Lipopolysaccharide 抗血小板凝集作用之機轉探討
Mechanisms involved in the antiplatelet activity of lipopolysaccharide
中文摘要
Lipopolysaccharide (LPS)為格蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)細 胞外 壁上的一種脂多醣體，其分子量約為1×105 ~ 9×105 Da 之間。在
此類細菌感染而致病的 原因中，主要是其分子上的LPS 扮演決定性的角
色。譬如LPS 對全身循環系統的影響，如引起低血壓、腎臟皮質壞死、影
響血球的數目、使循環中血小板數目減少、造成瀰漫性血管 內凝血(
DIC)、甚至引起敗血性休克而最後導致死亡。其中 LPS 對血小板的影響如 何? 其機 轉又為何? 眾說紛云，尚無明確的答案，這也是本篇論文所要 探討的目的。 在人 類及兔子的血小板懸浮液中，發現LPS 能隨著 濃度和時間的增加而有效地抑制由collagen (5 mg/ml)、U46619 (1
mM)、thrombin (0.5 U/ml)、ADP (10 mM)、PAF (0.8 ng/ml)所 引起的
血小板凝集及ATP 釋放反應。在人類富含血小板血漿中亦有相同的抑制作
用。因LPS (100, 200 和 500 mg/ml)能依劑量相關性(dose-dependent)
的抑制不同活化劑所引起的血 小板凝集反應；所以，我們懷疑LPS 是否
是作用在血小板凝集的最後共同路徑上；也就是 纖維蛋白原(
fibrinogen)與血小板細胞膜上的 glycoprotein IIb/IIIa complex 的結合
， 進而抑制血小板凝集反應。實驗發現LPS 並無法影響 FITC 標定的 triflavin 結合到細胞膜上 glycoprotein IIb/IIIa complex；
triflaflavin 是一種蛇毒蛋白，已證實為一種 glycopr otein IIb/IIIa
complex 的拮抗劑。因此，本實驗證實 LPS 抑制活化劑所引起的血小板凝 集反應，可能與抑制glycoprotein IIb/IIIa complex 無關。另外 LPS (100, 200 和 500 mg /ml)能明顯地抑制 collagen 所引起的
phosphoinositides (PI) 的分解，且亦能抑制 colla 所引起的血小板細 胞內鈣離子的增加，但對collagen 所引起的 thromboxane B2 的形成 ，則 無明顯抑制作用。在偵測細胞膜流動性的實驗中，Lg/ml)會明顯減少
diphenylhexatr iene (DPH)標定到細胞膜的程度，此暗示著 LPS 會干擾 血小板細胞膜的流動性；在測量lac tate dehydrogenase (LDH)的實驗 方面，LPS (100, 200 和 500 mg/ml)亦會有意義的增加 血小板細胞膜外 的LDH (約 7 ~ 9 %)含量，此點暗示著 LPS 可能會經由改變細胞膜的流動性 進而促使些微的LDH 釋放。再者，在探討 PKC pathway 時，我們發現 LPS (200 和 500 mg/ml) 與血小板懸浮液溫浴 60 分鐘後，會部分抑制 PKC 的活 化劑如PDBu 所引起的血小板凝集反應(約 30 %)；另外，LPS 也會有意義的 抑制47 kDa protein 的磷酸化反應。此外，LPS (200 和 500 mg/ml)不會 有意義的增加血小板內cyclic AMP 的含量，但能提高 cyclic GMP 在血小板 中的濃度，此點暗示著是否LPS 是藉由促使血小板 NO 的形成進而增加
cyclic GMP 的含量； 利用 chemiluminesence 的方法進一步偵測 LPS 對血 小板中NO 的影響，實驗結果亦發現 LPS 會明顯的增加 NO 的濃度。綜合以上 的結果，LPS 對血小板的抑制作用機轉可能有以下二點： (一) LPS 直接 改變了血小板細胞膜的流動性，進而影響了一些嵌在細胞膜上的蛋白質的 作用，如phospholipase C (PLC)，使得 phosphoinositides (PI)分解後 產生inositol-1,4, 5-trisphosphate (IP3)與 1,2-diacylglycerol
(DG)的含量減少，IP3 的減少會降低細胞 內鈣離子的濃度，進而抑制血 小板的凝集及釋放作用，而DG 減少則會進一步抑制 47 kDa p rotein
phosphorylation。(二) LPS 活化血小板內的 NO synthetase (NOS)，進而 促進NO 形成，接著活化了 guanylate cyclase，使 cyclic GMP 的量增加
，接著抑制phospholipase 的活性，減少 PI 的分解，再使得細胞內鈣離子 濃度降低，而抑制血小板的凝集反應。
英文摘要
Lipopolysaccharide (LPS) was originally known as endotoxin and sat on the out er membrane of the Gram-negative bacteria. The moleculer weight of LPS was abo ut 1×105 ~ 9×105 Da. A single injection of LPS can produce hypotension, rena l cortical
necrosis, changes in numbers of peripheral blood cells, thrombocyto penia, disseminated intravascular coagulation (DIC), and septic shock. However , the exact machanism is still unclear and requires further characterization.I n our studies,
we found that LPS can dose-dependently (100 ~ 500 mg/ml) and ti me-dependently (10 ~ 60 min) inhibit platelet aggregation
induced by collagen (5 mg/ml), U46619 (1 mM), thrombin (0.5 U/
ml), ADP (10 mM), and PAF (0.8 ng/ml ) in human and rabbit platelet suspensions. The similar results were also obta ined in the preparation of platelet-rich plasma (PRP). This may imply that whe ther LPS inhibits platelet aggregation through
directly interfering with fibri nogen binding to fibrinogen receptor associMeasurement of the platelet membran e fluidity, we found that LPS was capable of direct interaction with platelet membrane fluidity tragged with diphenylhexatriene (DPH). In LDH assay, LPS ind uced a slight release (7 ~ 9 %) of lactate dehydrogenase (LDH) from platelet c ytosol in human platelets. In protein kinase C experiments, LPS (200 and 500 m g/ml) also significantly inhibited platelet aggregation and decreased a 47 kDa protein phosphorylation induced by PDBu
(0.05 mM), a PKC activator. On the ot her hand,Therefore, based on the above observations, we suggested that there a re two possibilities involving in the antiplatelet activity of LPS: (1) LPS in fluenced the platelet membrane fluidity is the primary mechanism, followed by the inhibition of phospholipase C activity, thereby leading to the inhibition of [Ca2+]i
mobilization and platelet aggregation induced by agonists. (2) LPS induced NO formation through directly activation of NO synthetase, resulting f inally in increase the cGMP levels in human platelets
