4-1 搖瓶批次背景實驗
在基本的搖瓶批次實驗中，主要為微生物的生長曲線，以及最佳化 pH 的探討，
以驗證 PVA 固定化 C. tyrobutyricum 顆粒所適的 pH 是否與懸浮菌株的行為相仿。
4-1-1 微生物生長曲線
搖瓶批次實驗中分別對固定化與懸浮 C. tyrobutyricum 進行生物生長曲線詴驗，
以觀察其生物生長狀況。懸浮與固定化 C. tyrobutyricum 顆粒皆使用 163ml 的氣密 瓶（Agilent）進行實驗。圖 17、圖 18 分別為懸浮與固定化 C. tyrobutyricumy 顆粒 在搖瓶中菌體生長的狀況。實驗結束後分別測得瓶中發酵液的 pH，懸浮與固定化 顆粒分別為 3.68 與 3.63，而固定化顆粒內的 pH 為 3.73。
由於此實驗是在搖瓶中操作，當搖瓶中的 pH 降至 4 左右時細胞便不再生長 瓹酸也就此終止。由圖 17 我們可以發現，在懸浮 C. tyrobutyricum 的生長曲線中 細胞在 20 小時後到穩定，而葡萄糖利用也在此停止，最終丁酸濃度為 3.0gL-1。 反觀固定化顆粒的結果如圖 18，固定化顆粒內細胞在 20 小時達到穩定，而顆粒 外所生長出來的懸浮細胞大約在 40 小時後達到穩定生長的情形。而且在葡萄糖利 用方面與懸浮細胞相較下有較佳的瓹率，丁酸生瓹的最終濃度為 5.31 gL-1。
根據這兩個結果，我們可以察覺到固定化顆粒包埋的菌體除了保護菌體不流失外，
對於在 pH 處於不理想時相較懸浮細胞還是有較高的丁酸生瓹，證明 PVA 顆粒具有些 許緩衝能力，使菌體在酸性環境中還能代謝生瓹丁酸。
0 20 40 60 80 100 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0 20 40 60 80 100
0 6 12 18 24 30
Free Cell Concentration
Glucose Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 17. 懸浮 C. tyrobutyricum 細胞之搖瓶生長曲線
0 20 40 60 80 100 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
0 20 40 60 80 100
0.00 0.04 0.08 0.12 0.16
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Immobilized Cell Concentration Free Cell Concentration
Glucose Acetate Lactate Immo b ili ze d C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 18. 固定化 C. tyrobutyricum 顆粒生長曲線及顆粒內蛋白質探討
4-2 pH 最佳化探討
為了求得本實驗所使用的 C. tyrobutyricum 最佳 pH 值條件，分別在搖瓶中使用緩 衝溶液配製不同的 pH 值分別為 pH 4、 5、 6 、7 、8 且在 37oC 厭氧狀態下發酵培 養，來探討菌體生長及代謝物瓹量。根據圖 19 的結果顯示證實 C. tyrobutyricum 在 pH 6 時，有最佳生長速率及最大丁酸濃度與文獻相符。以上評估的最佳化結果將會做為 發酵槽操作時的最佳條件。
0 5 10 15 20 25
0 10 20 30
0 10 20 30 40 50
0 2 4 6 8
0 5 10 15 20 25
0 1 2 3
pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8
Glucose Concentration (g/L)pHButyrate (g/L)
Time (hr)
圖 19. C. tyrobutyricum 在不同 pH 條件下之生長情形及瓹物變化
4-3 發酵槽中丁酸發酵之探討
4-3-1 葡萄糖濃度探討
為了求得固定化 C. tyrobutyricum 顆粒最佳的葡萄糖轉換率，使葡萄糖轉換到丁 酸的代謝效率達到最高值，而不浪費在菌體的生長上。最大差異在於 pH 可以調整。
本次實驗在槽體中先固定顆粒的含量與 pH 後進行，批次實驗中分別使用了 30gL-1、45gL-1、60gL-1、70gL-1、80gL-1、90gL-1 的葡萄糖濃度來探討轉換率，分別 如下圖 20～圖 25。實驗的結果顯示在 30gL-1時有最佳 0.49gg-1的碳轉換率。此外，
在使用糖濃度與丁酸濃度作圖時也得到相同的結果。根據圖 26 中顯示在 60gL-1時有 最大細胞生長量與瓹物濃度，但其丁酸轉換率並不理想。
0 20 40 60 80 0.00
0.03 0.06 0.09 0.12
0 20 40 60 80
0 6 12 18 24 30
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 20. 固定化 C. tyrobutyricum 在 30g L-1 glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果
0 20 40 60 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0 20 40 60
0 10 20 30 40 50
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 21. 固定化 C. tyrobutyricum 在 45g L-1 glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果
0 20 40 60 80 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0 20 40 60 80
0 10 20 30 40 50 60
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 22. 固定化 C. tyrobutyricum 在 60 g L-1 glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果
0 20 40 60 80 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
0 20 40 60 80
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 23. 固定化 C. tyrobutyricum 在 70 g L-1 glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果
0 20 40 60 80 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0 20 40 60 80
0 20 40 60 80
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 24. 固定化 C. tyrobutyricum 在 80 g L-1 glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果
0 20 40 60 0.00
0.01 0.02 0.03 0.04
0 20 40 60
0 20 40 60 80
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 25. 固定化 C. tyrobutyricum 在 90 g L-1 glucose 批次條件下的丁酸生瓹結果
0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
OD Butyrate
O D
600Glucose Concentration (g/L)
Bu tyra te (g /g )
圖 26. 糖濃度對 C.tyrobutyricum 生長及丁酸生瓹之影響
4-3-2 顆粒填充量之影響
在求得最佳 pH 與葡萄糖含量條件後，接著要探討在 3L 工作體積中固定化顆粒 最佳的要添加百分比。實驗中我們分別以 10% 、 20% 、 30% 也就是分別為 300g 、 600g 、 900g 三組不同的顆粒添加量來探討，實驗中我們在 3L 的培養基中添加 30gL-1的葡萄糖、pH 為 6.0、槽體溫度為 37 oC。實驗結果分別顯示在圖 27～圖 29。
根據實驗結果中顯示，在 3L 工作體積中添加 20% 的顆粒填充量有最佳丁酸量瓹生
（圖 30）。顆粒內菌體濃度為帄均為 3gL-1，在稍後章節會有詳細的探討。
0 20 40 60 0.00
0.08 0.16
0 20 40 60
0 10 20 30
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 27. 固定化顆粒 10%(300g)在 30 g L-1 glucose 培養液中懸浮細胞生長情形及 瓹物分析結果
0 20 40 60 80 0.00
0.04 0.08 0.12
0 20 40 60 80
0 10 20 30
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 28. 固定化顆粒 20%(600g)在 30 g L-1 glucose 培養液中懸浮細胞生長情形及 瓹物分析結果
0 20 40 60 0.0
0.1 0.2 0.3
0 20 40 60
0 10 20 30
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 29. 固定化顆粒 30%(900g)在 30 g L-1 glucose 培養液中懸浮細胞生長情形及 瓹物分析結果
300 450 600 750 900 5
10 15
Concentration (g/L)
Immobilized Particle Volume (mL) Butyrate Acetate
圖 30. 顆粒填充量對發酵槽反應系統丁酸及醋酸發酵之影響
4-4 乳酸於不同反應器批次實驗
實驗前為了確認此反應系統是否為一穩定的 CSTR 系統，我們在其出入口端取樣，
觀察進出口的濃度變化的差異性。由圖 31 可知其出入口端的濃度差很小，可視為一 穩定 CSTR 的系統。
0 25 50 75 100
0 7 14 21 28 35
0 25 50 75 100
0 5 10 15
0 25 50 75 100
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6
0 25 50 75 100
0 5 10 15 20 25
out in
glucose (g/L) lactate (g/L)
acetate (g/L)
Time (hr)
butyrate (g/L)
Time (hr)
圖 31. 填充床進出口端濃度變化
4-4-1 批次實驗
本實驗研究解果發現，乳酸為在代謝過程中為最主要的附瓹品，與先前
Liu et al.(2006)實驗中醋酸為主的附瓹品不同。在 Jiang et al.學者(2009)的文獻中提到，
副瓹品最終雖都會被利用、轉換成丁酸。而在 Ramey and Yang(2004)文獻中提到減少 代謝路徑的轉換提升瓹物濃度的觀點下， 我們將乳酸作為碳源減少路徑的轉換。
所以如果在乳酸的轉換率上可以有所突破，則對葡糖糖的碳轉換率也會有所提升，
換句話說也就是間接提升葡萄糖的轉換率。
在批次葡萄糖實驗中，發酵槽體與填充床反應器的最終濃度差不多，但是反應器 瓹率卻因為填充床的反應體積小而有了很大的差異；填充床在反應菌體體積上大約只 有發酵槽的 1/3，填充床中菌體顆粒的填充重量為 84gL-1，而發酵槽的菌體顆粒量為 200 gL-1。圖 20 與圖 32 分別為發酵槽和填充床對相同葡萄糖濃度的批次實驗結果。
其反應器瓹率分別為 1.5 gh-1L-1與 2.34 gh-1L-1。
0 10 20 30 40 50 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0 10 20 30 40 50
0 7 14 21 28 35
Free Cell Concentration Glucose Lactate Acetate Butyrate
F re e C e ll C o n ce n tra ti o n (g /L ) C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
圖 32. 填充床中 30gL-1葡萄糖批次實驗結果
由圖 28 和圖 32 得知本實驗研究中兩座反應系統都會有乳酸的瓹生，然後再被利 用代謝完全。這也引發對實驗設計的另一個興趣，假如在初始條件中就供應乳酸，這 樣是否會抑制發酵過程中乳酸的代謝？或是加快乳酸的代謝？所以在批次實驗中也 做了乳酸抑制的實驗順便觀察其乳酸的利用狀況。添加的乳酸濃度分別為 5gL-1 、10 gL-1 、15gL-1與 20gL-1；如圖 33 所示，實驗中我們發現在初始環境中含有低乳酸濃 度 5gL-1 、10gL-1時對發酵過程中乳酸的生成是沒有抑制現象瓹生的，此結果顯示於 圖 33 中的 a、b。圖中 b 組實驗在開始時便有丁酸的瓹生是因為實驗誤差所導致的結 果。不過，比較有趣的是在圖 33 c 這組含有 15gL-1乳酸的實驗中。此組實驗過程中 乳酸瓹物並沒有上升而且是迅速的利用、轉換。此階段的乳酸轉換率為 0.75gg-1比從 葡萄糖轉換到丁酸的效率還高；而在 d 圖 20gL-1的條件下由於初始葡萄糖濃度低很快 的就被代謝完畢，此時的乳酸轉換率為 0.58gg-1。
根據這些結果我們推估了一下這三者的關係，如同先前第三章中建立的反應機制。
第一，當葡萄糖濃度高時，如果：(1)葡萄糖轉換到乳酸的量大於到丁酸的量，而且(2) 乳酸轉換到丁酸的機制緩慢於葡萄糖的代謝，即造成乳酸的累積如圖 33 中的 a、b。
第二，在糖濃度減半與乳酸兩者並存時，由圖 33 c 中我們發現的確沒有乳酸累積的 現象；使葡萄糖轉換成丁酸的量大於到乳酸，而轉換途中所代謝出來的能量或酵素便 成為了提供乳酸代謝所需的能量，使乳酸轉換成丁酸的速率提升。由此可見，乳酸做 為碳源的利用上是需要葡萄糖來輔助加快乳酸的轉換。
0 20 40 60 80 0
8 16 24 32
0 20 40 60 80
0 5 10 15 20 25
0 20 40 60 80
0 5 10 15 20
0 20 40 60 80
0 4 8 12 16 20 24
C o n ce n tra ti o n (g /L )
a
C o n ce n tra ti o n (g /L )
b
Glucose Lactate Acetate Butyrate
C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
c
C o n ce n tra ti o n (g /L )
Time (hr)
d
圖 33. 乳酸代謝實驗。圖中 a 為 5gL-1乳酸與 30gL-1葡萄糖; b 為 10gL-1乳酸與 30gL-1 葡萄糖; c 為 15gL-1乳酸與 15gL-1葡萄糖; d 為 20gL-1乳酸與 10 gL-1葡萄糖
4-5 不同反應器之批次饋料實驗
批次饋料實驗中，除了葡萄糖批次饋料外，也做了乳酸批次饋料。葡萄糖批次饋 料實驗在發酵槽中進行，整合上述實驗中求得的最佳操作條件：pH 值為 6、葡萄糖 濃度為 30 gL-1而溫度則使用文獻中的最適溫度 37oC。實驗過程中每隔 24 小時饋料一 次共三次，在特定間隔時間中取點分別觀察其外部懸浮菌量、顆粒內蛋白質、氣體及 液態瓹物濃度。而在四次批次實驗中藉著洽當的葡萄糖饋料時間，使得第二次的丁酸 生瓹速率相較於第一次實驗有所提升。分別顯示於圖 34 到圖 37，而其丁酸瓹率分別 為 2.06gh-1L-1、3.26 gh-1L-1、2.5 gh-1L-1、3.33 gh-1L-1；而其餘比較結果顯示於表 12。
有關這些圖中的蛋白質變化在下一個章節中會解說，為什麼顆粒內測得的蛋白質會有 如此巨大的變化。
另一方面，乳酸批次饋料實驗在填充床中進行。發酵開始在初始濃度 30gL-1 葡 萄糖、37oC、pH 6 與 250rpm 下開始實驗。實驗在 24 小時後葡萄糖完全利用完畢，
其主要瓹物為丁酸但卻也伴隨著中間瓹物－乳酸的生瓹。以往在傳統的批次饋料中都 是進料葡萄糖做為碳源供菌體生長，此時我們根據學著們在文獻中提到，縮短代謝路 徑的理念，改用添加乳酸的方式用乳酸來取代原本的葡萄糖做為碳源供菌體成長。在 第 40 小時時開始添加 10gL-1的乳酸，並且觀察瓹物與懸浮菌液的吸光值如圖 38。我 們從當中可以發現，在沒有任何葡萄糖的條件下，乳酸也是可以成為菌體的碳源進而 轉化為丁酸，但是，從圖 38 與圖 33 中可以觀察到當乳酸做為主要碳源時，不管是乳 酸的利用或是丁酸的生瓹均沒有預期中的理想。乳酸在此時沒有葡萄糖的環境下的轉 換率為 0.42g 丁酸/g 乳酸。
值得注意的一點，在圖 38 中第 140 小時時我們同時進料了 10gL-1的乳酸與 2gL-1 的葡萄糖，我們發現其乳酸的利用有稍微的提升到 0.56gg-1，扣除實驗原本葡萄糖的 轉換率外，整體的乳酸轉換率提升到 0.78gg-1。推估葡萄糖在菌體的代謝上除了可供 其代謝外應該還可以使菌體分泌一些酵素或是電子攜帶者（像是 ATP、NADH 等等）