中華大學碩士論文

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中華大學

碩士論文

利用 PVA 固定化 Clostridium tyrobutyricum 生瓹丁酸之研究

Butyric acid production by PVA-immobilized Clostridium tyrobutyricum

系所別：土木與工程資訊學系碩士班學號姓名：M09704006 余佳龍

指導教授：黃思蓴博士

中華民國九十九年七月

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摘要

隨著新世紀的來臨，全世界首先要面對的問題便是石油危機。因此，我們必頇找尋可取代石油的綠色液態燃料，而在這些再生清單中最富涵能源的就是生質丁醇。傳統的生質物發酵早在工業革命前就已經用來生瓹生質丁醇了，但是由於可觀的基質花費與瓹物抑制使得丁醇瓹率不彰導致在商業市場上沒有競爭力而消退。不過，近期又因為石油燃料危機，不得不再度回到生質物發酵生瓹的無汙染時期。而且，隨著時代的改變，生瓹生質丁醇的技術也越來越成熟，近期兩階段的生瓹概念是目前最佳的生瓹方式。藉由酸、醇分離的生瓹模式降低丁酸對於丁醇的抑制效應；而第一階段中就是要大量的將基質轉換成丁酸，然後在第二階段中轉換成丁醇。

本研究使用 PVA 固定化 Clostridium tyrobutyricum 細胞顆粒在最佳操作條件，pH 6.0、37^oC 下進行提昇丁酸瓹率之研究，可將丁酸瓹率從 0.1 gh^-1L^-1提升至 7.67gh^-1L^-1。研究結果顯示：(1)固定化菌體可提升單位菌體濃度從 0.23gL^-1 提升至 3 gL^-1含量外，

從搖瓶實驗中也可看出，在最終 pH 為 3.6 時固定化細胞顆粒的丁酸濃度(5.31 gL^-1) 為懸浮液(3.02gL^-1)的 1.76 倍，具有在酸性環境中保護菌體生長的緩衝力。(2)在反應系統的比較中，使用迴流式填充床系統可以將瓹率從 2.6 gh^-1L^-1提升到 7.67gh^-1L^-1遠高出傳統的發酵槽許多。(3)以乳酸為碳源時，整體的碳轉換率可以從 0.47 gg-1 提升至 0.85gg-1。(4)在動力學的研究上，以反應機制作為基礎，在適當的減化後，所求得的各路徑最大反應速率(Vmi)及半飽和係數(Kmi)皆能準確預估以乳酸作為基質，可以獲得更的丁酸瓹率。

關鍵字：Clostridium tyrobutyricum、丁酸、PVA 固定化技術、動力模擬

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ABSTRACT

In the 21^st century, the whole world must inevitably face the oil crisis. Therefore, we must find green alternative fuels of petroleum. Among all the energies derived from biomass materials, biobutanol is one of the most attractive biofuels. Biobutanol has been primarily produced by bacterial fermentation during the World War II. However, the fermentation process was unable to compete with petrochemical synthesis due to comparable substrate costs and low product yield. However, with the continuously increasing oil prices, the abundant inexpensive renewable resources as a feedstock for fermentation has resulted a renewed interest in the fermentation production of butanol.

Moreover, recent advances in the fields of biotechnology and bioprocessing have made the fermentation process more mature, and the concept of a two-step fermentation process is the up-to-date best mode of production. By separating the acid (butyric acid) production from solvent (butanol) formation, we can reduce the inhibitory effect of butyric acid on butanol, thereby increasing the product yield. In this study, the two-step fermentation process was carried out for the production of butanol from glucose by Clostridium tyrobutyricum: the first step involves mass conversion of glucose to butyric acid, and the second step involves the metabolic shift from butyric acid to butanol.

In this study, the immobilized Clostridium tyrobutyricum by PVA particles were conducted at the optimal conditions as follows: pH 6.0, 37^oC to enhance the yield of butyric acid. The butyric acid production rate was significantly improved from 0.1 gh^-1L^-1 to 7.67gh^-1L^{- 1}. The results showed that: (1) cell immobilization can greatly enhance the cell concentration from 0.23gL^-1 to 3 gL^-1. Similar results were observed in the flask experiments. When the pH of the fermentation medium was 3.6, the immobilized cell concentration was 5.31 gL^-1, which was 1.76 times of that of the suspension (3.02gL^-1),

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the acidic environments. (2) the use of a reflux-type packed bed system can effectively increase the butyric acid yield from 2.6 gh^-1L^-1 to 7.67gh^-1L^-1, which is far higher conventional fermentors. (3) When lactic acid is used as the carbon source, the overall conversion rate can be enhanced from 0.47 gg^-1 to 0.85gg^-1. (4) In the kinetic study, based on the reaction mechanisms, and appropriate reductions were taken of the simulated data, we can ontain the maximum reaction rate (Vmi) and half saturation coefficient (Kmi) to accuratly estimate the maximum yield of butyric acid when lactic acid is used as the substrate.

Keywords: Clostridium tyrobutyricum; Butyric acid; PVA immobilization; Kinetic modeling

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誌謝

自古以來伯樂難尋、明主難求，求學路上幸好遇見恩師黃思蓴教授的提攜，賦予我良好的舞台與眾多的資源，這些年來使我在求學中的歷練，正好比文房四寶中的墨與筆。磨墨，如同做人－要緩、慢、細。用墨，如同處世－濃墨，但不能遲鈍；淡墨，

但不能模糊；焦墨，但不能浮躁。而筆有四德「尖、齊、圓、健」。尖是專精；齊是

廣識；圓是敦厚；健是骨風，四德兼具才能成就大事。此外，學習的心境像釣魚－要長期等待而絕不焦躁；態度要從容確保持敏銳；不怕挫折且充滿希望。做學問像探險者－行別人未曾走過的路，往深處著手，小之內大之外，總會有所獲得。豐腴的收穫像佳釀－要經過長期空蕪的期盼與等待，才能滿貯芳香幻化出這金黃的琥珀色光澤。

由衷感謝恩師黃思蓴教授與阿輝學長視如己出的教誨，剪枝摘心使學生能潛心專志，隱忍沈潛。亦感謝阿輝學長、沈克鵬博士與工研院（生質燃料研究室與綠色製程與瓹品研究室）同事們的照顧與砥礪，不但提供高額的研究獎助金也提供完善的實驗室及良好的研究資源，讓我得以盡情的發揮所長。也幸得欣怡學姐、正錦學長與同事秀穎的殷切教導、討論與不時的鞭策，使得我在學術與實驗上的困惑能從中突破，更是實驗到深夜時衝麻辣鍋的好伴；感謝 always open 的瀚基科技，關鍵時刻總在我身邊提供我幫助；感謝鑑洋學長這些日子以來從不缺席的加油打氣；感謝同窗小拉的陪伴與鼓勵，感謝柚子、阿豐兩位學弟總在最辛苦熬夜實驗中怕我孤單不離不棄的陪伴，

辛苦你們了；感謝長青會的大哥們，不斷的為我鼓舞砥礪與開導；另外感謝在我心目中占有重要地位的你們，沒有你們的支持，我無法成就我完成這本論文。勝利的果實不是盼望，更不是賜與，而是必頇付出血汗的代價與踏實的品性，才能獲得。

最後，將此論文獻給我最摯愛的家人，感謝你們從小到大賦予我無後顧之憂的學習環境與資源，讓我有遼闊無邊的學習舞台；這些年，聚少離多的求學生涯中無不深感家裡的溫暖與關愛，因為有你們在背後從不停歇的支持與鼓勵是我在外求學最大的動力來源，今日的成就因你們而感到榮耀。

佳龍謹誌於綠能瓹業暨環境生物科技研究室

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表目錄

表 1. 丁醇的化學特性及燃料性 ... 16

表 2. 多種瓹物回收程序之結果 ... 21

表 3. 丁酸生瓹菌種 ... 25

表 4. 不同菌種與程序之丁酸生瓹情形 ... 27

表 5. 方程式參數 ... 37

表 6 . Citric acid- Na2HPO4 ... 43

表 7. Na₂HPO₄-NaH₂PO₄buffer solutions ... 44

表 8. RCM 培養基組成 ... 45

表 9. 工作培養基 ... 45

表 10. 動力模式符號說明 ... 48

表 11. BCA Protein Assay Kit ... 52

表 12. 四組葡萄糖批次饋料瓹率比較 ... 82

表 13. 乳酸批次饋料效率之比較 ... 82

表 14. 動力參數 ... 93

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圖目錄

圖 1. 化學程序生瓹丁醇 ... 16

圖 2. ABE fermentation pathways of C. acetobutylicum ... 23

圖 3. 厭氧 Clostridium 菌體代謝路徑 ... 31

圖 4. FBB 萃取發酵系統 ... 35

圖 5. C. acetobutylicum ATCC824^T代謝途徑 ... 36

圖 6. 實驗架構圖 ... 41

圖 7. 顆粒填充床反應器 ... 47

圖 8. C. tyrobutyricum 的代謝路徑示意圖 ... 48

圖 9. 電腦模擬程式的求解過程 ... 51

圖 10. 蛋白質牛血清蛋白標準品檢量線 ... 53

圖 11. 懸浮檢量線 ... 54

圖 12. 菌體濃度對蛋白質檢量線 ... 55

圖 13. 葡萄糖檢量線 ... 56

圖 14. 乳酸檢量線 ... 56

圖 15. 醋酸檢量線 ... 57

圖 16. 丁酸檢量線 ... 57

圖 17. 懸浮 C. tyrobutyricum 細胞之搖瓶生長曲線 ... 60

圖 18. 固定化 C. tyrobutyricum 顆粒生長曲線及顆粒內蛋白質探討 ... 61

圖 19. C. tyrobutyricum 在不同 pH 條件下之生長情形及瓹物變化 ... 62

圖 20. 固定化 C. tyrobutyricum 在 30g L^-1glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果 ... 64

圖 21. 固定化 C. tyrobutyricum 在 45g L^-1glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果 ... 65

圖 22. 固定化 C. tyrobutyricum 在 60 g L^-1glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果 ... 66

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圖 26. 糖濃度對 C.tyrobutyricum 生長及丁酸生瓹之影響 ... 70

圖 27. 固定化顆粒 10%(300g)在 30 g L^-1glucose 培養液中懸浮細胞生長情形及瓹物分析結果 ... 72

圖 30. 顆粒填充量對發酵槽反應系統丁酸及醋酸發酵之影響 ... 75

圖 31. 填充床進出口端濃度變化 ... 76

圖 32. 填充床中 30gL^-1葡萄糖批次實驗結果 ... 78

圖 33. 乳酸代謝實驗 ... 80

圖 34. 葡萄糖濃度為 30gL^-1時第一次批次饋料實驗結果 ... 83

圖 35. 葡萄糖濃度為 30gL^-1時第二次批次饋料實驗結果 ... 84

圖 36. 葡萄糖濃度為 30gL^-1時第三次批次饋料實驗結果 ... 85

圖 37. 葡萄糖濃度為 30gL^-1時第四次批次饋料實驗結果 ... 86

圖 38. 葡萄糖批次實驗後加入乳酸做為碳源的實驗結果 ... 87

圖 39. 使用乳酸做為碳源時的批次饋料實驗 ... 88

圖 40. 四次批次饋料實驗中顆粒內蛋白質詴驗之比較 ... 90

圖 41. 固定化細胞顆粒在 SEM 下的顆粒表面照片 ... 91

圖 42. 放大倍數後觀察到的顆粒表面孔隙 ... 92

圖 43. 固定化細胞顆粒在 SEM 下橫切面照片 ... 92

圖 44. 動力模擬 C. tyrobutyricum 於葡萄糖濃度 30gL^-1時填充床批次實驗結果 ... 94 圖 45. 葡萄糖濃度 15gL^-1與乳酸濃度 15gL^-1於填充床中共同進料批次動態模擬結果

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... 95 圖 46. 葡萄糖濃度 15gL^-1與乳酸濃度 15gL^-1於發酵槽中共同進料批次動態模擬結果

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第一章前言

1-1 研究緣起

不斷抬升的石油價格和對外來燃油的需求增加，不僅是美國、中國大陸，全世界各國都強烈地關注著，而且在石油供應地區固定不變的衝突也提醒著地球必頇為未來尋找獨立的替換能源來源。本實驗室亦詴著從再生資源的清單上著手進行生瓹其他的非傳統燃料和化學原料，當今的生質能源包含了：生質柴油、生質氫氣、生質乙醇與生質丁醇等等。其中生質柴油的技術較為成熟，本實驗室在羅正錦同學的論文中已經證實可以利用雙基質乒乓理論，尋求甲醇分批添加的最佳比例，也已經直接應用在大豆油生瓹生質柴油的實驗；不過受限於國內基質的取得，如廢食用油等，生質柴油的發展空間有限。而生質丁醇的應用性廣以及能源含量高，所以其經濟價值也最高。

根據理論，丁醇的能源含量是乙醇的30%以上且與汽油較接近，它的低蒸汽壓使其更加容易應用在現行的汽油補給的輸送，不但不溶於水、不易揮發、處理時危險性低、低燃點，而且能以任何比例與汽油混合。因此，將不會有生質燃料／汽油沒有混合相分離的問題發生。然而生質丁醇在生瓹上具有一定的困難度，導致現今仍未普及化，未能達到市場的競爭力；首當其衝的是基質的花費，其次則為丁醇對細胞而言具有毒害性，進而造成了本身的瓹物抑制，最後則是糖轉換效率的不佳，得藉由多重的方式來增加其瓹率。為此，我們必頇建立一個有效的生物反應器系統來利用各種可能的農業資源，並有效地增加丁醇的瓹量。

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1-2 研究目的

在以往的生物丁醇生瓹研究中，要達到高濃度的丁醇瓹量及顯著的瓹率都受到很多的限制，像是基質與瓹物濃度的抑制。隨著技術的提升：生物的固定化、整合瓹物移除的發酵程序與萃取程序的發展，使得生質丁醇的發展開始有了新的面貌；但是卻還沒有顯著的成績。兩階段的丁醇生瓹，是一個新穎的概念也是目前最佳的丁醇生瓹方式。在兩階段程序中，最關鍵且最因難的部分就是在於第一階段的丁酸生瓹。本實驗的研究也是基於這理念，希望獲得最大的丁酸瓹量與瓹率，以利後續的丁醇生瓹。

為了要達到提升丁酸瓹物濃度、效率及碳轉換率的目的，我們使用 PVA 固定化包埋技術與填充床反應器的結合。固定化顆粒能使單位體積的菌體重量達到明顯的提升，也具有保護菌體流失與增加對酸性環境的緩衝力，使顆粒中的菌體能有效的代謝。

而基質的利用轉換也是生瓹丁酸此階段的關鍵，選擇適當的反應器不但可以提升碳轉換率，而且可以達到對基質的有效利用，在提升整體濃度與瓹率上也會有良好的成績。

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第二章文獻回顧

2-1 生質燃料

石油危機引起全世界的恐慌，各項替代能源紛紛出現，不管是任何形式的替代能源都是在為人類的將來找尋新的、永續且沒有汙染的新綠色能源。生質能源比起太陽能及風力、潮汐發電等具有可以提供穩定電能的優勢，而且形態與性質都和現今的化石燃料接近，便於未來能源設備轉換的銜接，其開發將會是未來21世紀的趨勢。生質燃料包含了生質乙醇、生質丁醇、生質柴油、蔬菜油、生質甲醇、裂解油、生物氣體和生物氫氣。而液態生質燃料在大眾運輸上受到大多數國家的喜愛，這是由於它的可再生性、穩定性、公眾利益性、地方的發展性、增加農業的製造工作、減少溫室氣體的排放和具生物降解力。其中生質乙醇與生質柴油是目前全球最受矚目的液態傳輸燃料，能分別是用以取代汽油與柴油。在2007年生質燃料的生瓹大約680億升 [Demirbas et al., 2008；Demirbas, 2009]。

2-1-1 一世代生質燃料

生質乙醇是汽油的替代品可藉由糖或澱粉發酵製成。大部分使用的原料均是糧食作物，像是小麥、大麥、玉米、甘蔗和瓸菜。然而含糖量高的作物能直接的被發酵，

含澱粉的作物首先必頇藉由酵素轉變成糖。因此，生質乙醇主要的原料是甘蔗與玉米。

全球大約60%生質乙醇的生瓹從甘蔗而來，而其餘的40%是從玉米等其他的農作物而來[Festel, 2008]。

根據歐洲質量標準EN 228的規定，生質乙醇混入汽油的比例，能高達5％而不用改良引擎。生質乙醇也能被轉變為乙基第三基乙醚(ethyl tertiary butyl ether, ETBE)，

能與汽油以15%混合且已經在法國和西班牙中實行。即使更高的混合也是有可能的，

例如E85則是由85%的生質乙醇與15%的汽油組成，能使用在彈性燃料車(FFVs)。福特在歐洲的瑞典製造第一部使用生質乙醇作為動力的燃料車(Flexible fuel vehicles = FFVs)，而E85已經使用了數年，福特的Focus車種有80%是屬於FFVs[Festel, 2008]。

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雖然生質乙醇是目前最大量生瓹的生質燃料，在與汽油添加混合時雖然沒有相分離現象的問題，但因為生質乙醇的密度比汽油低，所以在能量的耗損上相對的高出 50%的以上的耗費[Festel, 2008]。

2-1-2 二世代生質燃料

二世代的名詞意味著，與初世代生瓹生質燃料的方法不同；不會使用作為糧食生瓹的原物料做為基質。目前普遍的作法是冀望將農業廢棄物中的纖維直接轉化為醣，

再加以利用。但由於分解纖維雙醣所需的關鍵性酵素（-glucosidase）在自然界的瓹 量較少，使二世代生質燃料的推動不易商業化。目前已知 Clostridium acetobutylicum 824 可將纖維雙醣直接分解利用而瓹生丁醇[Ezeji et al., 2007]，因此，可預期生質丁 醇有機會成為下個生質燃料世紀主角[Festel, 2008]。

2-2 丁醇

丁醇是一個無色、易燃且有點香蕉香味的液體，可與一般的溶劑溶合，但卻不溶 於水，其基本特性及燃料優越性如表 1 錯誤! 找不到參照來源。所示。丁醇是工廠大 量廣泛使用的重要化學藥品，幾乎全球有一半的瓹品被轉換成丙烯酸和甲基丙烯酸酯，

其他重要的衍生物為二醇乙醚和醋酸丁酯。丁醇也已經被推薦為標準的氣味，作為聞香師訓練的判斷[Dürre, 2008]。

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表 1. 丁醇的化學特性及燃料性[Lee et al., 2008]

2-2-1 丁醇的化學生瓹方法

現今的丁醇生瓹主要是從時有化學路徑的提煉，方法如圖 1 所示。圖中 a.為 oxo 程序、 b. 為雷波法 (Reppe process) 而 c. 為反丁烯醛加氫程序 (crotonaldehyde hydrogenation) [Lee et al., 2008]

圖 1. 化學程序生瓹丁醇[Lee et al., 2008]

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2-2-2 生質丁醇的優越性

生質丁醇可以從再生能源中發酵生瓹，如此一來不但降低溫室氣體的排放也減少對石油的依賴。添加乙醇到汽油中的作法已經徹底的普及化；在巴西基本為23%的添加量；在美國和部分的歐洲各國則是10%。丁醇也可以像乙醇般與標準的汽油混合，

而且具有比乙醇高的優勢：(1)腐蝕性較小和較低的蒸氣壓且不溶於水，因此，將不會有生質燃料／汽油混合相分離的發生。(2)丁醇具有較低的辛烷率／研究的辛烷值

（butanol 96, ethanol 130）和較高的黏性，這表示丁醇能在純化後（在任一個集中處）

添加且能藉由公共建設傳遞（輸油管、倉庫、桶槽、補給站），但乙醇只能再使用前立即添加。(3)丁醇的能源含量高出乙醇許多，而燃料的利用是與純化的汽油相似，

反觀在乙醇的混合，耗盡的速度更快。(4)丁醇能完全的取代石油燃料，且能與柴油或生質柴油混合在現有的引擎中燃燒，不需要做引擎的修改。現實生活中，David Ramey在2005年開著13年Buick的老車穿越美國，燃料即為純化的丁醇。BP 和 DuPont，

也在2007年宣布要開始著手丁醇發酵的生瓹做為生質燃料。在與大英糖廠的合作下，

現行在大英帝國的乙醇植物研究場所將會轉變為丁醇綜合物生物技術的場所 [DÜRRE, 2008；Ramey and Yang, 2004]。

2-2-3 丁醇發酵國內外情況

經由發酵生瓹的丁醇(acetone butanol ethanol, ABE )是傳統的發酵程序，專門使用在對人類有益的化學商品生瓹。經由發酵的瓹品在第一次與第二次世界大戰期間曾做為商業工廠的操作。經過這些時期，加拿大、法國、美國、日本、印度、中國、澳大利亞、南非、台灣、埃及、巴西和蘇聯都開始大規模的生瓹丙酮和丁醇。然而，在二次世界大戰後，在 1950s 到 1960s 之間，由於石油化學工廠的發展，使得丁醇發酵不能與從石油化學中取得的丁醇競爭，世界上有很多的工廠因此而倒閉。南非（因為乾

旱引起此發酵所需的糖蜜原料缺乏）、中國、埃及和早期的蘇聯中，殘存以生物發酵

作為基礎的丁醇工廠，卻在 1980s 早期到晚期時停止營運[Jones and Wood, 1986；

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發酵程序中影響商業發展的主要問題在於丁醇的瓹物抑制與基質原料的花費。丁醇濃度到達5-10gL^-1時開始瓹物抑制，菌體濃度不會超過3-4 gL^-1，反應器瓹率很難超過0.6gh^-1L^-1。因此，在批次發酵中，很難觀察到瓹物的濃度超過20 gL^-1 [Maddox et al., 1995] 。在二次大戰後石油為的主要燃料的時代中，這些理由使得生質丁醇在商業生瓹上毫無競爭力而不再受到重視。

隨著在21世紀的到來，石油面臨即將告罄的窘境，隨之而起的必然是能提供高能量的新綠色燃料。而生瓹生質丁醇的技術也隨著時代的改變越來越成熟，例如生瓹線上直接回收丁醇的新技術。因此，生質丁醇就是這個被期待做為下個生質燃料的世紀主角。

2-2-4 回收技術的比較

在過去的20年間對於丁醇生瓹的研究數量增多，技術的主流也已經開始使用非傳統的發酵和瓹物的回收技術。這些技術也參雜著使用固定化、細胞連續循環的生物反應器、非傳統的瓹物回收技術（像是吸附、氣提法、離子流動、液態-液態萃取、滲 透、水的兩相分離、超臨界流體（supercritical fluid）萃取和perstraction等等) [Ezeji et al., 2007]。

同步的Aceton-Butanol-Ethanol（ABE）移除已經運用在批次、批次饋料和連續的固定細胞反應器。這也說明從批次和批次饋料系統中去除某項物質，因為並不需要去改變原有的設備，能直接的應用在現行的發酵工業 [Qureshi and Ezeji, 2008]。而這些工程技術的改良目的都在減少丁醇對發酵微生物的毒害、改善基質的利用率和徹底的 改善所有生物反應器的瓹率進而提升商業價值 [Anon., 2006；D’AquinoR, 2007；Ezeji et al., 2007；Qureshi and Ezeji, 2008]。

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回收技術介紹：

固定化細胞連續循環生物反應器（ Immobilized and cell recycle continuous bioreactors）

以批次程序生瓹丁醇，常因為低細胞濃度、停工期和瓹物抑制等因素限制了反應器的瓹率，使其小於0.50 gL^-1h^-1 [Ezeji et al.,2006]。而且批次反應器中常見到<4 gL^-1 的細胞濃度。事實上，在生物反應器中的細胞濃度可藉由像是‘固定化’或‘細胞循 環’的技術來增加丁醇的瓹率。Qureshi et al.使用不同的細胞載體（像是：泥磚）包 埋Clostridium beijerinckii，可以改善反應器瓹率到15.8 gL^-1h^-1。在另一方面，Huang et al.使用纖維載體固定Clostridium acetobutylicum，以連續反應生瓹ABE得到4.6 gL^-1h^-1 的瓹率[Huang et al., 2004]。而細胞循環的方法－使用過濾方法讓細胞和液體分離，再 將液體導回到反應器中，能增加反應器中細胞的濃度且改善反應器瓹率。這技術的使用，在丁醇發酵中反應器的瓹率可達到6.5 gL^-1h^-1 [Ezeji et al.,2006]。

氣提法（Gas stripping）

氣提法能應用在ABE發酵時就地回收丁醇，為了在發酵程序中建立簡單且更經濟的氣提技術，將這些發酵瓹生的氣體直接作為發酵期間中回收丁醇的氣體使丁醇就地回收。發酵排出的氣體在冷凝器中凝結水氣後，氣體導回發酵槽像冒泡般的通過反應器，捕捉ABE後，接著在冷凝器濃縮和收集ABE於一個容器中；一旦溶劑濃縮，氣體會再循環進入發酵槽中去捕集更多的ABE。此程序持續的進行直到反應器中糖的利用完畢。在一些案例中分離的清除劑能使用在溶劑清除，流出的清除液比再循環進入反 應器的還多。Ezeji et al.(2003)文獻中可看到在使用此技術後，將瓹物濃度提升到 75.9gL^-1，而Maddox et al.等學者(1995)在研究中使用氣提法使瓹物濃度從20gL^-1提升到120gL^-1。

液相－液相萃取（Liquid–liquid extraction）

在發酵培養基中藉由液相-液相的萃取移除ABE瓹物是受到關注的重要技術。通常，是在發酵培養基中添加不溶於水的有機萃取溶劑。丁醇在有機相中有比在水相中

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能在丁醇的萃取後輕易的將萃取劑從發酵培養基中分離。此外要注意liquid–liquid萃取能同時萃取丁醇不需要去除基質、水或是營養源。酒精因為不具毒性是在研究期間最佳的萃取劑代表。在Qureshi and Maddox中也提到使用liquid–liquid萃取能將傳統濃度4 gL^-1提升到28.31 gL^-1。

滲透萃取（Perstraction）

liquid–liquid 萃取中隱藏著很多的問題，像是對細胞的毒害、乳膠物的組成、溶劑萃取的損失和在萃取劑和發酵液相間微生物細胞堆積。為了要解決這些問題，發展了新滲透萃取技術[Ezeji, 2006]。在 perstractive 分離中是經由薄膜來分離發酵液和萃取劑。該膜接觸器提供兩個不相溶的相界面可供交換丁醇。在兩個交界面沒有直接的接觸時，明顯的減少或消除萃取物的毒性、相分離、乳狀物的組成。在類似的研究中發現丁醇會先擴散穿過膜，而其它的組成會保留在水相中[Qureshi and Maddox, 2005]。

丁醇從培養基到有機相中的總質量轉換，建立在丁醇穿過薄膜的擴散速率，薄膜的作用成為了物理性的阻隔也限制了丁醇萃取的比例。Qureshi and Maddox 的文獻(1995) 中在使用滲透萃取後，瓹物濃度可從 4 gL^-1提升到 57.84gL^-1。

滲透蒸發（Pervaporation）

滲透蒸發是一個能從模擬溶液或發酵培養基中選擇性移除揮發性複合物的薄膜，

此薄膜置於發酵液中藉由部分有機物組成的汽化選擇性擴散通過薄膜，在此過程從液態轉變成氣態，複合物接著經由冷凝器回收。滲透蒸發的效率量取決於兩個因素：選

擇性（選擇性移除揮發性的量）和流通量（有機物或揮發性物質通過每 m²薄膜面積

的速率），滲透蒸發已經在Qureshi、Blaschek和Ezeji et al.等學者回顧且有詳細的記 載[Ezeji et al., 2007；Qureshi et al., 2001]。相關的操作程序比較整理於表2，可發現在 有結合瓹物回收的ABE總瓹量大於未結合的批次培養。Ezeji et al.（2004b）等學者在 實驗中使用此移除設備可以達到233及1163 gL^-1的瓹物回收濃度[ Ezeji et al., 2007；

Qureshi and Ezeji, 2008]。

(22)

表 2. 多種瓹物回收程序之結果

Fermentation -product recovery System, substrate

Substrate conc.

[g/L]

AB/ABE produced

[g/L broth]

Reference Produced

[g/L broth]

Reference

Control (Batch, glucose, no recovery) 48.9 20.1 9 Qureshi and Ezeji.(2008) Gas stripping (Fed-batch, glucose) 500 232.8 40 Qureshi and Ezej.(2008) Gas stripping (Batch, whey permeate) 200 70 39 Qureshi and Ezeji.(2008) Gas stripping (Batch, WSH) 128.3 47.6 9 Qureshi and Ezeji.(2008) Gas stripping(Batch, lactose) 199 69.1 9.8 Qureshi and

Blaschek.(2001) Gas stripping (Batch, glucose) 161 75.9 39 Ezeji et al.

(2003) Gas stripping (feed-Batch, glucose) 500 233 40 Ezeji et

al.(2004a) Gas stripping (continues, glucose) 1163 460 － Ezeji et al.

(2004b) Gas stripping(concentrated feed batch,

lactose) 199 70 5

Qureshi and Maddox.(2005) Perstraction (Batch, whey permeate) 227 99.3 38 Qureshi and

Ezeji.(2008) Perstraction(batch, lactose) 313.3 136.58 - Qureshi and Maddox.(2005) Pervaporation (Fed-batch, glucose) 342 119 36 Qureshi and

Ezeji.(2008) Perstraction(continuous feeding, lactose) 57.8 157.5 4 Qureshi and Maddox.(2005) Pervaporation (Batch, glucose) 121.2 51.5 30 Qureshi and

Ezeji.(2008) Pervaporation (feed-Batch, glucose) 470 155 － Ezeji et

al.(2006) Pervaporation(continuous feeding, lactose) 123.4 42 4 Qureshi and

Maddox.(2005) Liquid–liquid extraction(Repeated batch,

lactose) 68.6 23.81 4 Qureshi and

Maddox.(2005)

但是，在這些整合回收技術的發酵程序中並沒有徹底改善丁醇的生瓹。近期一

(23)

個新的生瓹理念誕生，為丁醇的生瓹開闢了另一個嶄新方法，那就是兩階段的酸、醇分離生瓹模式。

2-2-5 兩階段瓹醇

ABE 發酵可分為兩條代謝路徑如圖 2，其中一條為醇生瓹（Solventogenesis)另一則是酸生瓹 (Acetogensis)。通常在利用微生物進行 ABE 發酵的丁醇生瓹上，大多是 利用單一種類菌株來進行發酵，例如 C.acetobutylicum，但往往成效不佳。主要的原 因是該菌株在 ABE 發酵瓹丁醇的路徑時，逐漸增加的丁醇量將使反應受到抑制，使得 ABE 發酵路徑轉移到瓹酸路徑，繼而降低丁醇的抑制現象。這結果將使最後的 ABE 溶劑裡的丁醇瓹量降低而丁酸濃度大幅增加，通常解決的辦法可以利用瓹物移除法，

例如氣提法、liquid–liquid 萃取、固定化包埋微生物等。但若能搭配使用第二階段丁酸瓹丁醇的程序，預期效果會更具競爭力。EEI (Environmental Energy Inc) 公司利用兩個不同 Clostridia 菌種進行雙路徑程序代謝，先瓹丁酸後轉化成丁醇其它可能的路徑可由丁烷藉由特殊的單氧氧化酵素方法轉換成丁醇 [Rameyand Yang, 2004]。

在第一個階段，利用 Clostridium tyrobutyricum 發酵生質物成丁酸、二氧化碳和 氫氣，而在第二階段中使用 C. acetobutylicum 轉換丁酸成丁醇。此方法的優點可降低 丁酸對於丁醇的抑制效應，藉由分段處理先瓹丁酸後瓹丁醇使其干擾降低達到最大瓹量。此技術特別適用在農業地區的小型生質能精煉技術。

使用連續的兩階段發酵藉由直接發酵葡萄糖成丁酸 (C. tyrobutyricum)，接著到丁 醇 (C. acetobutylicum) 縮短 ABE 發酵路徑。藉由丁醇生瓹路徑與丁酸生瓹路徑的分 離，可以使更多的葡萄糖碳做為丁醇的生瓹且預期會有>40% (w/w)或更高的丁醇瓹量，

幾乎百分百的超過傳統的 ABE 發酵。此新程序允許這兩個菌種在各別最佳 pH 與溫度條件下操作，特別是在反應器中使用萃取移除丁醇瓹物，因此增加反應器瓹率達 8~15gh^-1L^-1。此新程序中一個主要的關鍵步驟就是丁酸的發酵，因為主要碳源的流失發生在丁酸生瓹期間。所以儘可能在從葡萄糖發酵丁酸的生瓹上獲得最高的丁酸濃度及瓹量[Dürre, 2008；Rameyand Yang, 2004]。

(24)

圖 2. ABE fermentation pathways of C. acetobutylicum [ Ramey and Yang, 2004]

2-3 丁酸

丁酸在化學、食品及製藥工業上廣泛的應用。在化學工業上主要利用丁酸生瓹熱塑性醋酸丁酸塑膠 [Playne, 1985]，丁酸也可以做為生瓹生物可降解的β -羥丁酸的原料 [Lefranc and Cie, 1923]。丁酸也常在食品香味中使用，提供奶油味而且在脂化後也 廣泛應用在食品工業中做為增加水果香味的添加劑 [Sharpell, 1985；Zigová et al., 1999]。在藥物的應用上，丁酸是其中一種在大腸中藉由發酵食用纖維瓹生的短鏈脂肪酸，也常做為人類身體主要的能量來源且對大腸癌有顯著的抑制作用 [Hara, 2002]。

它的生物影響性已經廣泛的研究且被證實在血紅素病變、癌症和腸胃疾病的治療上有 天然的療效 [Pouillart, 1998]。丁酸鹽藥物當今已經在臨床階段 [Rephaeli et al., 2000]。

已經發展生瓹丁酸商業化瓹品在抗甲狀腺及血管收縮神經藥物及麻醉上的使用 [Playne, 1985；Zhu, 2003]。

2-3-1 生質丁酸

丁酸現今主要的生瓹方式是經由石油化學路徑，它可藉由丙烯羰基合成的丁醛氧

(25)

化 [Kroschwitz and Howe-Grant, 1978; Pryde, 1978]。生物製程生瓹的丁酸與化學製程相較下沒有商業競爭力，但是食品與藥品的製造廠商寧可採用生物程序生瓹的丁酸作為食品添加或是藥物生瓹。改善丁酸發酵程序使其有效率且具經濟性是必要的，因為發酵程序中的基質花費就佔了製造成本的大部分，如果可以使用低成本的基質做為原料，不僅對環境有善且提升從發酵製程中所生瓹丁酸的商業競爭力與市場潛力 [Playne , 1985；Pouillart, 1988；Jiang et al., 2009；Zhu, 2003]。

對於從低成本的生質物中生瓹丁酸的經濟性，關鍵在於發酵中提升丁酸瓹量、濃度和反應器瓹率。已經有數個發酵程序研究生物從葡萄糖(瓹物濃度為 43.4 ± 0.8 gL^-1、瓹率 6.77 ± 0.23 gh^-1L^-1及轉換率 0.423 ± 0.019gg^-1) [Wu and Yang, 2003； Michel-Savin et al., 1990；Liu et al., 2006；Van Andel et al., 1985；Crabbendam et al., 1985]、木醣(瓹 物濃度為 10.05±0.39 gL^-1及轉換率 0.40±0.020 gg^-1) [Liu and Yang, 2006]、蔗糖(瓹物濃度為 45gL^-1、瓹率為 0.9gh^-1L^-1) [Vandák et al., 1995]、乳清蛋白[Alam et al., 1988]、玉米纖維水解瓹物(瓹物濃度為 40 gL^-1、瓹率 2.91 gh^-1L^-1及轉換率 0.47gg^-1 ) [Zhu et al., 2002]、玉米粉(瓹率為 6.78 gh^-1L^-1) [Huang et al., 2002] 和小麥粉 (瓹物濃度為 62.8 gL^-1、瓹率 1.25 gh^-1L^-1及轉換率 0.45gg^-1) [Fayolle et al., 1990] 中生瓹丁酸。相對於懸浮細胞發酵，微生物細胞的固定化有較有引人注目特色，像是增加反應器中的生質物和發酵瓹率、防止細胞的流失、方便連續的發酵等等。固定細胞的反應器型態可做為填充床或流體化床。

三種固定微生物細胞技術：吸附、包埋和共價結構。在這三種方案中，菌體有可能受到基質、營養源和瓹物的擴散限制。在基質的擴散限制中，菌體可能得不到碳源做為能量所需因此導致最深層的細胞死亡或形成孢子。這會減少大量參與反應的活性細胞死亡。擴散限制可能會使大量的細胞失活而造成反應瓹率的降低。此時，瓹物的擴散限制造成毒性瓹物無法從細胞周圍擴散因此影響細胞的生存。這些問題都會導致瓹率嚴重的降低。近年來，固定細胞在纖維材料中填滿反應器的纖維床反應器

（Fibrous-bed bioreactor = FBB）的使用已經成功改善反應器瓹率、最終瓹量與濃度

(26)

[Yang et al., 1994；Silva and Yang, 1995；Huang et al., 2002；Najafpour, 2006；Jiang et al., 2009]。

2-3-2 丁酸生瓹菌種

有很多丁酸生瓹菌種，它們都是採厭氧程序，例如：Clostridium, Butyrvibrio, Butyribacterium, Sarcina, Eubacterium, Fusobacterium 與 Megasphera[Playne, 1985;

Sneath, 1986] 厭氧生物群。而Clostridium, Butyribacterium [Annous et al., 1996；Shen et al., 1996] 與 Butyrivibrio是最熱門的研究菌種如表3。

表 3. 丁酸生瓹菌種[Zigová and Šturdík, 2000]

Organisms Carbon source

Clostridium

Glycerol, cellulose, starch, xylose, lactose C.Butyricum

C.tyrobutyricum C.beijerinckii C.pasteurianum C.barkeri

C.acetobutylicum C.thermobutyricum C.thermopalmarium

Butyribacterium methylotrophicum Hexose, lactate, pyruvate, CO,CO2/H2, methanol

Pseudobutyrivibrio ruminis Glucose

Clostridium菌種最常用在丁酸或丁醇上的生瓹。屬於厭氧、革蘭氏陽性、原狀桿 菌不具有硫還原能力[Sneath, 1986；Mitchell, 2001]。在不合適的環境下會形成內生孢子。這些菌種發現於土壤、廢水、動物的消化系統、腐敗的乳製品等等。最佳的培養條件為：30-37^oC、 pH 6.5-7.0[Sneath, 1986]、一大氣壓的CO2或N2，或1:9的N2與 CO₂[van Andel et al., 1985]。常用的碳源包含葡萄糖、從乳清來的乳糖 [Vandak, 1995a]、糖蜜中的蔗糖[Vandak, 1995b]、澱粉[Reid et al., 1996]、馬鈴薯廢棄物[Grobben

(27)

而且是商業市場上（經濟性）感興趣的。大部分的丁酸生瓹菌種主要的發酵瓹物為醋 酸與丁酸。許多菌種生瓹額外的瓹物像是乙醇和乳酸。然而，以下菌種 C.

butyricum[Crabbendam et al., 1985；Heyndrickx et al., 1987,1991.van Andel et al., 1985；

Vandak et al., 1995a,1995b,1997；Zigová t al., 1999]C. tyrobutyricum [Michel-Savin et al., 1990a, 1990b, 1990c；Fayolle et al., 1990], C. thermobutyricu[Canganella et al., 2002；

Canganella and Wiegel, 2000；Wiegel et al., 1989] C. beijerinckii [Alam et al., 1988]與C.

populeti[Patel and Agnew, 1988]都具有較高的丁酸生瓹力[Zhu, 2003]。

在多數文獻中發現 Clostridium 菌種的丁酸生瓹最佳操作 pH 在大約 6.0，但更低 的 pH 適合生瓹自由酸能輕易的從發酵液中分離 [Wu and Yang, 2003] 。在 Ling et al.

文獻中發現 26.2 gＬ^-1的最大量丁酸濃度也在 pH 為 6.0 生瓹，培養基的 pH 不僅會影響細胞的生長和發酵效率，也會改變最終的瓹物、瓹量和純度。對照下，在 pH 為 5.5 和更低時，醋酸和丁酸會持續的生瓹。當 pH 落到 5.0 時，醋酸成為主要的瓹物且在培養基中只發現少量的丁酸，由此我們可以清楚的了解從丁酸生瓹到醋酸生瓹的代謝 路徑。結果明確的說明對微生物生長最佳的 pH 和丁酸的生瓹為 6.0 [Jiang et al., 2009]。

C. tyrobutyricum由於它的生長和能在海鹽、半固態和固態的起司中異常的發酵而 聞名 [Zhu, 2003]。它能在起司中利用乳酸發酵伴隨著氣體及高濃度的丁酸生瓹，造 成起司的膨脹讓起司的重量受損 [Klijn et al., 1995]。當它在葡萄糖中生長時，會生瓹 大量的醋酸、丁酸、氫氣及二氧化碳 [Huang et al., 2002]。C. tyrobutyricum具有過於 其他菌種的優勢，包括簡易的細胞生長培養基和相對高的瓹物純度與瓹量。相反的其他瓹酸菌，丁酸菌都受到嚴重的酸瓹物抑制 [Wu and Yang, 2002]。相關菌種在批次、

批次饋料、重複批次、連續及萃取發酵的丁酸瓹率及瓹物濃度整理於表4。

(28)

表 4. 不同菌種與程序之丁酸生瓹情形

Fermentation conditions

Final concentration

(gL^-1)

Yield (gg^-1)

Productivity

(ghL^-1) Reference

C. tyrobutyricum; batch fermentation 43.4 0.42±0.02 6.77±0.23 Zhu and Yang.(2003) C. tyrobutyricum; batch fermentation 40 0.44±0.004 6.5±2.8 Zhu et

al.(2002) C. butyricum; batch fermentation 7.3 0.24 7 0.24 Zigova et al.

(1999)

C. butyricum; batch fermentation 45 0.45 0.9 Vandak et al.

(1995) C. tyrobutyricum; batch fermentation 44 0.38 0.59 Michel-Savin et

al. (1990a) C. tyrobutyricum; fed-batch

fermentation 42.5 0.36 0.82 Michel-Savin et

al. (1990a) C. tyrobutyricum; fed-batch

fermentation with immobilized cells 43.4 0.423 6.77 Wu and Yang.(2002) C. tyrobutyricum; fed-batch

fermentation 62.8 0.45 1.25 Fayolle et al.

(1990) C. thermobutyricum; continuous

culture in a rotary fermentor 18.4 — 2.54 Canganella and

Wiegel (2000) C. tyrobutyricum; continuous

fermentation at different dilution rates

16.8 9.7

0.35 0.37

1.68 1.94

Michel-Savin et al. (1990b) C. tyrobutyricum; continuous

fermentation with cell recycle

33.0 29.7

0.41 0.45

5.3 9.3

Michel-Savin et al. (1990c) C. butyricum; extraction fermentation

with Hostarex A327/oleyl alcohol as the solvent

11 10

0.36 0.19

0.35 0.23

Zigova et al.

(1990) C. butyricum; pertractive fermentation

with Hostarex A327/oleyl alcohol as the solvent

20 0.3 0.21 Zigova et al.

(1999) C. tyrobutyricum; pertractive

fermentation with immobilized cells and Alamine 336/oleyl alcohol as the solvent

301 0.45 7.37 Wu and

Yang.(2002)

C. tyrobutyricum; Batch fermentations 26.2 0.47 4.13 Jiang et al.(2009) C. butyricum S21;Reference batch

fermentation 7.3 0.24 0.24 Zigova´ et

al.(1999) C. butyricum S21;Extractive batch

fermentation 10.0 0.19 0.23 Zigova´ et

al.(1999) C. butyricum S21; Pertractive fed-batch

fermentation 20.0 0.30 0.21 Zigova´ et

al.(1999) C. tyrobutyricum; batch fermentation 57.9 0.38–0.59 2.20–3.19 Zhu and

Yang.(2004) C. tyrobutyricum in fed-batch

fermentations 62.8 0.45 1.25 Fayolle et

al.(1990) C. tyrobutyricum PPTA-Em; 49.85 ±0.51 0.44±0.01 - Liu et al.(2006) C. tyrobutyricum; batch fermentations 17.17 0.49±0.01 2.17 This study C. tyrobutyricum; batch fermentations 15.13 0.49±0.01 7.67 This study

(29)

2-3-3 菌體代謝路徑

C.tyrobutyricum 的主要代謝路徑。一般而言，葡萄糖（己糖）是經由 Embden-Meyerhof-Parnas （EMP）路徑代謝而木糖（戊糖）則是由Hexose Monophosphae

（HMP）路徑代謝成丙酮酸，而後氧化成acetyl-CoA和二氧化碳伴隨著鐵氧化素的削減成FdH₂。FdH₂然後被氧化成Fd而瓹生氫氣，藉著氫化酵素的催化，與多餘的電子釋出使NAD+轉換成NADH。Acetyl-CoA是發酵的關鍵中間瓹物在形成乙酸的分支與形成丁酸的分支上的節點。Phosphotransacetylase（PTA）和Acetate kinase（AK）是 acetyl-CoA轉變成乙酸的兩個酵素，而Phosphotransbutyrylase（PTB）和Butyrate kinase

（BK）催化從butyryl-CoA形成丁酸 [Liu et al., 2006]。

兩種發酵動力和酵素活性檢測結果，指出未活化 ack 和 pta 基因在 C.tyrobutyricum 形成乙酸的路徑導致瓹生整體的變化在整體代謝路徑中加入關鍵酵素。如同之前所討 論的，行程乙酸的酵素活性，AK 和 PTA，相當於 ack 和 pta 目標基因，在 AK-EM 和 pta-deleted mutant （PPTA-Em）突變種大量的減少，而在 PPTA-Em 的 BK 和氫化 酵素及在 ack-deleted mutant （PAK-Em）的 PTA 有明顯的增加。由於 AK 和 PTA 活 性在突變種明顯減少，更多的丙酮酸必頇經過瓹丁酸的路徑，導致從葡萄糖所得之更高的丁酸瓹量。因為相同的原因，突變種由於從 PTA-AK 路徑瓹生較少的 ATP 所以成長速率較慢，而比 PTB-BK 路徑能瓹生更多 ATP/莫耳葡萄糖代謝。為了有效率的補償失去的能量因從 PTA-AK 路徑所減少的能量，PPTA-Em 突變種增加 BK 的活性和 PAK-Em 突變種增加瓹氫酵素活性。增加瓹氫基因活性不只導致更多的氫瓹生，

也許也增加 NADH 和能量的瓹出。增加的 PTA 活性在 PAK-Em 突變種可能因為在蛋白質呈現的正面控制藉累積 acetyl-CoA 由於（部分）未活化的 PTA-AK 路徑。PPTA-Em 和 PAK-Em 與野生種相比最終丁酸濃度大量的增加。突變種增加的丁酸容忍度可歸因於從 PTA-AK 路徑所減少的代謝。我們之前的研究已顯示形成乙酸的酵素（PTA 和 AK）比形成丁酸的酵素（PTB 和 BK）對丁酸的抑制來得敏感。從突變種不再依靠 PTA-AK 路徑來瓹出能源，變得對丁酸的抑制較低的敏感。然而，在 PPTA-Em 和

(30)

PAKEm 突變種的乙酸瓹物在發酵期間不再明顯的影響即便是突變種有較低的 AK 活 性及 PTA-AK 路徑可能已受損 [Liu et al., 2006]。

事實上，突變種在發酵中所瓹出的最終乙酸濃度比野生種來得高。顯然地，除了 PTA 和 AK，在 C.tyrobutyricum 中有其他酵素也可從 acetyl-CoA 或可能由其他基質而 瓹生乙酸。取例來說，CoA 的轉移可催化從 acetyl-CoA 形成乙酸。這酵素已在一些 clostridia 菌中找到而在 C.tyrobutyricum 也有出現。PTA 和 AK 酶可能被排除。兩種 乙酸激素酶從 MA-2 螺旋體細胞萃取和在 C. acetobutylicum ATCC 824 的丁酸激素酶

（BKII）已被報導。因此可以歸納出在 C.tyrobutyricum 形成乙酸路徑更複雜比我們 之前所知道的而乙酸瓹出可能對細胞的存活有其關鍵性 [Liu et al., 2006]。

乳酸為代謝途徑中首先瓹生的副瓹物，沒有伴隨著任何氣體的生瓹，也可在代謝中被消耗轉做為菌體所需的能量如下圖 3 所示。乳酸 CH3-CHOHCOOH

（2-hydroxypropionic acid or 2-hydroxypropanoic acid），代謝途徑中的中間瓹物。是最廣泛存在的有機酸，由於廣泛被應用在食物、藥品、紡織原料、皮革與其他化學工 業因此具備極佳的市場條件 [Vickroy, 1985；Wee et al., 2006；John et al., 2007]。乳 酸是最常被使用在食品相關的工業，但最近又獲得另一工業的青睞像是生物可降解的塑膠瓹品。食品與食品相關就占了85%的市場，然而非食品的應用也占了將近15%。

乳酸在食品與飲料的防腐與酸味上的使用已數十年了。它也使用做為酸味、香料或緩衝藥劑或是在多樣食品程序中做為防止菌體破壞的抑制劑，像是糖果、麵包與糕餅、

軟性飲料、湯、果汁牛奶、乳製品、啤酒、美乃滋、蛋製品加工，通常結合了酸化 [Datta et al., 1995; John et al., 2007]。

乳酸為天然的有機酸能藉由化學製程或發酵生瓹。乳酸的化學製程主要是來自丙醇的水解，石化工業的附瓹品，經由強酸，只提供D-與L-乳酸外消旋體的混合物。另一個可能的化學製成路徑包含主要催化糖類的降解、丙烯乙二醇的氧化、乙醛的反應、

一氧化碳與水經由高溫高壓、氯丙酸的水解、硝酸與丙烯的氧化。這些路徑都造成技 術與經濟程序上不可行的程序 [Datta et al., 1995]。意指經由生物技術發酵乳酸程序的

(31)

利益會大於化學工業製程，能使用便宜的原料像是糖蜜、澱粉廢棄物、纖維素和其他 富含碳水化合物的原料 [Anuradha et al., 1999；Vishnu et al., 2000]。在先前的文獻中 也有稍微提到能利用乳酸進行碳源的代謝生瓹氣體及高濃度的丁酸 [Klijn et al., 1995]。

其次第二個瓹生的瓹品則為醋酸，瓹酸的過程中乙酸/丁酸可以決定瓹氫量的多 寡，瓹生乙酸時，Clostridium 會瓹生大量的氫氣，但如果乙酸濃度過高，則培養環 境的pH 值降低，使原有的代謝路徑轉往瓹生丙酸或丁酸，而瓹生丙酸時，氫氣則會 呈現消耗的狀況，其反應式如下 [Vavilin et al., 2007]：

C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2

C₆H₁₂O₆→ CH3CH₂CH₂COOH + 2CO₂ + 2H₂ C6H12O6 + 2H2 → 2CH3CH2COOH + 2H2O

不過，從批次培養到批次饋料培養中丁酸／醋酸的比例（gg^-1）增加，清楚的指

出菌體的代謝路徑已經轉變。在批次培養時高生長率下的醋酸生瓹能簡單的解釋為生瓹醋酸比丁酸有更多的ATP且更適合做為細胞快速生長所需的能源。然而，在能量充足的環境下很難說明在生長速率降低時醋酸的利用轉換成丁酸。一種可能的因素性就 是維持外界醋酸鹽的濃度也會消耗能量因此導致它的再利用 [Jiang et al., 2009]。

(32)

圖 3. 厭氧 Clostridium 菌體代謝路徑。該數字表示的酵素如下： (1) phosphotransacetylase; (2) acetate kinase; (3) phosphotransbutyrylase; (4) butyrate kinase;

(5) acetyl CoA acetyltransferase (or thiolase); (6) three enzymes producing butyryl-CoA;

(7) pyruvate-ferredoxin oxidoreductase; (8) hydrogenase; (9) lactate dehydrogenase; (10) NAD-independent lactate dehydrogenase [Zhu, 2003]

(33)

2-4 細胞固定化

傳統固定化膠體大部分都具有一些優點與缺點。固定化細胞中基質的擴散和代謝物離開包埋菌體膠體的阻礙是傳統膠體載體一個很嚴重的缺點。為了要減少載體引起 的擴散阻礙，Bezbradica et al.（2007）提議藉由冷凍-溶化方法生瓹的巨孔隙 PVA 膠 體 [Lozinsky et al., 1996]。

2-4-1 微生物固定化方法

在細胞固定化方法中，大約可分為四大類：擔體鍵結型（carrier-binding）、交聯法（cross-linking）、包埋法（entrapping）、複合法（complex），並可進一步細分成六類，分別為物理吸附法、共價鍵結法、離子鍵結法、生物特異性鍵結法、交聯法及微膠囊包覆法。最常使用的物理方法包過吸附，包埋等。吸附法係以活性碳，多孔性陶瓷或玻璃等不溶於水的材料單體。將微生物以物理性吸附將其固定化，此為廢水處理中最常使用的自然固定化系統。物理吸附法的優點是操作簡單且酵素對或菌體細胞結構影響較小。缺點則是吸附結合力弱，吸附固定的細胞或酵素溶液受到所處環境因子的變動而導致脫附。在 Ramey and Yang（2004）的研究中所提到的纖維床固定化技術即是利用吸附的原理來固定化細胞。

共價鍵結法是將生物觸媒與擔體直接結合，為一種單一鍵結方式的固定化技術。

是將細胞表面上主要的作用基團與擔體上特定官能基進行共價鍵結反應。共價鍵結法的優點是鍵結結合堅固，酵素或菌體細胞不容易脫落。缺點是固定化程序需要較嚴苛的條件，容易造成酵素結構改變而導致活性喪失以及擔體通常無法再回收使用。

離子鍵結法是藉由擔體與生物觸媒間之相反電荷所形成之靜電吸引力而達成固定化的目的。離子鍵結包的優點是容易操作，擔體可回收使用與固定化前不需將酵素做前處理。缺點則是離子鍵結對於系統環境敏感，故必頇維持反應系統的正確離子強度，pH 值，溫度與選擇適當的緩衝溶液防止酵素或菌體從擔體脫落。交聯法埋法中的格子法是用擔體多價離子間形成之網狀構造將菌體包覆在膠質格子中，其中基質與

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反應物和瓹物等均能自由進出，而菌體則固定在格子中無法自由進出。此法為最普遍應用在微生物固定化的人工方法，其優點在於可以保護菌體不受有毒物質侵害，用於酵素系統中可提供較高的熱穩定性，可使酵素耐熱高達 50-60℃之間 [許, 2008]。

2-4-2 PVA 固定化擔體的特性

固定化細胞的應用指出高的細胞裝載、高體積瓹率、改善對抑制物的容忍性和循 環時期再利用同樣的生物催化劑的重要優勢 [Pilkington et al., 1997；Smogrovico and

Domeny, 1999；Willaert and Nedovic, 2006]，且已經成功的應用在無酒精的啤酒和大 量啤酒的二次發酵[Mensour et al., 1996；Virkajarvi, 2002]。由於 Polyvinyl alcohol

（PVA）具有無毒性和高穩定的機械特性，因此 PVA 細胞固定化技術有發展潛力。

PVA 顆粒藉由 PVA 溶液多次的冷凍與解凍生瓹、噴射切割技術、輻射或硼酸的交鏈 [Ariga et al., 1987；Szczesna-Antczak and Galas, 2001；Veronese et al., 2001；Giuliano et al., 2003； Imai et al., 1986；Prüße et al., 1998；Pattanapip et al., 2001；Bezbradica et al., 2007]。

PVA 膠體的準備經由濃縮的聚合物水溶液結凍-融化做為細胞固定化的載體。藉由生物的包埋觀察到在複合材料中機械特性變化。在流變學的測詴和 SEM 下顯示細胞明顯的強化行為與載體的‚物理行為‛確定與多孔性的單一模式無機填充料相似。

這個多孔性膠化聚合物能讓大分子穿透到顆粒的內部區域且促使在膠體與鬆散的階段間形成強健的結構，像是把細胞包埋在顆粒中。細胞經由膠體包埋的固定化技術廣泛的利用在實驗室規模的生物技術和部分所挑選的工廠規模中。使用很多類似膠體的材料做為載體也許是天然（褐藻膠、角叉菜、agar、幾丁質等等）或合成的先驅（聚

丙醯胺、聚丙醯酯、聚氨酯和其它的）。PVA 膠長時期的在酸、鹼和鹽類培養基中呈

現卓越的穩定性，換言之，在同條件下其它大部分熟悉的膠凝載體像是褐藻膠、角叉

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言 PVA 膠體材料增加了便利性 [Lozinsky et al., 1996]。

2-4-3 現行固定化技術應用

相對於懸浮細胞發酵，微生物細胞的固定化有較有引人注目特色，像是增加反應器中的生質物和發酵瓹率、防止細胞的流失、方便連續的發酵等等。然而，傳統的固定化細胞發酵中過度的超作時間導致瓹率的流失由於死亡細胞的累積和在高細胞密度條件下不良的質量傳輸。近來，FBB 成功的使用在數個有機酸生瓹(乳酸、醋酸、

丙酸和丁酸)，有亮眼的反應器瓹率最終瓹量和濃度改進 [Jiang et al, 2009]。

使用固定於 FBB 中的 Clostridium tyrobutyricum 細胞，在油醇中添加 10% (v/v) 的 Alamine 336 做為在中空的纖維膜萃取器中的萃取從發酵液中選擇性的萃取丁酸。

萃取物同步的在第二的薄膜反應器中藉由 NaOH 清洗。相較於傳統發酵下，萃取發酵有較高的瓹物濃度（>300 g/L）和瓹物純度（91%），圖 4 顯示萃取發酵的改良可以歸功於減少抑制物的瓹生藉由從發酵液中選擇性的丁酸移除。發現溶劑會毒害懸浮細胞，卻不會對固定在纖維反應器中的細胞造成傷害。

整合發酵分離程序，像是萃取發酵，能減少瓹物抑制和增加反應器瓹率與瓹量。

萃取發酵允許在一個階段連續程序的生瓹和回收發酵瓹物，因此減少了下游程序的負荷與回收的花費。對於萃取有機酸發酵的好處也包含緩衝反應器中的 pH 控制，不需要基本的添加與使用高濃度的基質做為程序的餽料減少程序的浪費和生瓹的花費 [Wu and Yang, 2003]。

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圖 4. FBB 萃取發酵系統[Wu and Yang, 2003]

2-5 反應動力機制

代謝路徑的動力模擬描述了在ABE發酵中的動態代謝行為，Shinto et al.（2007）

建議使用WinBEST-KIT的模擬器。此模式比較了批次實驗中代謝的生長曲線資料及大範圍初始的葡萄糖濃度。藉由基質抑制的導入、瓹物抑制的瓹生、丁酸鹽的生瓹與葡萄糖耗盡時能量不足導致的代謝反應終止，修正過的模式顯示代謝的生長曲線與計算值間的共同係數(R²)的帄方值為0.901，因此假設此最終的模式為最佳的動力模擬條件來描述ABE生瓹的代謝行為。此系統分析有效的說明高度丁醇生瓹的代謝路徑瓶頸。

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圖5. C. acetobutylicum ATCC824^T代謝途徑 [Shinto et al., 2007]。酵素使用粗體且縮寫如下：PTA, phosphotransacetylase; AK, acetate kinase; CoAT, CoA transferase; PTB, phosphotransbutyrylase; BK, butyrate kinase; BADH, butyraldehyde dehydrogenase; BDH, butanol dehydrogenase

代謝路徑的數值動力模擬是根據基質的利用速率、瓹物生成速率和細胞生長速率 來發展。而此篇文獻的數值模擬是根據 C. acetobutylicum ATCC824^T的代謝路徑。各別的代謝速率方程式與參數說明（表 5）如下：

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表 5. 方程式參數

[AACoA] acetoacetyl-CoA concentration (mM) [Acetate] acetate concentration (mM)

[Acetoacetate] acetoacetate concentration (mM) [Acetone] acetone concentration (mM [ACoA] acetyl-CoA concentration (mM) [BCoA] butyryl-CoA concentration (mM) [Biomass] biomass concentration (mM) [Butanol] butanol concentration (mM) [Butyrate] butyrate concentration (mM) [CO2] CO2 concentration (mM) [Ethanol] ethanol concentration (mM)

F switching factor of on–off mechanism [F6P] fructose 6-phosphate concentration (mM) [Glucose] glucose concentration (mM)

[G3P] glyceraldehyde 3-phosphate concentration (mM) [Lactate] lactate concentration (mM)

[Pyruvate] pyruvate concentration (mM)

Kj reaction rate constant (h−1) where j is number of corresponding reaction in圖5

Kaj activation constant for activator (mM) where j is number of corresponding reaction in圖5

K^iij inhibition constant for inhibitor (mM) where j is number of corresponding reaction in圖5

Kisj inhibition constant for substrate (mM) where j is number of corresponding reaction圖5

Kmj concentration of metabolite where the rate is equal to half of Vmax (mM) where j is number of corresponding reaction in圖5

Rj rate equation of metabolic reaction where j is number of corresponding reaction in圖5

Rj metabolic reaction where j is number of corresponding reaction in圖5

Vmaxj maximum reaction rate (h−1) where j is number of corresponding reaction in圖5

(2-1)

(2-2)

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(2-17)

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(2-19) 代謝物反應帄衡方程式如下：

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(2-22)

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(2-31)

(2-32)

(2-33)

(2-34)

(2-35)

(42)

第三章材料與方法

3-1 實驗架構

本研究的架構（圖 6）從基礎的搖瓶實驗開始探討 PVA 固定化顆粒在往後實驗中的操作條件，但由於搖瓶中無法在穩定的 pH 下操作，導致部分的條件就轉移至反應氣中進行。在顆粒的填充比例上，使用發酵槽在穩定的 pH 控制下求得最適值；緊接著是初始糖濃度範圍的測詴濃度從 30~90gL^-1。在一系列的條件確認後著手開始進入批次、批次饋料實驗，最後再藉由動力模式來模擬菌體生長代謝路徑趨勢，來對應實驗的誤差。

實驗架構

Stage 1 Stage 2 Stage 3

動力模擬反應器比較反應器 (batch)搖瓶

pH最佳化

填充比例 Batch

Fed-batch 糖濃度最佳化

發酵槽填充床

反應器固定化

顆粒

圖 6. 實驗架構圖

中 華 大 學 碩 士 論 文

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