第四章 討論
4.5 gTopoII促進梨形鞭毛蟲行囊體化
有研究指出在細胞中細胞週期在S phase晚期topoisomeraseIIα開始大量表 現，當到達G2/M時期表現到達最高峰(Woessner et al., 1991)，而梨形鞭毛蟲在囊 體時期細胞週期是停留在G2的時期(Bernander et al., 2001)，我們也發現gtopoII在 囊體時期會大量表現(圖二和三)。另外，我們從過度表現gtopoII的細胞株發現細 胞會比較傾向形成囊體(圖二十二 A、圖二十三 A)，顯示gtopoII在梨形鞭毛蟲囊 體化過程中扮演一個重要的角色。
4.5 myb基因與gtopoII基因的表現之互相調控關係
野生型梨形鞭毛蟲經過etoposide處理後，gtopoII和myb的RNA表現都有下降的情 形(圖十四 B、圖十五 B)，顯示etoposide會影響他們的表現，但etoposide的作用 機制是以gTopoII蛋白質為目標，所以我們推論gtopoII的RNA表現量受到影響是 因為myb基因表現受到抑制進而影響到gtopoII的表現，因為有其他研究指出Myb 可以影響topoII的啟動子活性(Brandt et al., 1997、Singh et al., 2008)，而我們也在 gtopoII的啟動子上有找到梨形鞭毛蟲Myb蛋白的結合位置，所以認為gTopoII表現 量下降是因為Myb的表現降低緣故。myb的表現也受到etoposide的影響下降，而 且過度表現gtopoII的細胞株發現myb的表現也會有上升的情況，所以也存在著一 個可能性，就是myb也是會受到gtopoII的調控，表示兩個基因之間是一種互相調 控的角色存在，因為myb也是一個會在囊體化時期大量表現的基因，以來調控其
它下游其它與囊體化有關的基因，如果gtopoII在囊體化時期確實是扮演一個關鍵 角色，或許也是可能與myb基因之間有密切關係。
附圖
A.
B.
圖一:梨形鞭毛蟲gtopoII基因序列分析
(A) 利用Clustal W將人類拓樸異構酶-IIα和IIβ型與梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II序 列做比對。紅色方框表示ATP與蛋白質結合位置(HE et al., 2005)。利用Pfam 程式分析，深藍色底線表示具有ATPase活性區域，紫色底線表示人類拓樸異 構酶-IIα具有切割DNA活性區域，綠色底線表示人類拓樸異構酶-IIα具有切 割DNA活性區域，橘色表示梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II具有切割DNA活性區 域。紅色星號表示負責打斷DNA的酪胺酸殘基( Corbett et al., 2004)。
(B) 利用Pfam程式(http://pfam.sanger.ac.uk/)分析梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II的胺基 酸序列。綠色表示相似於DNA gyraseB區域(第292~478個胺基酸)，紅色表示 相似於拓樸異構酶-IV區域(第755~997個胺基酸，第1057~1322個胺基酸)。序 列全長1491個胺基酸。下方圖表示為突變蛋白gTopoII-N和gTopoII-C片段蛋白 和gTopoII-C的突變蛋白gTopoII-Cm1、gTopoII-Cm2和gTopoII-Cm3，gTopoII-N
是第1~488個胺基酸，gTopoII-C是489~1491個胺基酸，gTopoII-Cm1是在第847 個胺基酸上做突變(Y847H) ，gTopoII-Cm2是489~1338個胺基酸，gTopoII-Cm3 是489~857。
A.
B.
C.
圖 二 : 以 RT-PCR 及 luciferase活 性 偵 測 滋 養 體 時 期 和 囊 體 時 期 gtopoII基 因 的 mRNA表現量與啟動子活性
(A) 分別從滋養體和囊體化 24 小時培養的 wild-type(WB)梨形鞭毛蟲，萃取出 RNA 進行 RT-PCR，gtopoII、cwp1、ran 以及 ribosomal protein L7(riboL7)的 mRNA 表現量。其中 riboL7 以及 ran 基因表現為 internal control 。
(B) pPgTopoIIPro 質體示意圖，嘌呤黴素抗藥基因(pac)做為篩選細胞株用，以
glutamate dehydrogenase(gdh)做為其啟動子。螢光酶(luc)基因做為報告基因，
由 gtopoII 基因 5’端上游 300 個核苷酸做為其啟動子。
(C) 測試由 gtopoII 基因 5’端上游 300 個核苷酸做為其啟動子所表現出的螢光酶 活性。分別測試滋養體(Tro)時期以及囊體化(Enc)24 小時時期。
A.
B.
C.
圖三.gTopoII 在梨形鞭毛蟲表現分析
(A)pPgTopoIIWT細胞質體示意圖，該質體以glutamate dehydrogenase(gdh)啟動子 調 控 puromycin N-acetyltransferase(pac) 基 因 做 為 篩 選 基 因 ， gtopoII 以 自 己 的 5’flanking region，約300 base pair區域所控制，gtopoII C端接有HA-tag，其 3’flanking region為ran基因，
(B)利用抗HA-tag的抗體偵測帶有HA-tag的gTopoII做免疫螢光染色法分析，顯示 pPgTopoIIWT細胞株中gTopoII的表現位置，DAPI染色的結果作為細胞核的 marker，DIC為細胞立體影像。
(C)使用anti-HA抗體做西方點墨法，分析帶有HA-tag gTopoII蛋白在滋養體和囊體 化時期表現，anti-RAN以及下方Coomassie blue為loading control。
圖四: 鎂離子是gTopoII切割dsDNA所必須
以gTopoII 蛋白和 300 ng pUC119 DNA 作用，分別以反應中沒有 Mg2+ 或是含有 5 mM 的 Mg2+和10 mM EDTA 或是沒有 EDTA 觀察 gTopoII 切割 DNA 能力。紅 色箭頭( )表示線型 DNA，星星符號( * )表示超螺旋結構 DNA。
A.
B.
C.
圖五: gTopoII、gTopoII-N端以及C端切割dsDNA活性分析
以gTopoII、gTopoII-N和gTopoII-C端片段蛋白與300 ng pUC119 DNA作用。NcoI 做為線型DNA的對照組。黑色鍵頭( )表示有缺口的環狀DNA，紅色箭頭( ) 表示線型DNA，星星符號( * )表示超螺旋結構DNA。
(A)將2 ng gTopoII(指164 kDa的band)、100 ng gTopoII-N(指110 kDa的band)和10 ng gTopoII-C( 指 53.7 kDa 的 band) 蛋 白 進 行 切 割 DNA 活 性 分 析 ， 下 方 為 loading control。
(B)分別以0ng、20 ng、60 ng、100 ng、140 ng、180 ng、220 ng gTopoII-N端蛋白 進行切割DNA活性分析。
(C) 分別以0ng、2 ng、6 ng、10 ng、14 ng、18 ng、22 ng gTopoII-C端蛋白進行 切割DNA活性分析。
圖六:測量gTopoII 分解ATP活性
分別以有加入300 ng plasmid DNA(T-vector，3610 bp)(藍色菱形)和不加入plasmid DNA(紅色正方形)兩組實驗，並且加入8 ng gTopoII，測定gTopoII分解ATP的能 力，並且用Lineweaver–Burk plot雙倒數作圖表示Vmax和Km值。
圖七:分析gTopoII、gTopoII-C和gTopoII-N蛋白分解ATP活性是否受到DNA所影 響
分別利用8 ng 全長的gTopoII和兩個突變蛋白80 ng gTopoII-C和800 ng gTopoII-N 分別在相同的ATP濃度下分析加入300 ng plasmid DNA(T-vector，3610 bp)和無 plasmid DNA存在時的分解ATP速率。
圖八:鑑定gTopoII蛋白與DNA結合能力
利用純化出的2.9 ng gTopoII(FL)，29 ng gTopoII-C(C)，290 ng gTopoII-N(N)端蛋 白做電泳位移實驗 (Electrophoretic Mobility Shift Assay , EMSA)，探針TOP2 BS 以γ-32p標定。箭頭表示bound form位置。
圖九:鑑定gTopoII-C端蛋白與DNA結合能力
利用純化出的gTopoII-C端蛋白做電泳位移實驗 (Electrophoretic Mobility Shift Assay , EMSA)，探針TOP2 BS以γ-32p標定，加入純化過的29 ng gTopoII-C端蛋 白作反應(Lane 2)。另外加入0.8 g anti-V5抗體進行supershift assay分析(Lane 3)。
箭頭表示supershift和bound form位置。
A.
B.
C.
圖十: 利用不同基因的啟動子序列鑑定gTopoII-C端蛋白與DNA結合能力
(A) 利用純化出的gTopoII-C端蛋白做電泳位移實驗 (Electrophoretic Mobility Shift Assay , EMSA)，探針TOP2 BS、cwp1-45/-1以γ-32p標定，加入純化過的29 ng gTopoII-C端蛋白作反應。
(B)用高50倍濃度的未標定的探針TOP2 BS，cwp1-45/-1，18S-30/-1，18S-60/-31 做專一性競爭和非專一性競爭與29 ng gTopoII-C端蛋白做電泳位移實驗。
(C) 用 高 250 倍 濃 度 的 未 標 定 的 探 針 cwp1-45/-1 ， cwp1-90/-6 ， cwp2-30/+8 ， cwp2-60/-31，cwp3-30/+10，cwp3-60/-31，rna-51/-20，ran-30/-1，rna-81/-52，
myba-30/-1，myba-60/-31，poA，poA-T1，poA-T2，poA-TC做為競爭物，加入 29 ng gTopoII-C蛋白。紅框框起部分為bound form有明顯受到競爭，附表為競爭 物之序列，紅字加底線序列為具有AT-rich片段。
A.
圖十一: 利用distamycin A和gTopoII-C端蛋白競爭DNA結合位置
利用distamycin A可以結合在DNA minor groove的特性和gTopoII-C端蛋白(29 ng ) 做競爭，做電泳位移實驗。對照組共兩組，”─“代表完全不加distamycin A和 distamycin A溶劑DMSO，”DMSO” 代表加入distamycin A的溶劑，distamycin A 分為四種不同濃度分別為0.02，0.06，0.19，5.00mM。
A.
B.
圖十二: 抗腫瘤藥物etoposide抑制梨形鞭毛蟲生長
Etoposide為一種抗腫瘤藥物，作用機制是抑制拓樸異構酶-II的活性。
(A) 將1.25x106 cells/ml的滋養體細胞分別以0μM、200μM、400μM和600μM不同 etoposide濃度加藥24小時後計算各別滋養體數目。將0μM組其細胞數定為 100%。
(B) 經由圖A得知當etoposide濃度為400μM時梨形鞭毛蟲數量明顯降低。將 1.25x106 cells/ml的滋養體細胞加藥濃度設定為400μM分別加藥0、3、6、9、
12、24、48小時後計算滋養體數目。
圖十三:以不同細胞數觀察經過處理 etoposide 的梨形鞭毛蟲生長情形 分別以 3.125x105 cells/ml 和 1.25x106 cells/ml 的細胞數做加 400μM etoposide(+)和 control(-)觀察 24 小時後每 ml 細胞數量。
A.
B.
C.
圖十四: 抗腫瘤藥物etoposide抑制滋養體時期Cwp1的表現
(A) 將 1.25x106 cells/ml 的 滋 養 體 細 胞 放 入 TYI-S-33 培 養 液 培 養 24 小 時 並 用 400μM etoposide處理，破壞掉梨形鞭毛蟲滋養體後計算囊體數量，對照組(加入 DMSO)囊體數量設定為100%(左圖)。右圖為滋養體形成囊體比例，為培養液內 實際囊體數除以滋養體數目。
(B)從滋養體 wild-type(WB)梨形鞭毛蟲做加藥(400μM etoposide)和未加藥(DMSO) 處理24 小時，萃取出 RNA 進行 RT-PCR，觀察 topoII、cwp1、cwp2、cwp3、myb、
ran、18S ribosomal RNA(18s)以及 ribosomal protein L7(riboL7)的 mRNA 表現量。
其中 ran、18S 以及 riboL7 基因表現為 internal control 。
(C)使用 anti-Cwp1 抗體對滋養體時期的梨形鞭毛蟲做西方點墨法分析，下方 RAN 以及Coomassie blue 染色為 loading control。
A.
B.
C.
圖十五: 抗腫瘤藥物 etoposide抑制梨形鞭毛蟲形成囊體
(A)將2x107的滋養體細胞放入囊體培養液中培養24小時，並做400μM etoposide加 藥處理。在破壞掉梨形鞭毛蟲滋養體後計算囊體數量，對照組(加入DMSO)囊體 數量設定為100%。
(B)將 2x107的滋養體細胞放入囊體培養液中培養24 小時，並做 400μM etoposide 加藥處理，之後萃取出 RNA 進行 RT-PCR，觀察 topoII、cwp1、cwp2、cwp3、
myb、ran、18S ribosomal RNA(18s)以及 ribosomal protein L7(riboL7)的 mRNA 表
現量。其中 ran、18S 以及 riboL7 基因表現為 internal control 。
(C)使用抗 Cwp1 抗體對囊體化時期梨形鞭毛蟲做西方點墨法分析，下方 Ran 以 及Coomassie blue 染色為 loading control。
圖十六:Etoposide 抑制 gTopoII 的切割 dsDNA 活性
利用拓樸異構酶抑制物etoposide(1mM)，對 2.2 ng gTopoII、6 ng gTopoII-C 以及 13.2 ng gTopoII-Cm2 進行抑制作用，再進行切割 pUC119 DNA(300 ng )活性測 試。黑色鍵頭( )表示有缺口的環狀 DNA，紅色箭頭( )表示線型 DNA，星 星符號( * )表示超螺旋結構 DNA，左起第一條 lane 為 control，表示線型 DNA 的 位置。
圖十七:鑑定 gTopoIIm1 在梨形鞭毛蟲內表現位置
以anti-HA 抗體進行免疫螢光染色法鑑定 gTopoIIm1 細胞株蛋白表現位置，可以 觀察到標定綠色螢光的anti-HA 表現在細胞質位置。DAPI 表是細胞核位置。DIC 表示細胞立體影像。下方圖為質體結構示意圖，gtopoIIm1 為將原本為酪胺酸 (Tyrosine)突變為組胺酸(Histidine)。
圖十八: 鑑定 gTopoIIm2 在梨形鞭毛蟲內表現位置
以anti-HA 抗體進行免疫螢光染色法鑑定 gTopoIIm2 細胞株蛋白表現位置，可以 觀察到標定綠色螢光的anti-HA 表現在細胞質位置。DAPI 表是細胞核位置。DIC 表示細胞立體影像。下方圖為質體結構示意圖，gtopoIIm2 為去除第 1339~1491 個胺基酸。
圖十九: 鑑定 gTopoIIm3 在梨形鞭毛蟲內表現位置
以anti-HA 抗體進行免疫螢光染色法鑑定 gTopoIIm3 細胞株蛋白表現位置，可以 觀察到標定綠色螢光的anti-HA 表現在細胞質位置。DAPI 表是細胞核位置。DIC 表示細胞立體影像。下方圖為質體結構示意圖，gtopoIIm3 為去除第 858~1491 個 胺基酸。
圖二十: gTopoII-C端以及突變C端切割dsDNA活性分析
以 5 ng gTopoII-C 端蛋白和 20 ng gTopoII-Cm1， 15 ng gTopoII-Cm2，5 ng gTopoII-Cm3 與 300 ng pUC119 DNA 作用在 37˚C 一小時。NcoI 做為線型 DNA 的對照組。黑色箭頭( )表示有缺口的環狀 DNA，紅色箭頭( )表示線型 DNA，星星符號( * )表示超螺旋結構 DNA。
圖二十一: 鑑定 gTopoII-C 端以及突變 C 端與 DNA 結合能力
分別以29 ng gTopoII-C 端和 116 ng gTopoII-Cm1，81 ng gTopoII-Cm2，29 ng gTopoII-Cm3 做電泳位移實驗，探針 TOP2 BS 以γ-32p 標定，紅色箭頭表示為 bound form 位置。下方為 loading control。
A.
B.
C.
圖二十二:分析轉染 gTopoII 和突變蛋白在滋養體時期對囊體化相關基因影響 (A)將 pP5’Pac5n，pPgTopoII，pPgTopoIIm1，pPgTopoIIm2，pPgTopoIIm3 細胞株 以1.25x106 cells/ml 細胞放入 TYI-S-33 培養液培養 24 小時後算形成囊體的數 量。將pP5’Pac5n 形成囊體數目為基準，與其它細胞株做比較。
(B)分別從轉染 gtopoII 和 gtopoII 突變基因以及不帶有任何基因 pP5’Pac5n 的滋養 體梨形鞭毛蟲中粹取其RNA，利用 RT-PCR 分析 topoII，cwp1，cwp2，myb，riboL7，
ran 的 mRNA 表現，其中 riboL7 以及 ran 基因表現為 internal control 。
ran 的 mRNA 表現，其中 riboL7 以及 ran 基因表現為 internal control 。