行囊體化 24 小時期間 添加濃度 400μM 的 eoposide，也發現囊體數目明顯少於對照組，表示 eoposide 也會抑制梨形鞭毛蟲從滋養體分化成囊體。而在過度表現拓樸異構酶-II 細胞株 中我們發現細胞形成囊體的能力有上升的情形，且一些與囊體化相關的基因表現 都有上升，例如 cwp1、cwp2、myb，表示拓樸異構酶確實在梨形鞭毛蟲囊體化 過程中扮演一個重要的角色。
關鍵字:梨形鞭毛蟲、拓墣異構酶、囊壁蛋白、囊體化、etoposide
Abstract
Giardia lamblia is a flagellated unicellular eukaryotic microorganism that commonly
causes diarrheal disease throughout the world. According to the 16s rRNA sequence analysis, G. lamblia has been proposed as an early branching eukaryote. A gene encoding type II DNA topoisomerase was identified in G. lamblia genome.
Topoisomerases are enzymes that unwind and wind DNA, in order for genes to be transcribed and to facilitate DNA replication. Myb2 protein is a transcription factor that regulates some genes that were highly expressed during encystation stage. We found that a Myb2 binding site is present in the topoisomerase II gene promoter. The aim of this study is to understand the role of topoisomerase II in Giardia encystation.
We found that the endogenous topoisomerase II mRNA levels increases significantly during encystation. The topoisomerase II activity tested by a luciferase reporter system also increased during encystation. The results suggest that topoisomerase II gene may be upregulated during encystation stage and it may have some function in this stage. The sequence of the G. lamblia topoisomerase II is similar to that of the eukaryotic topoisomerase II. EMSA data indicate that topoisomerase II and C-terminal part of topoisomerase II can bind to double stranded DNA, and topoisomerase II and C-terminal part of topoisomerase II have double stranded DNA cleavage ability. ATPase data indicate that topoisomerase II and N-terminal part of topoisomerase II can hydorlyze ATP. Etoposide is an anti-cancer chemotherapy drug.
This medication is classified as a topoisomerase II inhibitor. We added etoposide in trophozoite cultures at 400μM concentration and observed cell growth, and found that the cell number decreased significantly 3~24 h after treatment. The results suggest that topoisomerase II may lead to inhibition of G. lamblia cell growth. Addition of 400μM etoposide also resulted a significant decrease of cyst number during 24h
encystation, suggesting that topoisomerase II may inhibit G. lamblia differentiation into cysts. Overexpression of topoisomerase II resulted in an increase in the levels of cyst formation and expression of genes for encystation, including cwp1, cwp2 and myb genes, suggesting that topoisomerase II plays an important role in the encystation of G. lamblia.
Keywords: Giardia lamblia、topoisomerase II、cyst wall protein、etoposide、
encystation
目 錄
口試委員會審定書………...………..i
誌謝……….……..……….ii
中文摘要……….…………..………iii
英文摘要……….……….……….iv
第一章 前言………1
1.1 簡介……….………1
1.2 拓樸異構酶………...……….………….2
1.3 研究動機……….………5
第二章 材料與方法……….….7
2.1 梨形鞭毛蟲細胞株的培養………...………...…7
2.2 轉殖質體的建構……….….7
2.2.1 5’ᇞ5N-Pac………..…7
2.2.2 pPgTopoIIWT……….…7
2.2.3 pPgTopoIIm1………..………8
2.2.4 pPgTopoIIm2………..……8
2.2.5 pPgTopoIIm3………..……9
2.3 重組 gTopoII 以及突變 gTopoII 蛋白質的表現載體建構………9
2.3.1 gTopoII………...…9
2.3.2 gTopoII-N……….……10
2.3.3 gTopoII-C……….…10
2.3.4 gTopoII-Cm1………10
2.3.5 gTopoII-Cm2………11
2.3.6 gTopoII-Cm3………11
2.4 轉殖質體的轉型與萃取………...…11
2.4.1 質體的轉型 (transformation) ………...…11
2.4.2 質體的萃取………12
2.5 重組蛋白的表現與純化………12
2.6 梨形鞭毛蟲的轉染與選殖………...…13
2.7 反轉錄聚合酶鏈式反應 (RT-PCR) ………13
2.8 西方墨點法 (Western blot) 與 Coomassie blue 染色……….………14
2.8.1 西方墨點法………...….…14
2.8.2 Coomassie blue 染色………15
2.9 免疫螢光染色 (Immunofluorescence assay) ………..……15
2.10 Electroretic Mobility Shift Assays (EMSA) ………16
2.11 切割 DNA 活性分析………...…16
2.12 水解 ATP 活性分析……….16
第三章 實驗結果………18
3.1 梨形鞭毛蟲 gtopoII 基因序列及胺基酸序列分析……….…18
3.2 以RT-PCR及luciferase偵測滋養體時期和囊體時期gtopoII基因的mRNA 表現量與啟動子活性………19
3.3 梨形鞭毛蟲 gtopoII 基因的表現……….…20
3.4 梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N 端、C 端切割雙股 DNA 活性分析…….…20
3.5 梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N 端、C 端 ATPase 活性分析…………...…..21
3.6 梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N 端、C 端結合雙股 DNA 活性分…….……22
3.7 利用不同基因的啟動子序列鑑定 gTopoII-C 端蛋白與 DNA 結合能…22 3.8 抗腫瘤藥物 etoposide 抑制梨形鞭毛蟲生長………23
3.9 抗腫瘤藥物 etoposide 抑制滋養體時期梨形鞭毛蟲 Cwp1 表現………25
3.10 抗腫瘤藥物 etoposide 抑制梨形鞭毛蟲形成囊體………...25
3.11 鑑定突變 gTopoII 的表現以及切割和結合 DNA 的能力………26
3.12 分析gTopoII以及gTopoII突變蛋白對於囊體化相關基因的調控和囊體 形成的影響………..………27
第四章 討論………29
4.1 梨形鞭毛蟲 TopoII 蛋白功能區域分析………..……29
4.2 gTopoII 具有與鎂離子結合區域……….……...30
4.3 gTopoII 偏好與 AT-rich 序列做結合………31
4.4 Etoposide對梨形鞭毛蟲的生長和分化的影響………31
4.5 gTopoII促進梨形鞭毛蟲行囊體化………...……32
4.6 myb基因與gtopoII基因的表現之互相調控關係………..……32
附圖………..…34
參考文獻………...………...……68
第一章 前言
1.1 簡介
梨形鞭毛蟲(Giardia lamblia)是一種人體腸道的致病性原蟲類寄生蟲，為世界 性分布，每年造成2 億 8000 萬個感染病例(Lane and Lloyd, 2002)。感染途徑主要 為透過食入受汙染的食物及飲水(Adam, 2001)，感染型的梨形鞭毛蟲可存活在環 境 中 非 常 長 的 時 間 ， 且 只 要 接 觸 少 量 的 感 染 型 梨 形 鞭 毛 蟲 即 會 被 感 染(10 cyst)( Rendtorff, 1954)。首次是在 1681 年 van Leeuwenhoek 利用顯微鏡觀察自己 腹瀉之糞便而發現，至今已被認為是主要造成人類和哺乳類動物腹瀉原因之一，
但致病機制尚未清楚(Ankarklev, 2010)。Giardiasis 的症狀出現在受感染後六到十 五天，包含下痢、噁心、嘔吐、上腹部疼痛、體重減輕。容易受感染之族群為孩 童、營養不良或是免疫系統缺陷之人 (Ankarklev, 2010)，大約一半左右的感染者 在受感染期間並無症狀且會自然痊癒(Farthing, 1997)。
利用 16S rRNA 作演化上的分析，顯示梨形鞭毛蟲是非常原始的真核生物 (Sogin et al., 1989)。它有像一般真核生物的細胞核(雙核、4N 染色體)、細胞核膜、
細胞骨架等，但缺乏一些一般真核生物所應有的胞器，例如：核仁、過氧化體 (peroxisome)等；此外，它是一種厭氧性生物，且欠缺了參與氧化磷酸化的因子 以及粒線體(Adam, 2001)，但 Tovar 等人在一些小胞器內發現粒線體的標記蛋白 質 IscS 和 IscU，因此目前認為在梨形鞭毛蟲中是具有萎縮的粒線體，稱之為 Mitosome(Tovar et al., 2003)。梨形鞭毛蟲也不具有高基氏體(Golgi apparatus)，但 其細胞中有encystation-specific vesicles(ESVs)的存在，也被認為可能是高基氏體 的類似胞器(Marti et al., 2003)。
梨 形 鞭 毛 蟲 的 生 活 史 可 以 分 為 兩 個 時 期 ， 包 含 囊 體 (cyst) 和 滋 養 體 (trophozoite)，感染型為囊體，滋養體具有一對吸盤，兩個細胞核，四對鞭毛，
會以落葉狀運動。當宿主吃下囊體後，囊體受到胃酸刺激會在小腸進行脫囊
(excystation)，釋出兩個滋養體，滋養體主要寄生在小腸，並在此處大量繁殖。
具有吸盤的滋養體會吸附在腸道上皮細胞，進而影響營養素吸收而引起腹瀉等症 狀。當進入結腸之後開始進行囊體化(encystation)，經過一次複製形成四個核的 囊體並隨糞便排出，如再被宿主吃入則可完成其生活史。在形成囊體時，囊體壁 蛋白(cyst wall protein, Cwp)相關的基因需要被大量表現，像是cwp1、cwp2及cwp3 (Lujan et al., 1995; Leigh A et al., 1999; Sun et al., 2003)等，但目前這幾個基因的調 控機制並不是非常清楚，已知有數個轉錄因子參與此調控，例如Myb、GARP、
WRKY、ARID及Pax(Sun et al., 2002; Sun et al., 2006, Wang et al., 2007 , Huang et al., 2008; Pan et al., 2009; Wang et al., 2010)。梨形鞭毛蟲Myb蛋白會在囊體化時
期大量表現，先前已經有研究指出Myb是一個囊體化時期重要的轉錄因子，並會 結合在囊體化時期大量表現之基因的啟動子(promoter) C(T/A)ACAG序列上，例 如cwp1、cwp2及cwp3(Sun et al., 2002)。
1.2 拓樸異構酶
DNA 拓樸異構酶(Topoisomerase)已經被發現存在於真核生物和原核生物細 胞內，功能在於解決 DNA 在生理現象上的拓樸性質的問題(Wang, 1996)。可以 催化單股或雙股DNA 的斷裂，而使斷裂的單股通過到完整的單股 DNA 另一邊，
斷裂的雙股DNA 通過到另一條完整雙股 DNA 的另一邊，造成拓樸性質的改變。
當DNA 進行複製、轉錄時都需要拓樸異構酶的幫助(Wang, 2009)。DNA 拓樸異 構酶可以分為Type I、Type II、兩種不同的類型(Wang, 2009)，而 Type I 又可以 細分為Type IA 和 Type IB，Type II 也可以細分為 Type IIA 和 Type IIB。其中 Type I 拓樸異構酶可以切斷單股 DNA，type II 拓樸異構酶可以切斷雙股 DNA，
所有的拓樸異構酶都是利用酵素活性中心的 Tyrosine 做親合性的攻擊去打斷 DNA 的磷酸雙酯鍵(Phosphodiester bond)( Corbett et al., 2004)。
Type II 拓樸異構酶是需要消耗 ATP 來達到打斷雙股 DNA 作用。在 1976 年
首先由Gellert 等人分離出來(Gellert et al., 1976)，是屬於 Type IIA，此類別包括 真核生物的拓樸異構酶-II、細菌的 Gyrase 和拓樸異構酶-IV。真核生物的拓樸異 構酶-II 是以同型二聚體(Homodimer)的形式存在於細胞內，而細菌的 Gyrase 和拓 樸異構酶-IV 有兩種次單位(subunit)，以異型四聚體(Heterotetramer)的形式存在，
GyrA、GyrB 為 Gyrase 的次單位，ParC、ParE 為拓樸異構酶-IV 的次單位(Bergerat et al., 1997)。經過 Type II 拓樸異構酶的催化，可以藉由導入正向螺旋或是負向
螺旋改變 DNA 的兩個環繞數(linking number)(Gellert et al.,1976; Brown et al., 1979) 。過去研究也發現 Type II DNA 拓樸異構酶也參與在染色體的分離 (segregation)和維持染色體的結構(Wang, 2002)。Type IIB 是由 Bergerat 等人發現 (Bergerat et al., 1994)，包括了古細菌和一些植物中都發現有拓樸異構酶-VI 的存 在(Kevin et al., 2007)，也有兩種次單位 A 和 B，但拓樸異構酶-VI 的構型和其他 種類的拓樸異構酶不太一樣，在序列上有別於其它種類的拓樸異構酶，因此Type II DNA 拓樸異構酶的分類上分成兩種不同家族的蛋白質(Buhler et al., 1998)。
Type II DNA 拓樸異構酶在大多數的具有生命現象的細胞中都可以發現，而真核 生物至少會包含一種以上的Type II DNA 拓樸異構酶，例如在大多數真核細胞中 都會存在DNA 拓樸異構酶-II，在脊椎動物中存在著兩種 DNA 拓樸異構酶-II 異 構物，拓樸異構酶- IIα 和拓樸異構酶-IIβ(Watt et al., 1994; Gimenez-Abian et al., 1995)。
真核生物的細胞分裂包括了兩個重要步驟，染色體的複製和染色體分離到兩 個子細胞，此時可能會受到一些外來的致病因子所威脅，像是自由基或是紫外 線，但主要造成基因體不穩定（genomic instability）的原因來自於 DNA 的生理 現象，致因包括DNA 複製、同源性重組(homologous recombination)、有絲分裂 時的染色體分離，可能造成缺失或是不正常交換現象(German, 1974; Murray et al., 1985; Holm, 1994; Bierne et al., 1994)。先前已有在一些實驗中發現拓樸異構酶-II 對於細胞週期和細胞分裂的重要性，例如酵母菌在拓樸異構酶-II 的突變實驗中，
有絲分裂時因為拓樸異構酶-II 的突變，使染色體分離造成了斷裂(DiNardo et al., 1984; Holm et al., 1985, 1989; Uemura et al., 1987)。在其他實驗中發現失去正常功 能的拓樸異構酶-II 會造成細胞週期停留在有絲分裂第一期，停止細胞生長，但 不會失去存活能力(Rose et al., 1990, 1993)。而在哺乳動物中存在著兩種拓樸異構 酶-II 異構物，已經有研究發現兩種拓樸異構酶雖然具有相似的活性(Austin et al., 1998)，但是在細胞的生長中卻受到不同的調節，並且兩種酵素之間的角色無法 互相補償(Carpenter et al., 2004; Yang et al., 2000; Akimitsu et al., 2003)。另一方 面，拓樸異構酶- IIα 只發現在增殖(proliferation)的細胞當中(Heck et al., 1988;
Hsiang et al., 1988)，而拓樸異構酶-IIβ 則是顯著的表現在分化晚期的細胞當中 (Capranico et al., 1992; Tsutsui et al., 1993, 2001; Turley et al., 1997; Lyu et al., 2003; Watanabe et al., 1994)。細胞發育或分化的過程中包括了基因的轉錄、DNA 的複製、染色體的分離，這些都必須有拓樸異構酶的參與，以解決在DNA 上遇 到的拓樸性質問題，以利於進行發育和分化，因此拓樸異構酶在細胞的生長上扮 演了一個不可或缺的角色。目前已經得知拓樸異構酶- IIα 在細胞進行有絲分裂是 必須的，參與在DNA 的複製與分離染色體(Wang, 2002)。拓樸異構酶-IIβ 已經被 發現參與在神經系統的發育。研究發現缺失拓樸異構酶-IIβ 基因會導致小鼠運動 神經發育不完全(Yang et al., 2000)。並發現拓樸異構酶-IIβ 可能參與在小腦神經 早期發育，調控相關發育基因的表現(Tsutsui et al., 2001)。
先前已經有一些關於梨形鞭毛蟲染色體的研究報告，例如，雖然梨形鞭毛蟲 的五條染色體已經利用PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)技術分離開來，但 是目前並沒有任何DNA 以染色體(chromosome)的型態被發現(Adam, 2001)，所以 可能梨形鞭毛蟲並沒有染色質(chromatin)轉換成染色體的情形存在(He et al., 2005)。還有目前並沒有發現到有核仁(nucleoli)的存在，而且 rRNA 的轉錄和修 飾也不是在細胞核的中心進行(Li et al., 1997; Narcisi et al., 1998; Adam, 2001 )。
先前已經有研究發現梨形鞭毛蟲具有 Type II DNA 拓樸異構酶的基因存在，
但僅限於序列分析(He et al., 2005)，梨形鞭毛蟲的 Type II DNA 拓樸異構酶是屬 於Type IIA，基因全長有 4476 個核苷酸，且不帶有內含子(Intron)，並且從胺基 酸序列上來看，和其它真核生物的DNA 拓樸異構酶-II 具有高度的同源性(He et al., 2005)，但是有一些相異於其它真核生物 DNA 拓樸異構酶-II 的地方有被發
現，像是有一些短片段序列，7~46 個胺基酸序列插入在 ATPase domain 和序列中 心區域(central domain)，中心區域也較其它 DNA 拓樸異構酶-II 多了大約 100 個 胺基酸，但C 端短了大約 200 個胺基酸，且特別的是梨形鞭毛蟲 DNA 拓樸異構 酶-II 的 C 端(第 1335~1491 胺基酸)富含帶有電荷的胺基酸，D、E、K 和 R 大約 占了C 端的 43%(He et al., 2005)。
在1993 年時 Bell 等人找到一種可以有效抑制梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-II 的 藥物，Bis-Benzimidazoles，他們發現此種藥物效果比之前用來治療梨形鞭毛蟲的 Quinacrine HCI 和 Metronidazole 效果還要好(Bell et al., 1993)，但其實驗中使用純 化自梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-II，可能含有其他拓樸異構酶。烷化劑(alkylating agents)是一種抗腫瘤藥物，Bis-Benzimidazoles 是烷化劑的攜帶者(carrier)，和 DNA 的次要溝槽(minor groove)有高親和性，可以將烷化劑帶到特定的 DNA 序列上 (Stephanie et al., 2007)。而現在普遍用來抑制拓樸異構酶-II 的藥物為 etoposide，
是一種抗癌藥物，可以穩定拓樸異構酶-II 切斷 DNA 所暫時形成的 DNA-酵素複 合物，使DNA 保持在斷裂的狀態，造成細胞的嚴重損傷(Helen et al., 2007)。
1.3 研究動機
對於梨形鞭毛蟲來說要不斷的繁衍，生活史就必須一直循環下去，所以梨形 鞭毛蟲生活史中滋養體和囊體間的循環對於物種的延續是非常重要的事情。許多 研究指出生物的拓樸異構酶-II對於細胞的週期和細胞的發育都扮演著極重要的 角色，但梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶的研究只有對於梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-II 的序列做一些分析，或者是針對抑制拓樸異構酶-II的藥物，測試其治療梨形鞭毛
蟲感染症的效果。由於已知梨形鞭毛蟲生活史兩個時期的轉換是非常重要的，而 梨形鞭毛蟲在進入囊體期還會進行一次細胞複製，轉變為四個細胞核，更可以想 像拓樸異構酶-II對於梨形鞭毛蟲的重要性，所以我們想要進一步研究拓樸異構酶 -II的一些特性，並且想知道是否會影響梨形鞭毛蟲的細胞分化。另外我們發現梨 形鞭毛蟲拓樸異構酶-II的啟動子上有一段Myb蛋白的結合序列CTACAG，因此 Myb蛋白可能可以調節拓樸異構酶-II的表現。我們已經知道Myb為囊體化時期一 個重要的轉錄因子，會結合在囊體化時期大量表現之基因的啟動子(promoter) C(T/A)ACAG序列上，例如cwp1、cwp2及cwp3(Sun et al., 2002)。而在進入囊體化 時期可能又需要拓樸異構酶的輔助，以利於一些有關囊體化的基因表現和細胞核 的複製與分離，因此在這之中調節囊體化的一連串關係是我們所想要研究的。
第二章 材料與方法 2.1 梨形鞭毛蟲細胞株的培養
梨形鞭毛蟲 WB 蟲株(ATCC30957)培養在 TYI-S-33 培養液（Keister et al., 1983）中，含 10％(v/v)小牛血清。經基因轉殖之蟲株，於培養液加入 54ug/ml 嘌呤霉素作為篩選蟲株之用；行囊體化時，將梨形鞭毛蟲滋養體培養至 late log phase 時，放入含有 12.5mg/ml 小牛膽鹽（bovine bile）的 TYI-S-33 培養液，在 pH 7.8 的環境下培養 24 小時。
2.2 轉殖質體的建構 2.2.1 5’ᇞ5N-Pac
實驗中所使用的 5’5N-Pac 為沿用 Singer et al.,1998 所發表的 5’ 5N-Pac 質體。此質體包含 puromycin-N-acetyltransferase(pac)基因，其 5’和 3’flanking region 為 glutamate dehydrogenase gene(gdh)基因的 5’和 3’flanking region，分別為 44bp 和 129bp。
2.2.2 pPgTopoIIWT
質 體 pPgTopoIIWT 建 構 方 式 為 利 用 帶 有 KpnI 切 位 序 列 的 引 子 gTopoIIKF(TCGCCGGTACCTCTCCTACCTCATCATGTTCT)和帶有 AvrII 切位
的 引 子
gTopoIIAR(GGCCGCCTAGGCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAG GTCATCTTCTCCATTTTC)，gTopoIIAR 上帶有 HA-tag 序列，以便在 gtopoII 基 因後接上HA-tagg。之後將這兩段引子以梨形鞭毛蟲 genomic DNA 為模板做 PCR 反應，將所得到的DNA 片段以 KpnI 和 AvrII 處理後，最後接入以 KpnI 和 XbaI 處理過後之5’pac OP23N 載體。完成後的質體 pPgTopoIIWT 是由 gtopoII 基因本
身的啟動子調控 gtopoII 基因並且在 C 端有一個 HA- tag，而質體的篩選是利用 puromycin。
2.2.3 pPgTopoIIm1
質體pPgTopoIIm1 建構方式分為兩段式 PCR 反應，第一階段是分別利用兩 組引子以梨形鞭毛蟲 genomic DNA 為模板做 PCR 反應，兩組引子分別為帶有
KpnI 切 位 序 列 的 引 子
gTopoIIKF(TCGCCGGTACCTCTCCTACCTCATCATGTTCT) 和 TopoIIm1R( TATGTAGAAATGTGACGAGGAGCA) 和 另 一 組 引 子 ， TopoIIm1F(TGCTCCTCGTCACATTTCTACATA) 和 帶 有 AvrII 切 位 的 引 子 gTopoIIAR(GGCCGCCTAGGCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAG GTCATCTTCTCCATTTTC)，gTopoIIAR 上帶有 HA-tag 序列。第二階段是利用分
別 為 帶 有 KpnI 切 位 序 列 的 引 子
gTopoIIKF(TCGCCGGTACCTCTCCTACCTCATCATGTTCT)和帶有 AvrII 切位
的 引 子
gTopoIIAR(GGCCGCCTAGGCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAG GTCATCTTCTCCATTTTC)以第一階段的兩段 PCR 產物為模板在進行 PCR 反 應，將所得到的DNA 片段以 KpnI 和 AvrII 處理後，最後接入以 KpnI 和 XbaI 處 理過後之5’pac OP23N 載體。完成後的質體 pPgTopoIIm1 是由 gtopoII 基因本身 的啟動子調控 gtopoIIm1 基因並且在 C 端有一個 HA- tag，而質體的篩選是利用 puromycin。
2.2.4 pPgTopoIIm2
質 體 pPgTopoIIm2 建 構 方 式 為 利 用 帶 有 KpnI 切 位 序 列 的 引 子 gTopoIIKF(TCGCCGGTACCTCTCCTACCTCATCATGTTCT)和帶有 AvrII 切位
的 引 子
gTopoIIm2R(GGCCGCCTAGGCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGG TTTGCTCCATGTGGCGATC)，gTopoIIm2R 上帶有 HA-tag 序列，以便在 gtopoIIm2 基因後接上 HA-tag。之後將這兩段引子以梨形鞭毛蟲 genomic DNA 為模板做 PCR 反應，將所得到的 DNA 片段以 KpnI 和 AvrII 處理後，最後接入以 KpnI 和 XbaI 處理過後之 5’pac OP23N 載體。完成後的質體 pPgTopoIIm2 是由 gtopoII 基 因本身的啟動子調控 gtopoIIm2 基因並且在 C 端有一個 HA-tag，而質體的篩選是 利用puromycin。
2.2.5 pPgTopoIIm3
質 體 pPgTopoIIm3 建 構 方 式 為 利 用 帶 有 KpnI 切 位 序 列 的 引 子 gTopoIIKF(TCGCCGGTACCTCTCCTACCTCATCATGTTCT)和帶有 AvrII 切位
的 引 子
gTopoIIm3R(TCTTCCCTAGGCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGATACCT TGCAAGAGGATCCAAGTA)，gTopoIIm3R 上帶有 HA-tag 序列，以便在 gtopoIIm3 基因後接上 HA-tag。之後將這兩段引子以梨形鞭毛蟲 genomic DNA 為模板做 PCR 反應，將所得到的 DNA 片段以 KpnI 和 AvrII 處理後，最後接入以 KpnI 和 XbaI 處理過後之 5’pac OP23N 載體。完成後的質體 pPgTopoIIm3 是由 gtopoII 基 因本身的啟動子調控 gtopoIIm3 基因並且在 C 端有一個 HA-tag，而質體的篩選是 利用puromycin。
2.3 重組 gTopoII 以及突變 gTopoII 蛋白質的表現載體建構 2.3.1 gTopoII
以 梨 形 鞭 毛 蟲 genomic DNA 為 模 板 ， 利 用
gTopoIIF(CACCATGGCCCAGAAGGCGAAG) 和
gTopoIIR(AAGGTCATCTTCTCCATT)進行 PCR 反應，將 PCR 產物接到表現載
體pET101/D-TOPO®(Invitrogen)，表現出的蛋白質 C 端帶有 6-His 和 V5 的抗原 決定標記。
2.3.2 gTopoII-N
以 梨 形 鞭 毛 蟲 genomic DNA 為 模 板 ， 利 用
gTopoIIF(CACCATGGCCCAGAAGGCGAAG) 和
gTopoII-NR(GAGAAGCTGGCTTGTTTT)進行 PCR 反應，將 PCR 產物接到表現 載體pET101/D-TOPO®(Invitrogen)，表現出的蛋白質 C 端帶有 6-His 和 V5 的抗 原決定標記。
2.3.3 gTopoII-C
以 梨 形 鞭 毛 蟲 genomic DNA 為 模 板 ， 利 用 gTopoII-CF(CACCATGGGCATCCCTAAGCTC) 和 gTopoIIR(AAGGTCATCTTCTCCATT)進行 PCR 反應，將 PCR 產物接到表現載體 pET101/D-TOPO®(Invitrogen)，表現出的蛋白質 C 端帶有 6-His 和 V5 的抗原決定 標記。
2.3.4 gTopoII-Cm1
以 梨 形 鞭 毛 蟲 genomic DNA 為 模 板 將 gTopoII-CF(CACCATGGGCATCCCTAAGCTC) 和 gTopoIIm1R(TATGTAGAAATGTGACGAGGAGCA)進行 PCR 反應產物和另一組 引 子 gTopoIIm1F(TGCTCCTCGTCACATTTCTACATA) 和 gTopoIIR(AAGGTCATCTTCTCCATT) 的 PCR 產 物 利 用 gTopoII-CF(CACCATGGGCATCCCTAAGCTC) 和
gTopoIIR(AAGGTCATCTTCTCCATT)進行第二次 PCR 反應，將 PCR 產物接到表 現載體pET101/D-TOPO®(Invitrogen)，表現出的蛋白質 C 端帶有 6-His 和 V5 的 抗原決定標記。
2.3.5 gTopoII-Cm2
以 梨 形 鞭 毛 蟲 genomic DNA 為 模 板 ， 利 用 gTopoII-CF(CACCATGGGCATCCCTAAGCTC) 和 gTopoIIm2R(GGTTTGCTCCATGTGGCG)進行 PCR 反應，將 PCR 產物接到表現 載體pET101/D-TOPO®(Invitrogen)，表現出的蛋白質 C 端帶有 6-His 和 V5 的抗 原決定標記。
2.3.6 gTopoII-Cm3
以 梨 形 鞭 毛 蟲 genomic DNA 為 模 板 ， 利 用 gTopoII-CF(CACCATGGGCATCCCTAAGCTC) 和 gTopoIIm3R(CCTTGCAAGAGGATCCAAGTA)進行 PCR 反應，將 PCR 產物接到 表現載體 pET101/D-TOPO®(Invitrogen)，表現出的蛋白質 C 端帶有 6-His 和 V5 的抗原決定標記。
2.4 轉殖質體的轉型與萃取
2.4.1 質體的轉型 (transformation)
將建構完成之質體DNA 以 42 度 C 熱休克法（heat shock）送入大腸桿菌勝 任細胞（competent cell；DH5α），將菌液塗抹在 LB-ampicillin plate 上並放置於 37℃下培養 16 小時，質體上帶有抗 ampicillin 基因，藉此篩選出成功轉型的勝任 細胞，從長出的數個菌落挑取單一菌株，之後利用 PCR 方式來初步挑選出帶有
我們所接進質體內的序列。
2.4.2 質體的萃取
將挑選出的菌株置於含有ampicillin的LB培養液，在37℃震盪培養16小時。
以High-Speed Plasmid Mini Kit（Geneaid）萃取質體DNA，溶於50 μl 的滅菌二次 水，將之保存於-20℃。萃取出的質體DNA利用限制酶做確認，在37℃反應2小時，
再利用凝膠電泳法分離各片段，確認切出的產物符合預期並將質體DNA以自動 DNA定序法(ABI 3730)確認序列。 經過自動DNA定序法確認序列無誤之菌株，
接種至含有ampicillin 之250ml LB培養液，於37℃震盪培養16小時。利用Maxi plasmid Kit 進行DNA萃取，最後將DNA溶於60 ul無菌二次水，保存於-20℃。
2.5 重組蛋白的表現與純化
表現載體則是轉型至 Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen)，隨後加 入5ml 的 LB 培養液中隔夜培養後，倒入 250ml 的 LB 培養液裡，使其菌量生長 至A600吸光值為0.5 時，加入 1 mM 的 isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG；
Promega)反應 4 小時，隨後細菌藉由離心收集後，加入 10 ml sonication buffer(50 mM sodium phosphate/pH 8.0，300 mM NaCl 和 10 mM imidazole)和蛋白脢抑制劑 (Sigma)後，利用聲裂法(SONICATOR® 3000；MISONIX)將細菌打破，離心後後 將上清液和1ml 的 50% Ni-NTA Agarose(Qiagen)混合於 4℃下 1 小時，使其吸附 蛋白質，之後將resin 用 20ml wash bufer(50 mM sodium phosphate/pH 8.0，300 mM NaCl 和 20 mM imidazole)清洗，再利用 6ml elution buffer(50 mM sodium phosphate/pH 8.0，300 mM NaCl 和 250 mM imidazole)將蛋白質分離下來，之後 將其放入透析袋裡放至於透析液(25 mM HEPES, pH 7.9, 20mM KCl, and 15%
glycerol)裡透析，隨後將之分裝保存於-80℃。
2.6 梨形鞭毛蟲的轉染與選殖
將培養於50ml TYI-S-33培養液的梨形鞭毛蟲WB蟲株生長至細胞密度為2.5x106 cells/ml時，放在冰上30分鐘讓吸附在管壁上的蟲體落下，離心1500 rpm七分鐘後 將上清液到掉，再用10 ml TYI-S-33培養液清洗、再懸浮沉澱的蟲體，再次離心 後，把上清液倒掉7 ml後，用剩下的培養液再懸浮蟲體，取600 μl來做轉染用，
將建構完成的轉染質體約60 μg以電穿孔方式（720 om、1000 μF、350 V）轉染進 入WB蟲株內。轉染後的蟲株在16~24小時之間加入篩選藥物54 μg/ml嘌呤霉素，
此後每隔48小時換藥，在此過程中，蟲體會逐漸死亡，當貼壁細胞剩下1%時已 達到篩選完成之作用，此時將嘌呤霉素濃度維持不變，使蟲株繼續生長完成選殖。
2.7 反轉錄聚合酶鏈式反應 (RT-PCR)
利用TRIzol reagent（MD Bio Inc）抽取梨形鞭毛蟲滋養體和囊體化 24 小時 的全部RNA，利用 DNase 處理後，再利用含有 0.9% (v/v) formaldehyde 的 1.3%
(w/v)洋菜糖膠體電泳法，確認 RNA 品質與定量。取 5 μg RNA 加入 oligo (dT)、
Random hexamer 和 Superscript II RNase H 反轉錄脢(Invitrogen)，經 42℃下 50 分 鐘後，將RNA 反轉錄為 cDNA，並將 cDNA 以 PCR 方式增幅。分析的基因和使 用 的 引 子 如 下 ； gTopoII (total): topoII828F(AATACCAATGACTCTGAC) 、 topoII1311R(CTCCTCCGTAGCCTTGGA) ， gTopoII (overexpressed):
topoII1794F(GATGGGTCGCACATTAAA) 、
anti-HA(AGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA) ， cwp1: CWP1F (ATGATGCTCGCTCTCCTT) 、CWP1R (TCAAGGCGGGGTGAGGCA) ， cwp2:
CWP2realF2(GATGCCCTGGATGGTGCTA) 、 TOPOCWP2R
(CCTTCTGCGGACAATAGGCT) ，
cwp3:CWPrealF3(GCAAATTGGATGCCAAACAA) 、
CWP3AU5ER(GGCGGAATTCTTACTTGAGGTAGAAATCGGTTCTGTAGTAG
GGCGGCTGTATCTTG) ， myb:
MYBm2F(GTGCTATCAACAAAATAGCCATTATTTGAGGAG) 、
MYBrealR(AGCACGCAGAGGCCAAGT) ， ran: RANF (ATGTCTGACCCAATCAGC) 、 RANR (TCAATCATCGTCGGGAAG) ，
riboL7:RIBOL7F(CACCATGCCTATCCCCGAGCTCGT) 、
RIBOL7R(TTAGATCATTCGGGCAACAA) ，
18S:18SF(AAGACCGCCTCTGTCAATCAA) 、
18SR(GTTTACGGCCGGGAATACG)
2.8 西方墨點法 (Western blot) 與 Coomassie blue 染色
將梨形鞭毛蟲滋養體或囊體化 24 小時的梨形鞭毛蟲，培養至細胞密度為 2x106 cell/ml 時，放置冰上約 30 分鐘後，1500 rpm 離心 7 分鐘，去除上清液，
以1ml 1X PBS 清洗過一次，加入 50 μl 1X PBS、5 μl protease inhibitor 和 500 μl 6%TCA，在 4℃下放置隔夜以沉澱全部的蛋白質，隨後離心 12500 rpm 10 分鐘 移除上清液，將沉澱的蛋白質加入80 μl 2X sample buffer (62.5 mM Tris、4.1%
SDS、20% glycerol、0.2% bromophenol blue、10 mM DTT)將蛋白質溶解，利用 1N NaOH 將溶液滴定成藍色；取定量體積的蛋白質（20 μl）置於 95℃加熱 5 分 鐘後。經過處理之sample 依序注入 SDS-PAGE 中以電泳分離（電壓 150V～250V）。 2.8.1 西方墨點法
進行西方墨點法，將 SDS-PAGE 利用濕式轉漬器將分離的蛋白質轉漬到 nitrocellulose membrane (GE healthcare)上(電壓 70V，3 小時)，隨後將轉漬膜於室 溫下浸泡於6% 脫脂奶粉的 PBST (20 mM Tris、150 mM NaCl 與 0.1% Tween-20) 1 小時，藉以阻斷非專一性抗原反應，之後以 1X PBST 將抗體稀釋至適當倍率（for anti-HA；for anti-CWP1；for anti-Myb；for anti-Ran）後加入，於室溫下作用 1
小時後移除一級抗體，並以PBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘。之後，再加入相同 於上述比例稀釋於1X PBST 溶液的二級抗體 anti-mouse-HRP 和 anti-rabbit-HRP 抗體（Sigma），於室溫下作用1 小時後，使用 1X PBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘。
最後將經抗體處理過之轉漬膜加入化學冷光劑ECL kit（Visglow ; Millipore）作 用1 分鐘後。將轉漬膜置於壓片夾中與 High performance chemiluminesence film
（Fuji）進行感光作用，完成感光之底片進行顯影作用。
2.8.2 Coomassie blue 染色
進行Coomassie blue染色，將SDS-PAGE放入Coomassie blue染液染色一天，
隔天以de-stain進行退染作用三次後，以肉眼觀察即可。
2.9 免疫螢光染色 (Immunofluorescence assay)
將轉染不同質體的滋養體或囊體化24 小時的梨形鞭毛蟲，生長至細胞密度 為2x106 cells/ml 時，放置冰上約 30 分鐘後，1500rpm 離心 7 分鐘，去除上清液，
利用1X PBS 清洗後，再加入 400 μl 1X PBS 使蟲體懸浮，將其放置玻璃蓋玻片 上，37℃下放置 15 分鐘，經 1X PBS 清洗 2 次後，於 4℃下置於甲醇（methanol）
固定10 分鐘後風乾，隨後利用 0.5% Triton 反應 30 分鐘，blocking buffer（goat serum 5%、glycerol 1%、BSA 0.1%、fish gelatin 0.1%、sodium azide 0.04%）反應 1 小 時，之後以anti-HA mono-clonal antibody（1/300 倍稀釋於 blocking buffer）作用 一小時，以1X PBS 清洗 4 次（每次 5 分鐘）後，再以 anti-mouse ALEXA 568（1/300 倍稀釋於blocking buffer）作用一小時後，以 1X PBS 清洗 3 次（每次 5 分鐘），
4% Paraformadhyde 作用 7 分鐘，以 ProLong®Antifade Kit (Invitrogen)封片後，使 用Leica TCS SP5 Spectral Confocal System 照相觀察。
2.10 Electroretic Mobility Shift Assays (EMSA)
利用T4 polynucleotide kinase(NEB)將探針的 5 端標定 γ-32P(GE healthcare)，隨後 將標定好探針(0.02 pmol)與 5 ng 純化的蛋白質於 binding buffer(50 mM Tris-Cl (pH7.4)，50 mM KCl, 1 mM EDTA，1 mM dithiothreitol，0.1 mg/ml bovine serum albumin)室溫下反應 15 分鐘；如進行競爭反應，則加入超過標定探針 200 倍濃度 的非標定探針；如進行抗體supershift 反應，則加入 0.8μg 的 anti- V5-horseradish peroxidase antibody(Bethyl Laboratories)；反應後再利用 PAGE 經由電泳分離探針 和探針-蛋白質複合物，之後將 PAGE 乾燥於濾紙上，利用 storage phosphor screen
（Molecular Dyamics）收集放射線訊號，以及用 Typhoon Trio Variable Mode Imager（GE Healthcare）掃描此 storage phosphor screen，再用 ImageQuant 軟體分 析實驗結果。
2.11 切割 DNA 活性分析
將純化出的 gTopoII 和突變 gTopoII 蛋白在反應 Buffer 中(10mM Tris-HCl pH 7.5，100mM KCl，5mM MgCl2，30g)與 300ng pUC119 supercoil DNA 在 37°C 反應30 分鐘，加入 Stop buffer(0.5% SDS, 10mM EDTA)和蛋白酶(Proteinase K) 400ug/ul 在 37°C 反應 30 分鐘以停止酵素反應。之後利用膠體電泳分析實驗結 果，將反應在物放入不含Ethidium bromide (EtBr)的瓊指膠體內，以 20V 跑膠 16 小時後，做膠體外染EtBr(0.125ul/ml)5 分鐘，之後以清水退染 2 次 5 分鐘，即可 利用螢光影像分析。
2.12 水解 ATP 活性分析
ATPase 活性分析是利用自己純化的 gTopoII 加上丙酮酸激脢(Pyruvate kinase;
PK)/ 乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase; LDH)，偵測煙醯胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)在 O.D.340 下吸光值的改變。將所純
化出的蛋白加入24 ng 在反應 Buffer 中(0.4mM NADH，2mM 磷酸烯醇丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate;PEP)，3mM 三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate;ATP))與 PK/LDH(1U/1.5U)(以上均為 Sigma)在 37°C 做反應，每 50 秒偵測一次 O.D.340 吸光值，總共反應進行15 分鐘，將收集到數據帶入公式:
–(△O.D.340/△time)/cuvet pathlength in cm/6.22mM-1 (6.22 = NADH 在波長 340 時的消光係數) 帶入公式後所得到數據即為ATP 分解速率。
第三章 實驗結果 3.1 梨形鞭毛蟲gtopoII基因序列及胺基酸序列分析
拓樸異構酶是一種廣泛存在於各種生物之中的蛋白質，先前已經有研究發現 梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶，並對序列做分析，分類為拓樸異構酶-II。在梨形鞭毛 蟲基因組資料庫(http://www.giardiadb.org/giardiadb/)中open reading frame 編號為 16975。全長4476個核苷酸，1491個胺基酸，分子量大約為164.01kDa。我將梨形 鞭毛蟲拓樸異構酶-II(gtopoII)序列與人類拓樸異構酶-IIα與IIβ型序列比對(圖一 A)。根據Pfam程式預測發現人類拓樸異構酶-IIα第79到222個胺基酸、人類拓樸 異構酶-IIβ第96到238個胺基酸和梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II第52到201個胺基酸 為具有ATPase活性區域。另外有研究指出拓樸異構酶的ATPase活性區域存在著一 個G-loop motif負責與ATP結合，保留序列為5’-GXXGXGXX-3’(HE et al., 2005)。
我 們 發 現 在 梨 形 鞭 毛 蟲 拓 樸 異 構 酶-II 也 有 此 保 留 區 域 ， 胺 基 酸 序 列 第 140-GRNGYGAK-147，而在人類的IIα型和IIβ型也有此保留序列的存在(IIα -161~168、IIβ-177~184)(圖一 A)。在序列中段部分也發現了人類拓樸異構酶-II α、IIβ和梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II具有切割DNA的活性區域，Pfam分析歸類為 DNA gyrase/拓樸異構酶-IV subunit A，Gyrase subunit A和拓樸異構酶-IV的ParC 為同源性蛋白，都有切割DNA的活性(Pommier et al., 2010)，分別為人類拓樸異 構 酶-II α 、 II β 胺 基 酸 第 713~1171 、 729~1184 和 梨 形 鞭 毛 蟲 的 755~997 與 1057~1322(圖一 A)。另外分別在人類拓樸異構酶-IIα第805胺基酸以及IIβ第821 胺基酸和梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II第847胺基酸都存在著負責打斷DNA磷酸雙 酯鍵的酪胺酸(圖一 A) (Corbett et al., 2004)。
利用Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)程式分析梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II胺基 酸序列，發現存在一個DNA gyrase B domain於胺基酸序列N端及兩個DNA topoIV
domain 於胺基酸序列C端(圖一 B)，下方為之後實驗所用的突變gTopoII蛋白示 意圖，包括將全長蛋白分成兩段的gTopoII-N(胺基酸1~488)以及gTopoII-C(胺基酸 489~1491)和gTopoII-C的突變蛋白，gTopoII-Cm1(胺基酸489~1491，並在第847 的位置上將Tyr圖變為His)、gTopoII-Cm2(胺基酸489~1338)、gTopoII-Cm3(胺基酸 489~857)。DNA gyrase和DNA topoIV在拓樸異構酶分類中都是屬於第二型的拓樸 異構酶，存在於原核生物中(Bergerat et al., 1997)。有研究指出真核生物拓樸異構 酶-II的N端蛋白演化自原核生物gyrase subunit B，具有ATPase活性(Pommier et al., 2010)。真核生物拓樸異構酶-II的中段位置演化自原核生物gyrase subunit A，
gyrase subunit A與topoisomerase IV ParC subunit是具有同源性的蛋白，具有切割 DNA的活性(Pommier et al., 2010)。依據演化關係和Pfam程式預測出的三個區 域，我們將蛋白分為N端(胺基酸第1~488)和C端(胺基酸第489~1491)，我們認為 梨形鞭毛蟲N端蛋白可能是具有ATPase活性的區域，C端蛋白是可能具有切割 DNA活性的區域。
3.2 以RT-PCR及luciferase偵測滋養體時期和囊體時期gtopoII基因的mRNA表 現量與啟動子活性
首先，為了瞭解內生性gtopoII基因在梨形鞭毛蟲當中的兩個時期的表現差 異 ，我們分別從滋養體和進行囊體化培養24小時的wild-type梨形鞭毛蟲萃取出 RNA，並進行RT-PCR，發現gtopoII基因在24小時囊體化後，mRNA的表現量高 於滋養體時期的表現(圖二 A)，表示gtopoII基因在囊體化時的表現會上升。另外 為了更加確定gtopoII基因會在囊體化時期提高表現量，我們更進一步去測試啟動 子活性在滋養體和囊體化時的差異。首先我們先將gtopoII基因5’端上游300個核 苷酸序列接入一個帶有螢火蟲螢光酶基因(firefly luciferase)的質體，將gtopoII基 因5’端上游300個核苷酸序列當作螢光酶基因的啟動子(圖二 B)，來啟動螢光酶
基因的表現。該質體上帶有嘌呤黴素(puromycin)抗藥基因，我們將質體送入梨形 鞭毛蟲中，用嘌呤黴素做篩選，培養出帶有質體的梨形鞭毛蟲，接著做滋養體和 進行囊體化培養24小時梨形鞭毛蟲的螢光酶活性測試。依照螢光酶分解受質而發 出冷光，冷光儀測得數據將滋養體定為螢光酶活性定為100%，發現進行囊體化 24小時的gtopoII基因啟動子活性約為滋養體的2.53倍(圖二 C)，表示在囊體化時 期，gtopoII基因確實會因為啟動子活性增加而增加gtopoII基因的表現。
3.3 梨形鞭毛蟲gtopoII基因的表現
為了瞭解gTopoII在梨形鞭毛蟲中表現的位置，將gtopoII基因接入可以在梨 形鞭毛蟲中穩定表現的質體(圖三 A)，gtopoII基因以自身的啟動子(包含在5’端啟 動子上游300bp的序列)來啟動gtopoII基因，並在gtopoII C端接有HA-tag，該質體 帶有嘌呤黴素抗藥基因做為篩選基因。以免疫螢光染色法可以偵測到gTopoII不 論在滋養體時期或者是囊體化時期表現在位置皆在細胞核內(圖三 B)。利用 anti-HA抗體，以西方點墨法分析gTopoII表現的情形，可以發現在囊體化時期 gTopoII的表現量有上升的情況(圖三 C)。Anti-Ran和下方Coomassie blue stain為 loading control。
3.4 梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N端、C端切割雙股DNA活性分析
我們將gTopoII胺基酸序列用Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)程式分析，
找到了一個屬於DNA gyrase B和兩個屬於拓樸異構酶-IV的區域，各別代表了具 有ATPase活性的區域和可以切割DNA與DNA形成酵素-DNA複合物、拓樸異構酶 與DNA結合的區域。因此我們將這兩種不同活性區域分開做活性測試，並且也 和全長的拓樸異構酶做活性的比較。分別將全長4473個核苷酸、N端1464個核苷 酸和C端3012個核苷酸接到表現載體pET-101/D-TOPO，轉型到Escherichia coli BL21表現蛋白，將三種蛋白質純化出來。首先先測試gTopoII蛋白切割DNA的活
性，結果顯示將gTopoII蛋白與plasmid反應會將環狀DNA切割成線性DNA(圖 四)，如果將反應buffer內的鎂離子移除發現切割plasmid的活性明顯降低，如果以 正 常 含 有 鎂 離 子 的 反 應Buffer 在 外 加 高 於 鎂 離 子 濃 度 的 Ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)也會出現切割DNA活性下降的情況，因此可以知道gTopoII 要切割DNA是需要鎂離子輔助的(圖四)。之後把gTopoII、gTopoII-N、gTopoII-C- 三種蛋白與plasmid加入同一反應，發現gTopoII-C也會出現和gTopoII一樣有切割 DNA的活性，gTopoII-N則無此活性(圖五A)。接下來就分別將gTopoII-N、
gTopoII-C進一步做切割DNA的活性測試，發現C端蛋白會因蛋白濃度的上升而使 原本呈現超螺旋結構的plasmid出線型成線型結構的DNA(圖五 C)，顯示C端蛋白 將呈超螺旋結構的plasmid切割而形成斷裂的線型DNA。而N端蛋白卻沒有出現此 活性(圖五 B)，再次證明N端蛋白並無切割DNA的活性存在。
3.5 梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N端、C端ATPase活性分析
因為Pfam程式預測在gTopoII上具有gyrase B區域，表示可能存在具有分解 ATP的活性區域存在，於是我們純化出gTopoII和他的突變蛋白gTopoII-N和 gTopoII-C，其中gTopoII-N包括了gyrase B區域，將這三種蛋白進行分解ATP活性 分析，結果以Lineweaver–Burk plot雙倒數作圖表示，顯示gTopoII的Km值等於 0.21mM，最大分解速率為53.2 nM/sec。而在加入DNA一起進行反應會進一步發 現gTopoII的Km值等於0.13mM，最大分解速率為107.5 nM/sec，顯示在加入DNA 之後gTopoII與ATP的親和性有上升的情況，分解ATP的速率也一樣有上升情形 (圖六)。之後也將gTopoII-N和gTopoII-C進行分解ATP的活性分析，結果顯示，
gTopoII-N的分解速率大約為60nM/sec，但在反應中加入DNA並沒有出現分解速 率上升的情況，而gTopoII-C的ATP分解活性與gTopoII、gTopoII-N比較起來則是 相對的非常低(圖七)。
3.6 梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N端、C端結合雙股DNA活性分析
因為先前研究指出gTopoII-C具有切割DNA和結合DNA的能力，我們也將 gTopoII 和突變蛋白gTopoII-N和gTopoII-C進行電泳位移實驗 (Electrophoretic Mobility Shift Assay , EMSA)，驗證有gTopoII-C存在的區域是否有結合DNA的能 力，根據先前研究報告發現與拓樸異構酶-II高親和力的序列片段做為探針 (Andersen et al., 1989)，我們將探針TOP2 BS (TopoII binding site) 以γ-32p標定，
加入gTopoII、gTopoII-N、gTopoII-C，結果顯示gTopoII與gTopoII-C都有bound form，表現這兩個蛋白都有結合DNA能力，gTopoII-N則沒有(圖八)。之後我們將 以gTopoII-C做更進一步的分析，首先在EMSA實驗中加入抗體anti-V5，anti-V5 可以辨認pET-101/D-TOPO所純化出的蛋白，純化出來的蛋白質C端帶有V5標 籤。加入抗體anti-V5做supershift assay，結果顯示加入抗體anti-V5可以使bound form位移，表示gTopoII-C會結合DNA序列(圖九)。
3.7 利用不同基因的啟動子序列鑑定gTopoII-C端蛋白與DNA結合能力
先前已經確認梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II C端可以與探針TOP2 BS結合，但除 了已知的結合序列TOP2 BS之外，我們還想知道梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II是否會 結合其他序列，由於梨形鞭毛蟲大部分基因的啟動子都和ATG距離很近之故，因 此我們加入cyst wall protein 1 (cwp1)基因轉譯起始位置ATG上游中-45/-1區域 (cwp1-45/-1) 以 γ -32p 標 定 做 為 探 針 ， 結 果 顯 示 ， gTopoII-C 端 蛋 白 可 以 和 cwp1-45/-1形成bound form，且結合強度相較於TOP2 BS差不多(圖十 A)，表示 gTopoII-C端蛋白可以和已知的topoisomeraseII高親和性序列TOP2 BS結合以外，
也可以和cwp1的啟動子做結合。為了更加確定這個結果，於是我們將未標定放射 線的TOP2 BS，cwp1-45/-1當作是競爭物質，與標定γ-32p的TPO2 BS做競爭，
另外再加上18S-30/-1，18S-60/-31兩段比較GC-rich的序列也當做競爭物，做電泳 位移實驗。結果顯示，當以TOP2 BS，cwp1-45/-1當作是競爭物質時，可以觀察
到原本的bound form明顯減弱，表示TOP2 BS，cwp1-45/-1兩段序列確實都會與 gTopoII-C端蛋白做結合(圖十 B)，另外18S-30/-1，18S-60/-31兩段競爭物則無明 顯競爭效果，也因為這兩段序列為GC-rich序列，因此讓我們推測是否梨形鞭毛 蟲拓樸異構酶不偏好於結合GC-rich序列。為了證實這樣的假設，因此我們利用 了cwp 1，cwp 2，cwp 3，ran，myb基因的啟動子當作競爭物，每個基因的啟動 子序列都分成一段以上的序列做為競爭物，也加入了AT-rich序列，poA，poA-T1，
poA-T2，poA-TC，當做競爭物，做電泳位移實驗。結果顯示，當競爭物為 cwp1-45/-1，cwp2-30/+8，cwp3-30/+10，ran-51/-20，myba-30/-1，myba-60/-31時，
bound form強度有明顯減弱(圖十 C)，分析以上序列發現這一些序列有共同特 徵 ， cwp1-45/-1 中 有 一 段 AAATAAAATAT 序 列 ， cwp2-30/+8 中 有 一 段 AAAATAAAAT序列，cwp3-30/+10中有一段AAAAAATAA，ran-51/-20中有一段 TAAAATAAATTAAAT 和 AAATTAAAA ， myba-30/-1 中 有 一 段 TAAAATAATAATTA，myba-60/-31中有一段TATTTTTT，以上這些序列都有出現 一小段連續AT的序列，且AT-rich序列，poA，poA-T1，poA-T2，poA-TC也出現 bound form強度減弱現象(圖十 C)，因此可以推論梨形鞭毛蟲拓樸異構酶偏好結 合於AT-rich的序列。另外再以Distamycin A做為競爭物，利用Distamycin A會結合 在雙股DNA的minor groove AT-rich 序列的特性和gTopoII-C端蛋白做競爭，結果 顯示當Distamycin A的濃度上升，bound form強度出現減弱現象，也再次證實了 因為Distamycin A偏好結合在DNA的minor groove AT-rich的位置，而競爭掉了 gTopoII-C偏好的結合位置，(圖十一)但是並沒有完全的將bound form競爭掉，因 為gTopoII也可能會結合不在minor groove上的AT-rich位置。
3.8 抗腫瘤藥物etoposide抑制梨形鞭毛蟲生長
先前研究已經知道etoposide抑制拓樸異構酶-II的作用機制為抑制受到切割 的DNA再復原，呈現酵素與斷裂DNA的複合物，而斷裂的DNA對細胞來說會造
成極大損傷甚至死亡。因此我們想知道利用etoposide來抑制拓樸異構酶-II是否會 對梨形鞭毛蟲的生長造成影響。首先我們先測試各種不同etoposide濃度觀察加藥 24小時後滋養體梨形鞭毛蟲生長情形，再利用血球計數器計算細胞數量。我們以 對照組的細胞數設定為100%，發現當etoposide濃度為200μM時，與對照組相比大 約只剩下85%的細胞數，而當濃度為400μM時與對照組相比會有明顯差異，大約 只剩下54%的細胞數(圖十二 A)，因此我們得知，當etoposide濃度為400μM時可 以對梨形鞭毛蟲的生長有抑制或是殺死細胞的效果。因為得知當etoposide濃度為 400μM可以明顯減少梨形鞭毛蟲的數量，於是我們另外以etoposide濃度為400μM 去收不同時間點滋養體梨形鞭毛蟲的細胞數，每三個小時收一次細胞，做加藥與 對照組48小時的生長曲線。結果顯示加藥的梨形鞭毛蟲生長曲線與對照組相比趨 於平緩(圖十二 B)，結果表示梨形鞭毛蟲是會受到etoposide的抑制而生長緩慢。
而48小時過後因為對照組細胞生長過盛開始出現死亡情形，所以細胞數在48小時 時間點降了下來。另外我們以不同的細胞數量做etoposide抑制細胞生長的分析。
分別以兩種不同細胞數，每毫升3.125x105和1.25x106細胞數做加藥處理，24小時 後計數滋養體細胞數目。因為在先前實驗已經觀察到細胞生長曲線是趨於平緩 (圖十二 B)，推測是etoposide可以抑制細胞生長，所以利用不同細胞數做加藥處 理，目的為希望24小時後可以長滿8ml的細胞量為最低限度(3.125x105 cells/ml)，
與正常繼代細胞方式做比較(1.25x106 cells/ml)，可以看到更明顯的細胞數量差 異。結果顯示，和對照組做比較，以每毫升3.125x105細胞數在加藥處理24小時後，
細胞數大約只有對照組的30%(圖十三)。與每毫升1.25x106細胞數相比，實驗組大 約只有對照組58%(圖十三)，兩組實驗都可以觀察到經過etoposide處理過後的梨 形鞭毛蟲生長情形確實都出現受到抑制的情況，而且以較少的細胞數量進行分析 可以有更明顯的效果。
3.9 抗腫瘤藥物etoposide抑制滋養體時期梨形鞭毛蟲Cwp1表現
我們將1.25x106 cells/ml滋養體時期的梨形鞭毛蟲以etoposide處理24小時 後，先進行滋養體中形成囊體的細胞計數，在經過etoposide處理的細胞形成囊體 的數目與對照組相比發現大約只有其30%，表示囊體化的情形受到了抑制(圖十 四A左)。圖十四A右為實際滋養體細胞量與囊體的比例。
步去萃取其RNA和蛋白質做分析，從RT-PCR來看，可以看到囊體化的標記 蛋白有明顯下降的趨勢，包括cwp1、cwp2、cwp3，gtopoII自己本身也有下降的 情形，myb也有下降的情形(圖十四B)。以anti-CWP1抗體做西方點墨法分析蛋白 質表現情形，發現經過etoposide處理後的梨形鞭毛蟲Cwp1的表現量會降低，因 為Cwp1為囊體化時期會大量表現的基因，因此可以推測etoposide這個藥物可能 會抑制梨形鞭毛蟲進行囊體化(圖十四C)。anti-Ran和Coomassie blue染色做為 loading control。
3.10 抗腫瘤藥物etoposide抑制梨形鞭毛蟲形成囊體
從上一個實驗我們發現etopodide可能會降低Cwp1的表現，所以我們想知道 etoposide是否可以對梨形鞭毛蟲囊體化的形成造成影響，因為在囊體化的過程當 中會進行一次的細胞核複製，從兩顆細胞核變為四顆細胞核。為了了解拓樸異構 酶受到抑制是否也會使梨形鞭毛蟲無法進行囊體化，我們將2x107梨形鞭毛蟲進 行囊體化並且加入400μM的etoposide，24小時候收細胞，利用血球計數器來觀察 形成囊體的數目。首先收24小時的細胞，將其中的滋養體利用加入清水破壞，只 留下不會被清水脹破的囊體。我們將對照組的細胞數設定為100%，結果顯示當 進行囊體化並加藥24小時的細胞形成囊體的數目只有對照組的45%(圖十五A)，
表示在梨形鞭毛蟲進行囊體化的過程中，確實會因為拓樸異構酶受到抑制進而影 響到囊體的形成。另外我們也利用RT-PCR和西方點墨法分析，我們從RT-PCR中 發現經過etoposide處理的梨形鞭毛蟲，除了囊體化代表性基因cwp1、cwp2、cwp3
有下降情況外，發現gTopoII本身有會有表現量下降的情形(圖十五B)。也可以從 西方點墨法中觀察到囊體化時期Cwp1蛋白也有下降情形(圖十五C)，因此可以證 明etoposide會抑制梨形鞭毛蟲進行囊體化。anti-Ran和Coomassie blue染色做為 loading control。
從以上實驗得知etoposide可能會影響到梨形鞭毛蟲的生長以及囊體化，因此 我們想要進一步知道是否etoposide抑制了gTopoII的一些活性。我們進行了分解 ATP活性分析和做切割DNA的實驗，觀察在反應中加入etoposide是否會影響蛋白 的活性。在ATPase活性分析實驗中，不論etoposide濃度低到高(100uM~800uM) 都不會影響其分解ATP的活性(未附圖)，而在切割DNA實驗中發現，當反應中加 入1mM etoposide時，不論是gTopoII，gTopoII-C和gTopoII-Cm2切割DNA的能力 會有受到抑制的情形(圖十六)。
3.11 鑑定突變gTopoII的表現以及切割和結合DNA的能力
先前研究指出所有的拓樸異構酶都有一個負責打斷雙股DNA的酪胺酸存 在，在與人類的拓樸異構酶比對序列之後，我們在梨形鞭毛蟲的第847個胺基酸 也找到了與人類拓樸異構酶相對應的酪胺酸，於是我們也想知道將此酪胺酸作突 變是否也會使梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II的切割活性消失。首先我們建構一個在 gtopoII基因序列第2539的Thymidine突變為Cytosine，轉譯後胺基酸從酪胺酸
(Tyrosine)突變為組胺酸(Histidine)，將此pPgTopoIIm1載體轉染至梨形鞭毛蟲內以 免疫螢光染色法觀察表現。結果顯示，在梨形鞭毛蟲細胞中表現的gTopoIIm1蛋 白是表現在細胞質當中(圖十七)。另外針對具有結合和切割DNA活性的cleavage domain部分，我們也分別做了一個刪除cleavage domain之後第1339到1491個胺基 酸的突變(pPgTopoIIm2)，和另一個刪除大部分cleavage domain，第858到1491個 胺基酸的突變(pPgTopoIIm3)。也將這兩個突變質體轉染到梨形鞭毛蟲內以免疫 螢 光 染 色 法 觀 察 表 現 。 結 果 顯 示 在 梨 形 鞭 毛 蟲 細 胞 中 表 現 的gTopoIIm2 和
gTopoIIm3蛋白是表現在細胞質當中(圖十八、十九)。之後我們也想知道經過突 變的gTopoII-C端蛋白是否他們的切割dsDNA活性和結合DNA能力也會受到影 響，因此我們將純化出來的gTopoII-C端以及突變C端蛋白做切割DNA活性分析，
將蛋白和超螺旋結構的DNA在37°C反應半小時後，利用電泳分析，可以觀察到 除了為突變的gTopoII-C端蛋白有活性之外，gTopoII-Cm2也具有切割DNA的能 力，而gTopoII-Cm1和gTopoII-Cm3相較之下就明顯沒有線性DNA的形成(圖二 十) ，比較沒有切割DNA的能力。另外我們也利用γ-32p標定TOP2 BS當作探針 將純化出來的gTopoII-C端以及突變C端蛋白做電泳位移實驗，測試經過突變的 gTopoII-C 端 蛋 白 與 DNA 結 合 能 力 是 否 會 受 到 影 響 。 結 果 顯 示 點 突 變 的 gTopoII-Cm1 和 gTopoII-Cm2 還 有 bound form 的 出 現 ， 表 示 gTopoII-Cm1 及 gTopoII-Cm2還具有結合DNA的能力，gTopoII-Cm3則減少與DNA結合能力(圖二 十一)。
3.12 分析gTopoII以及gTopoII突變蛋白對於囊體化相關基因的調控和囊體形成 的影響
從WB clone C6中發現gtopoII是一個會在囊體化時期表現量會上升的基因 (圖二A)，並且也在拓樸異構酶-II抑制藥物etoposide處理梨形鞭毛蟲的實驗中發 現梨形鞭毛蟲形成囊體的能力會受到影響(圖十五A)，也從西方點墨法中觀察到 etoposide處理過後Cwp1的表現量確實有下降情形(圖十五C)，因此我們想要更進 一步瞭解gTopoII與梨形鞭毛蟲進行囊體化之間的關聯，因此我們轉染了帶有 gtopoII 以及 gtopoII 基因突變質體到梨形鞭毛蟲中，並先用 anti-HA 偵 測 帶 有
HA-tag的各種蛋白是否可以在梨形鞭毛蟲中成功表現。利用西方點墨法分析滋養 體時期和囊體化時期的表現，不帶有HA-tag蛋白的pP5’pac5n沒有偵測到任何訊 號，表現量最高的為pPgTopoIIWT，可以觀察到在164KDa處有大量的表現，
pPgTopoIIm2表現量次之，在147KDa處可以觀察到其表現量，pPgTopoIIm1和
pPgTopoIIm3 表 現 量 都 遠 低 於 pPgTopoIIWT 和 pPgTopoIIm2 ， pPgTopoIIm1 在 164KDa處有小量表現，表現量略高於pPgTopoIIm3，pPgTopoIIm3表現量最低，
在95KDa處可以觀察到其表現量。(圖二十二C、二十三C)。我們接下來再利用 anti-Cwp1觀察各細胞株的表現，結果顯示Cwp1的表現量以pPgTopoIIWT最高，
pPgTopoIIm2次之，pPgTopoIIm1和pPgTopoIIm3表現量較少，pPgTopoIIm1略高 於pPgTopoIIm3，pP5’pac5n表現量最低(圖二十二C、二十三C)。對照到囊體的形 成能力方面，我們利用細胞計數來分析形成囊體的數目，不論在滋養體時期和囊 體化時期都發現形成囊體的能力以pPgTopoIIWT細胞株為最高，pPgTopoIIm2次 之，pPgTopoIIm1略高於pPgTopoIIm3，pPgTopoIIm3表現量最低(圖二十二A、二 十三A)。RNA表現方面，囊體化時大量表現基因例如cwp1、cwp2、myb2也有相 同的趨勢(圖二十二B、二十三B)。
第四章 討論
4.1 梨形鞭毛蟲 TopoII 蛋白功能區域分析
將 gTopoII 與人類 TopoII 比較，特別的地方是梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-IV 區域被分為兩個區塊(圖一 A)。比對序列的相似度，梨形鞭毛蟲與人類拓樸異構 酶-IIα、IIβ的全長胺基酸序列相似程度分別為 41.52%和 38.94%，相同序列比 例分別為28.05%和 27.18%。如果只以 Pfam 程式預測的拓樸異構酶-IV 區域做相 似程度分析，梨形鞭毛蟲與人類拓樸異構酶-IIα、IIβ的胺基酸序列相似程度個 別為44.89 分%和 44.72%，相同序列比例分別為 30.11%和 29.93%，第 998~1056 個胺基酸不被Pfam 程式認為屬於拓樸異構酶-IV 區域，如果單獨將第 998~1056 個胺基酸與人類拓樸異構酶-IIα、IIβ做序列比對時在拓樸異構酶-IV 區域多出 來的一段序列做相似度比較，發現分別只有23.29%和 13.70%的相同程度，13.70%
和 2.74%相似度，可能是此段梨形鞭毛蟲失去了一段長 10 個核苷酸序列且其它 序列相似度太低(圖一 A 和 B)，導致 Pfam 程式分析將此拓樸異構酶-IV 區域區 分為兩段。
另外在 Pfam 程式預測不論在人類的拓樸異構酶-II 或是其他的原蟲拓樸異構 酶-II 例如，阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica)、陰道滴蟲(Trichomonas vaginalis)、
利什曼原蟲(Leishmania donovani)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum) 和錐蟲 (Trypanosoma cruzi)的拓樸異構酶-II 都存在一個顯著的 ATPase 區域(結果未顯 示)。Pfam 程式分析中發現梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 的 N 端部分並未有顯著的 ATPase 活性區域存在(圖一 B)，推測可能會影響到梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 的 酵素作用的活性，但如果將梨形鞭毛蟲相對於其他物種ATPase 活性區域的序列 (胺基酸第 52 到 201)單獨立用 Pfam 分析，又可以得到這一段序列為具有 ATPase 活性的一段蛋白，因此 gTopoII 的 ATPase 活性這一部分在經過活性分析之後，
我們有測得 gTopoII 是具有 ATPase 活性，且當有 DNA 存在反應中時，ATPase 的活性大約會上升兩倍，但這種情形只出現在全長的 gTopoII 中，同樣具有 ATPase 活性的 gTopoII-N 則沒有這種現象(圖七)。相同的情形也出現在 T.Sengupta 2005 的研究中，研究指出 Leishmania topoisomeraseII 在有 DNA 的情況下分解 ATP 的平均速率也會上升的情況。
然而因為 Pfam 是將具有 ATPase 活性的區域預測為 gyrase 蛋白的區域，為 了瞭解gTopoII 是否是具有 gyrase 的特性或是是屬於 topoisomerase II，所以我們 利用抑制gyrase ATPase 活性的抑制藥物，Coumermycin A1 (Maxwell 1997)，去 觀察此藥物是否會對gTopoII 分解 ATP 的活性有所影響，實驗結果顯示當我們以 不同的 Coumermycin A1 的濃度去做 ATPase 活性分析實驗，各別為 0M、
100M、200M、400M，在這些不同藥物濃度實驗中與對照組相比，皆沒有任 何差異(未附圖)，表示 Coumermycin A1 並沒有抑制 gTopoII 的作用，gTopoII 的 ATPase 活性與 gyrase 蛋白的特性可能不同。
4.2 gTopoII 具有與鎂離子結合區域
先前已經有研究指出 TopoII 必須在有鎂離子存在的環境下才具有活性 (Deweese et al., 2008)，並且已經知道與鎂離子作用的胺基酸殘基，分別是在人類 的topoisomerase IIα胺基酸 E461、D541、D543、D545 或是人類的 topoisomerase IIβ胺基酸 E477、D557、D559、D561(Deweese et al., 2009)，我們去比對梨形鞭 毛蟲與這些胺基酸的相對位置，分別在 gTopoII 胺基酸 E513、D595、D597、
D599(圖一 A)，這四個與鎂離子作用的四個胺基酸在 gTopoII 中也都是存在著。
在gTopoII 切割 dsDNA 的實驗中觀察到當反應中不存在鎂離子時，gTopoII 就不 會將環狀DNA 切割成線性的 DNA(圖四)，表示 gTopoII 的活性確實也是需要鎂 離子來當作輔因子。
4.3 gTopoII 偏好與 AT-rich 序列做結合
在發現了gTopoII會與真核生物TopoII偏好結合序列(TOP2 BS)以外序列結合 之後，我們推測是否gTopoII會有偏好的序列做結合，所以我們將一些不同的序 列當作探針，結果發現在不同序列當中確實gTopoII會和他們做結合，並且有結 合強弱程度之分，我們發現了在一些結合程度較強的序列當中，都明顯存在著一 段AT-rich的序列，且在不同基因的啟動子上的AT-rich部分都有發現這個結果(圖 十 C)，之後有在利用會結合在AT-rich序列上的化合物Distamycin A來當做競爭 物，與gTopoII做競爭，結果也出現了抑制gTopoII結合序列的效果(圖十一)。所以 推論gTopoII似乎有偏好結合在AT-rich的序列上。另外有研究指出拓樸異構酶可 能會調節基因的表現(Durand-Dubief et al., 2010)，且也發現TopoII失活將會降低 rRNA的量，進一步去影響到mRNA的合成(Schultz et al, 1992, Collins et al, 2001).。我們所使用的探針大部分都是與囊體化有關的基因，所以有存在著一種 可能性，就是gTopoII其實是會結合在這一些序列上去調節這些與囊體化有關基 因的表現，這一部分有待更深一步的研究。
4.4 Etoposide對梨形鞭毛蟲的生長和分化的影響
在滋養體時期的梨形鞭毛蟲經過etoposide處理24小時候過後，我們可以看到 細胞數目與對照組相比確實是有差異(圖十四 A)，顯示是生長分裂受到了影響，
但etoposide的作用機制是造成細胞DNA斷裂，是有殺死細胞的作用，但是在做不 同時間點數細胞數的實驗中發現生長曲現是趨於平緩，沒有出現下降的情形(圖 十二)，推論原因可能是因為在試管裡面的所有細胞並沒有百分之百每一隻都被 藥物殺死，而梨型鞭毛蟲的生長分裂速度又太快，以致於看不出細胞數目有下降 的情況。
在梨形鞭毛蟲形成囊體化的能力上我們觀察到在經過etoposide處理過後，形 成的囊體數目與對照組比較只有其百分之四十(圖十五 A)，但是因為etoposide也
可以抑制生長，所以也存在一種可能性是因為在囊體化時有些細胞還是在持續分 裂生長，所以會有比較多的細胞數目可以形成囊體，而讓結果看起來是因為囊體 化受到了抑制，所以我們從RNA和蛋白質表現來看囊體化相關基因的表現情況。
結果顯示在cwp1、cwp2、cwp3、myb的RNA表現都下降的情形，蛋白質表現方面，
Cwp1也是有表現量降低，所以可以證實囊體化的能是確實是有受到影響。
4.5 gTopoII促進梨形鞭毛蟲行囊體化
有研究指出在細胞中細胞週期在S phase晚期topoisomeraseIIα開始大量表 現，當到達G2/M時期表現到達最高峰(Woessner et al., 1991)，而梨形鞭毛蟲在囊 體時期細胞週期是停留在G2的時期(Bernander et al., 2001)，我們也發現gtopoII在 囊體時期會大量表現(圖二和三)。另外，我們從過度表現gtopoII的細胞株發現細 胞會比較傾向形成囊體(圖二十二 A、圖二十三 A)，顯示gtopoII在梨形鞭毛蟲囊 體化過程中扮演一個重要的角色。
4.5 myb基因與gtopoII基因的表現之互相調控關係
野生型梨形鞭毛蟲經過etoposide處理後，gtopoII和myb的RNA表現都有下降的情 形(圖十四 B、圖十五 B)，顯示etoposide會影響他們的表現，但etoposide的作用 機制是以gTopoII蛋白質為目標，所以我們推論gtopoII的RNA表現量受到影響是 因為myb基因表現受到抑制進而影響到gtopoII的表現，因為有其他研究指出Myb 可以影響topoII的啟動子活性(Brandt et al., 1997、Singh et al., 2008)，而我們也在 gtopoII的啟動子上有找到梨形鞭毛蟲Myb蛋白的結合位置，所以認為gTopoII表現 量下降是因為Myb的表現降低緣故。myb的表現也受到etoposide的影響下降，而 且過度表現gtopoII的細胞株發現myb的表現也會有上升的情況，所以也存在著一 個可能性，就是myb也是會受到gtopoII的調控，表示兩個基因之間是一種互相調 控的角色存在，因為myb也是一個會在囊體化時期大量表現的基因，以來調控其
它下游其它與囊體化有關的基因，如果gtopoII在囊體化時期確實是扮演一個關鍵 角色，或許也是可能與myb基因之間有密切關係。
附圖
A.
