拓樸異構酶

構酶可以分為Type I、Type II、兩種不同的類型(Wang, 2009)，而 Type I 又可以 細分為Type IA 和 Type IB，Type II 也可以細分為 Type IIA 和 Type IIB。其中 Type I 拓樸異構酶可以切斷單股 DNA，type II 拓樸異構酶可以切斷雙股 DNA，

所有的拓樸異構酶都是利用酵素活性中心的 Tyrosine 做親合性的攻擊去打斷 DNA 的磷酸雙酯鍵(Phosphodiester bond)( Corbett et al., 2004)。

Type II 拓樸異構酶是需要消耗 ATP 來達到打斷雙股 DNA 作用。在 1976 年

首先由Gellert 等人分離出來(Gellert et al., 1976)，是屬於 Type IIA，此類別包括 真核生物的拓樸異構酶-II、細菌的 Gyrase 和拓樸異構酶-IV。真核生物的拓樸異 構酶-II 是以同型二聚體(Homodimer)的形式存在於細胞內，而細菌的 Gyrase 和拓 樸異構酶-IV 有兩種次單位(subunit)，以異型四聚體(Heterotetramer)的形式存在，

GyrA、GyrB 為 Gyrase 的次單位，ParC、ParE 為拓樸異構酶-IV 的次單位(Bergerat et al., 1997)。經過 Type II 拓樸異構酶的催化，可以藉由導入正向螺旋或是負向

螺旋改變 DNA 的兩個環繞數(linking number)(Gellert et al.,1976; Brown et al., 1979) 。過去研究也發現 Type II DNA 拓樸異構酶也參與在染色體的分離 (segregation)和維持染色體的結構(Wang, 2002)。Type IIB 是由 Bergerat 等人發現 (Bergerat et al., 1994)，包括了古細菌和一些植物中都發現有拓樸異構酶-VI 的存 在(Kevin et al., 2007)，也有兩種次單位 A 和 B，但拓樸異構酶-VI 的構型和其他 種類的拓樸異構酶不太一樣，在序列上有別於其它種類的拓樸異構酶，因此Type II DNA 拓樸異構酶的分類上分成兩種不同家族的蛋白質(Buhler et al., 1998)。

Type II DNA 拓樸異構酶在大多數的具有生命現象的細胞中都可以發現，而真核 生物至少會包含一種以上的Type II DNA 拓樸異構酶，例如在大多數真核細胞中 都會存在DNA 拓樸異構酶-II，在脊椎動物中存在著兩種 DNA 拓樸異構酶-II 異 構物，拓樸異構酶- IIα 和拓樸異構酶-IIβ(Watt et al., 1994; Gimenez-Abian et al., 1995)。

真核生物的細胞分裂包括了兩個重要步驟，染色體的複製和染色體分離到兩 個子細胞，此時可能會受到一些外來的致病因子所威脅，像是自由基或是紫外 線，但主要造成基因體不穩定（genomic instability）的原因來自於 DNA 的生理 現象，致因包括DNA 複製、同源性重組(homologous recombination)、有絲分裂 時的染色體分離，可能造成缺失或是不正常交換現象(German, 1974; Murray et al., 1985; Holm, 1994; Bierne et al., 1994)。先前已有在一些實驗中發現拓樸異構酶-II 對於細胞週期和細胞分裂的重要性，例如酵母菌在拓樸異構酶-II 的突變實驗中，

有絲分裂時因為拓樸異構酶-II 的突變，使染色體分離造成了斷裂(DiNardo et al., 1984; Holm et al., 1985, 1989; Uemura et al., 1987)。在其他實驗中發現失去正常功 能的拓樸異構酶-II 會造成細胞週期停留在有絲分裂第一期，停止細胞生長，但 不會失去存活能力(Rose et al., 1990, 1993)。而在哺乳動物中存在著兩種拓樸異構 酶-II 異構物，已經有研究發現兩種拓樸異構酶雖然具有相似的活性(Austin et al., 1998)，但是在細胞的生長中卻受到不同的調節，並且兩種酵素之間的角色無法 互相補償(Carpenter et al., 2004; Yang et al., 2000; Akimitsu et al., 2003)。另一方 面，拓樸異構酶- IIα 只發現在增殖(proliferation)的細胞當中(Heck et al., 1988;

Hsiang et al., 1988)，而拓樸異構酶-IIβ 則是顯著的表現在分化晚期的細胞當中 (Capranico et al., 1992; Tsutsui et al., 1993, 2001; Turley et al., 1997; Lyu et al., 2003; Watanabe et al., 1994)。細胞發育或分化的過程中包括了基因的轉錄、DNA 的複製、染色體的分離，這些都必須有拓樸異構酶的參與，以解決在DNA 上遇 早期發育，調控相關發育基因的表現(Tsutsui et al., 2001)。

先前已經有一些關於梨形鞭毛蟲染色體的研究報告，例如，雖然梨形鞭毛蟲 的五條染色體已經利用PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)技術分離開來，但 是目前並沒有任何DNA 以染色體(chromosome)的型態被發現(Adam, 2001)，所以 可能梨形鞭毛蟲並沒有染色質(chromatin)轉換成染色體的情形存在(He et al., 2005)。還有目前並沒有發現到有核仁(nucleoli)的存在，而且 rRNA 的轉錄和修 飾也不是在細胞核的中心進行(Li et al., 1997; Narcisi et al., 1998; Adam, 2001 )。

先前已經有研究發現梨形鞭毛蟲具有 Type II DNA 拓樸異構酶的基因存在，

但僅限於序列分析(He et al., 2005)，梨形鞭毛蟲的 Type II DNA 拓樸異構酶是屬 於Type IIA，基因全長有 4476 個核苷酸，且不帶有內含子(Intron)，並且從胺基 酸序列上來看，和其它真核生物的DNA 拓樸異構酶-II 具有高度的同源性(He et al., 2005)，但是有一些相異於其它真核生物 DNA 拓樸異構酶-II 的地方有被發

現，像是有一些短片段序列，7~46 個胺基酸序列插入在 ATPase domain 和序列中 心區域(central domain)，中心區域也較其它 DNA 拓樸異構酶-II 多了大約 100 個 胺基酸，但C 端短了大約 200 個胺基酸，且特別的是梨形鞭毛蟲 DNA 拓樸異構 酶-II 的 C 端(第 1335~1491 胺基酸)富含帶有電荷的胺基酸，D、E、K 和 R 大約 占了C 端的 43%(He et al., 2005)。

在1993 年時 Bell 等人找到一種可以有效抑制梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-II 的 藥物，Bis-Benzimidazoles，他們發現此種藥物效果比之前用來治療梨形鞭毛蟲的 Quinacrine HCI 和 Metronidazole 效果還要好(Bell et al., 1993)，但其實驗中使用純 化自梨形鞭毛蟲的拓樸異構酶-II，可能含有其他拓樸異構酶。烷化劑(alkylating agents)是一種抗腫瘤藥物，Bis-Benzimidazoles 是烷化劑的攜帶者(carrier)，和 DNA 的次要溝槽(minor groove)有高親和性，可以將烷化劑帶到特定的 DNA 序列上 (Stephanie et al., 2007)。而現在普遍用來抑制拓樸異構酶-II 的藥物為 etoposide，

是一種抗癌藥物，可以穩定拓樸異構酶-II 切斷 DNA 所暫時形成的 DNA-酵素複