梨形鞭毛蟲拓樸異構酶、N 端、C 端結合雙股 DNA 活性分

因為先前研究指出gTopoII-C具有切割DNA和結合DNA的能力，我們也將 gTopoII 和突變蛋白gTopoII-N和gTopoII-C進行電泳位移實驗 (Electrophoretic Mobility Shift Assay , EMSA)，驗證有gTopoII-C存在的區域是否有結合DNA的能 力，根據先前研究報告發現與拓樸異構酶-II高親和力的序列片段做為探針 (Andersen et al., 1989)，我們將探針TOP2 BS (TopoII binding site) 以γ-32p標定，

加入gTopoII、gTopoII-N、gTopoII-C，結果顯示gTopoII與gTopoII-C都有bound form，表現這兩個蛋白都有結合DNA能力，gTopoII-N則沒有(圖八)。之後我們將 以gTopoII-C做更進一步的分析，首先在EMSA實驗中加入抗體anti-V5，anti-V5 可以辨認pET-101/D-TOPO所純化出的蛋白，純化出來的蛋白質C端帶有V5標 籤。加入抗體anti-V5做supershift assay，結果顯示加入抗體anti-V5可以使bound form位移，表示gTopoII-C會結合DNA序列(圖九)。

3.7 利用不同基因的啟動子序列鑑定gTopoII-C端蛋白與DNA結合能力

先前已經確認梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II C端可以與探針TOP2 BS結合，但除 了已知的結合序列TOP2 BS之外，我們還想知道梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II是否會 結合其他序列，由於梨形鞭毛蟲大部分基因的啟動子都和ATG距離很近之故，因 此我們加入cyst wall protein 1 (cwp1)基因轉譯起始位置ATG上游中-45/-1區域 (cwp1-45/-1) 以 γ -32p 標 定 做 為 探 針 ， 結 果 顯 示 ， gTopoII-C 端 蛋 白 可 以 和 cwp1-45/-1形成bound form，且結合強度相較於TOP2 BS差不多(圖十 A)，表示 gTopoII-C端蛋白可以和已知的topoisomeraseII高親和性序列TOP2 BS結合以外，

也可以和cwp1的啟動子做結合。為了更加確定這個結果，於是我們將未標定放射 線的TOP2 BS，cwp1-45/-1當作是競爭物質，與標定γ-32p的TPO2 BS做競爭，

另外再加上18S-30/-1，18S-60/-31兩段比較GC-rich的序列也當做競爭物，做電泳 位移實驗。結果顯示，當以TOP2 BS，cwp1-45/-1當作是競爭物質時，可以觀察

到原本的bound form明顯減弱，表示TOP2 BS，cwp1-45/-1兩段序列確實都會與 gTopoII-C端蛋白做結合(圖十 B)，另外18S-30/-1，18S-60/-31兩段競爭物則無明 顯競爭效果，也因為這兩段序列為GC-rich序列，因此讓我們推測是否梨形鞭毛 蟲拓樸異構酶不偏好於結合GC-rich序列。為了證實這樣的假設，因此我們利用 了cwp 1，cwp 2，cwp 3，ran，myb基因的啟動子當作競爭物，每個基因的啟動 子序列都分成一段以上的序列做為競爭物，也加入了AT-rich序列，poA，poA-T1，

poA-T2，poA-TC，當做競爭物，做電泳位移實驗。結果顯示，當競爭物為 cwp1-45/-1，cwp2-30/+8，cwp3-30/+10，ran-51/-20，myba-30/-1，myba-60/-31時，

bound form強度有明顯減弱(圖十 C)，分析以上序列發現這一些序列有共同特 徵 ， cwp1-45/-1 中 有 一 段 AAATAAAATAT 序 列 ， cwp2-30/+8 中 有 一 段 AAAATAAAAT序列，cwp3-30/+10中有一段AAAAAATAA，ran-51/-20中有一段 TAAAATAAATTAAAT 和 AAATTAAAA ， myba-30/-1 中 有 一 段 TAAAATAATAATTA，myba-60/-31中有一段TATTTTTT，以上這些序列都有出現 一小段連續AT的序列，且AT-rich序列，poA，poA-T1，poA-T2，poA-TC也出現 bound form強度減弱現象(圖十 C)，因此可以推論梨形鞭毛蟲拓樸異構酶偏好結 合於AT-rich的序列。另外再以Distamycin A做為競爭物，利用Distamycin A會結合 在雙股DNA的minor groove AT-rich 序列的特性和gTopoII-C端蛋白做競爭，結果 顯示當Distamycin A的濃度上升，bound form強度出現減弱現象，也再次證實了 因為Distamycin A偏好結合在DNA的minor groove AT-rich的位置，而競爭掉了 gTopoII-C偏好的結合位置，(圖十一)但是並沒有完全的將bound form競爭掉，因 為gTopoII也可能會結合不在minor groove上的AT-rich位置。

3.8 抗腫瘤藥物etoposide抑制梨形鞭毛蟲生長

先前研究已經知道etoposide抑制拓樸異構酶-II的作用機制為抑制受到切割 的DNA再復原，呈現酵素與斷裂DNA的複合物，而斷裂的DNA對細胞來說會造

成極大損傷甚至死亡。因此我們想知道利用etoposide來抑制拓樸異構酶-II是否會

分別以兩種不同細胞數，每毫升3.125x10⁵和1.25x10⁶細胞數做加藥處理，24小時 後計數滋養體細胞數目。因為在先前實驗已經觀察到細胞生長曲線是趨於平緩 (圖十二 B)，推測是etoposide可以抑制細胞生長，所以利用不同細胞數做加藥處 理，目的為希望24小時後可以長滿8ml的細胞量為最低限度(3.125x10⁵ cells/ml)，

與正常繼代細胞方式做比較(1.25x10⁶ cells/ml)，可以看到更明顯的細胞數量差 異。結果顯示，和對照組做比較，以每毫升3.125x10⁵細胞數在加藥處理24小時後，

細胞數大約只有對照組的30%(圖十三)。與每毫升1.25x10⁶細胞數相比，實驗組大 約只有對照組58%(圖十三)，兩組實驗都可以觀察到經過etoposide處理過後的梨 形鞭毛蟲生長情形確實都出現受到抑制的情況，而且以較少的細胞數量進行分析 可以有更明顯的效果。

3.9 抗腫瘤藥物etoposide抑制滋養體時期梨形鞭毛蟲Cwp1表現 loading control。

3.10 抗腫瘤藥物etoposide抑制梨形鞭毛蟲形成囊體

從上一個實驗我們發現etopodide可能會降低Cwp1的表現，所以我們想知道 發現經過etoposide處理的梨形鞭毛蟲，除了囊體化代表性基因cwp1、cwp2、cwp3

有下降情況外，發現gTopoII本身有會有表現量下降的情形(圖十五B)。也可以從 西方點墨法中觀察到囊體化時期Cwp1蛋白也有下降情形(圖十五C)，因此可以證 明etoposide會抑制梨形鞭毛蟲進行囊體化。anti-Ran和Coomassie blue染色做為 loading control。

從以上實驗得知etoposide可能會影響到梨形鞭毛蟲的生長以及囊體化，因此

3.11 鑑定突變gTopoII的表現以及切割和結合DNA的能力

先前研究指出所有的拓樸異構酶都有一個負責打斷雙股DNA的酪胺酸存

gTopoIIm3蛋白是表現在細胞質當中(圖十八、十九)。之後我們也想知道經過突 十) ，比較沒有切割DNA的能力。另外我們也利用γ-32p標定TOP2 BS當作探針 將純化出來的gTopoII-C端以及突變C端蛋白做電泳位移實驗，測試經過突變的 gTopoII-C 端 蛋 白 與 DNA 結 合 能 力 是 否 會 受 到 影 響 。 結 果 顯 示 點 突 變 的 gTopoII-Cm1 和 gTopoII-Cm2 還 有 bound form 的 出 現 ， 表 示 gTopoII-Cm1 及 gTopoII-Cm2還具有結合DNA的能力，gTopoII-Cm3則減少與DNA結合能力(圖二 十一)。

3.12 分析gTopoII以及gTopoII突變蛋白對於囊體化相關基因的調控和囊體形成 的影響

pPgTopoIIm3 表 現 量 都 遠 低 於 pPgTopoIIWT 和 pPgTopoIIm2 ， pPgTopoIIm1 在 164KDa處有小量表現，表現量略高於pPgTopoIIm3，pPgTopoIIm3表現量最低，

在95KDa處可以觀察到其表現量。(圖二十二C、二十三C)。我們接下來再利用 anti-Cwp1觀察各細胞株的表現，結果顯示Cwp1的表現量以pPgTopoIIWT最高，

pPgTopoIIm2次之，pPgTopoIIm1和pPgTopoIIm3表現量較少，pPgTopoIIm1略高 於pPgTopoIIm3，pP5’pac5n表現量最低(圖二十二C、二十三C)。對照到囊體的形 成能力方面，我們利用細胞計數來分析形成囊體的數目，不論在滋養體時期和囊 體化時期都發現形成囊體的能力以pPgTopoIIWT細胞株為最高，pPgTopoIIm2次 之，pPgTopoIIm1略高於pPgTopoIIm3，pPgTopoIIm3表現量最低(圖二十二A、二 十三A)。RNA表現方面，囊體化時大量表現基因例如cwp1、cwp2、myb2也有相 同的趨勢(圖二十二B、二十三B)。

第四章 討論

4.1 梨形鞭毛蟲 TopoII 蛋白功能區域分析

將 gTopoII 與人類 TopoII 比較，特別的地方是梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-IV 區域被分為兩個區塊(圖一 A)。比對序列的相似度，梨形鞭毛蟲與人類拓樸異構 酶-IIα、IIβ的全長胺基酸序列相似程度分別為 41.52%和 38.94%，相同序列比 例分別為28.05%和 27.18%。如果只以 Pfam 程式預測的拓樸異構酶-IV 區域做相 似程度分析，梨形鞭毛蟲與人類拓樸異構酶-IIα、IIβ的胺基酸序列相似程度個 別為44.89 分%和 44.72%，相同序列比例分別為 30.11%和 29.93%，第 998~1056 個胺基酸不被Pfam 程式認為屬於拓樸異構酶-IV 區域，如果單獨將第 998~1056 個胺基酸與人類拓樸異構酶-IIα、IIβ做序列比對時在拓樸異構酶-IV 區域多出 來的一段序列做相似度比較，發現分別只有23.29%和 13.70%的相同程度，13.70%

和 2.74%相似度，可能是此段梨形鞭毛蟲失去了一段長 10 個核苷酸序列且其它 序列相似度太低(圖一 A 和 B)，導致 Pfam 程式分析將此拓樸異構酶-IV 區域區 分為兩段。

另外在 Pfam 程式預測不論在人類的拓樸異構酶-II 或是其他的原蟲拓樸異構 酶-II 例如，阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica)、陰道滴蟲(Trichomonas vaginalis)、

利什曼原蟲(Leishmania donovani)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum) 和錐蟲 (Trypanosoma cruzi)的拓樸異構酶-II 都存在一個顯著的 ATPase 區域(結果未顯 示)。Pfam 程式分析中發現梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 的 N 端部分並未有顯著的 ATPase 活性區域存在(圖一 B)，推測可能會影響到梨形鞭毛蟲拓樸異構酶-II 的 酵素作用的活性，但如果將梨形鞭毛蟲相對於其他物種ATPase 活性區域的序列 (胺基酸第 52 到 201)單獨立用 Pfam 分析，又可以得到這一段序列為具有 ATPase 活性的一段蛋白，因此 gTopoII 的 ATPase 活性這一部分在經過活性分析之後，

我們有測得 gTopoII 是具有 ATPase 活性，且當有 DNA 存在反應中時，ATPase 的活性大約會上升兩倍，但這種情形只出現在全長的 gTopoII 中，同樣具有 ATPase 活性的 gTopoII-N 則沒有這種現象(圖七)。相同的情形也出現在 T.Sengupta 2005 的研究中，研究指出 Leishmania topoisomeraseII 在有 DNA 的情況下分解 ATP 的平均速率也會上升的情況。

然而因為 Pfam 是將具有 ATPase 活性的區域預測為 gyrase 蛋白的區域，為 了瞭解gTopoII 是否是具有 gyrase 的特性或是是屬於 topoisomerase II，所以我們 利用抑制gyrase ATPase 活性的抑制藥物，Coumermycin A1 (Maxwell 1997)，去 觀察此藥物是否會對gTopoII 分解 ATP 的活性有所影響，實驗結果顯示當我們以 不同的 Coumermycin A1 的濃度去做 ATPase 活性分析實驗，各別為 0M、

100M、200M、400M，在這些不同藥物濃度實驗中與對照組相比，皆沒有任 何差異(未附圖)，表示 Coumermycin A1 並沒有抑制 gTopoII 的作用，gTopoII 的 ATPase 活性與 gyrase 蛋白的特性可能不同。

4.2 gTopoII 具有與鎂離子結合區域

先前已經有研究指出 TopoII 必須在有鎂離子存在的環境下才具有活性 (Deweese et al., 2008)，並且已經知道與鎂離子作用的胺基酸殘基，分別是在人類 的topoisomerase IIα胺基酸 E461、D541、D543、D545 或是人類的 topoisomerase IIβ胺基酸 E477、D557、D559、D561(Deweese et al., 2009)，我們去比對梨形鞭 毛蟲與這些胺基酸的相對位置，分別在 gTopoII 胺基酸 E513、D595、D597、

D599(圖一 A)，這四個與鎂離子作用的四個胺基酸在 gTopoII 中也都是存在著。

在gTopoII 切割 dsDNA 的實驗中觀察到當反應中不存在鎂離子時，gTopoII 就不 會將環狀DNA 切割成線性的 DNA(圖四)，表示 gTopoII 的活性確實也是需要鎂 離子來當作輔因子。

4.3 gTopoII 偏好與 AT-rich 序列做結合 十 C)，之後有在利用會結合在AT-rich序列上的化合物Distamycin A來當做競爭 物，與gTopoII做競爭，結果也出現了抑制gTopoII結合序列的效果(圖十一)。所以 推論gTopoII似乎有偏好結合在AT-rich的序列上。另外有研究指出拓樸異構酶可

4.3 gTopoII 偏好與 AT-rich 序列做結合 十 C)，之後有在利用會結合在AT-rich序列上的化合物Distamycin A來當做競爭 物，與gTopoII做競爭，結果也出現了抑制gTopoII結合序列的效果(圖十一)。所以 推論gTopoII似乎有偏好結合在AT-rich的序列上。另外有研究指出拓樸異構酶可