材料與方法

3-1 實驗架構

本研究的架構（圖 6）從基礎的搖瓶實驗開始探討 PVA 固定化顆粒在往後實驗 中的操作條件，但由於搖瓶中無法在穩定的 pH 下操作，導致部分的條件就轉移至反 應氣中進行。在顆粒的填充比例上，使用發酵槽在穩定的 pH 控制下求得最適值；緊 接著是初始糖濃度範圍的測詴濃度從 30~90gL^-1。在一系列的條件確認後著手開始進 入批次、批次饋料實驗，最後再藉由動力模式來模擬菌體生長代謝路徑趨勢，來對應 實驗的誤差。

實驗架構

Stage 1 Stage 2 Stage 3

動力模擬反應器比較反應器 (batch)搖瓶

pH最佳化

填充比例 Batch

Fed-batch 糖濃度 最佳化

發酵槽 填充床

反應器 固定化

顆粒

圖 6. 實驗架構圖

3-2 菌種

1. 菌種來源

C.tyrobutyricum（ATCC 25755；BCRC 10639）取自財團法人食品工業發展研究 所生物資源保存及研究中心。

2. 菌種保存

C.tyrobutyricum 以孢子型態儲存。將菌液使用 RCM 培養基在 37℃培養 7 天後，

培養 7 天之菌液經熱震盪後再用 RCM 培養基培養，當菌液 OD 值在 3 時用 tip 吸取 10μl 到固態 RCM 培養基中用 L 型玻璃棒抹盤，將培養皿放到厭氧盒中以 37℃培養 約兩天後會有菌落長出，將厭氧盒冰到 4℃冰箱中冷藏備用。取 0.5ml 菌液與 1ml 甘 油（40%）混合置與 2ml 離心管中放入-20℃冰箱中。

3. 菌種活化

C.tyrobutyricum（ATCC 25755）是完全厭氧菌，空氣中的氧氣對此菌本身會有毒 害的影響，因此所有操作過程皆需在厭氧操作檯內進行。厭氧操作台使用前用酒精消 毒清理並開紫外燈 20 分鐘，接著在操作檯中抽氣四次與灌氮氣三次將空氣抽出置換 入氮氣，以確保厭氧狀態。

菌液與培養皿的保存與培養也需在厭氧盒中，並依據厭氧盒體積大小放入厭氧瓹 氣包。厭氧瓹氣包可吸收氧氣並瓹生二氧化碳。此外，還頇在厭氧盒中放入厭氧詴紙。

厭氧詴紙在無氧時為白色，當有氧時會變成藍色以此來判斷厭氧盒內的厭氧狀態。而 培養基中需加入 Resazurin 厭氧指示劑，有氧時會呈現微紅狀態，無氧時則為原本培 養基的顏色。

將儲存於 4℃菌種取出用 5ml RCM 培養基與 10ml 體積氣密瓶中培養活化，RCM 培養基使用前頇滅菌。菌種培養在 37℃下 18 小時後即可明顯發現有細胞生長及伴隨 的氣體瓹生。

3-3 藥品詴劑與培養基

實驗中除了RCM為複合培養基外，工作培養基（表9）、緩衝溶液等均分開配

製。配製方法分別如下：

1. 緩衝溶液製作：

在搖瓶實驗中因為無法控制 pH，所以使用緩衝溶液來維持較長時間的 pH 穩定。

不同 pH 緩衝溶液配製如下表 6、表 7：

Citric acid- Na2HPO4（McIlvaine）buffer solutions, pH approx 2.6~7.6（McIlvaine, JBC 49, 183（1921））Citric acid monohydrate, C₆H₈O₇ · H₂O, M. wt. 210.14；0.1 M-solution contains 21.01g L^-1. Na2HPO4, M. wt. 141.98；0.2 M-solution contains 28.4 gL^-1. Na₂HPO₄ · 2H₂O, M. wt. 178.05；0.2 M-solution contains 35.61 g L^-1. x ml 0.1 M-citric acid and y ml 0.2 M- Na2HPO4 mixed.

表 6 . Citric acid- Na₂HPO₄

pH x ml 0.1 M-citric acid y ml 0.2 M-Na2HPO4

4 61.45 38.55

5 48.50 51.50

Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ buffer solutions, pH 5.8~8.0

（Gomori, after Sorensen, Meth.Enzymol.1,143（1995））

Na₂HPO₄ · 2 H₂O, M. wt. 178.05；0.2 M-solution contains 35.61 g L^-1. NaH2PO4 · 12 H2O, M. wt. 358.22； 0.2 M-solution contains 71.64 g L^-1. Na₂HPO₄ · H₂O, M. wt. 138.01；0.2 M-solution contains 27.6 g L^-1. NaH2PO4 · 2H2O, M. wt. 156.03；0.2M-solution contains 31.2 g L^-1. x ml 0.2 M- Na₂HPO₄, y ml 0.2 M- NaH₂PO₄ ;diluted to 100 ml with H₂O.

表 7. Na2HPO4-NaH2PO4 buffer solutions

pH x ml 0.2M- Na₂HPO₄ y ml 0.2M- NaH₂PO₄

6 6.15 43.85

7 30.5 19.5

8 47.35 2.65

2. 培養基製作

RCM（Reforced Clostridium media）培養基為維持培養基（maintain media）。培 養 Clostridium tyrobutyricum 時，使用 RCM 培養基增富效果較好。在進行實驗時，需 要換成工作培養基[Yang,2002]，其中實驗所需基質依據實驗的需求更換葡萄糖濃度或 碳源。所有培養基的溶液皆使用 RO 水配製。

RCM 培養基是商品化瓹品（表 8），用 RO 水為溶劑以 38gL^-1濃度配置。pH 值 用 NaOH（4N）與 HCl（4N）調整到 6.8。為確保培養基是厭氧狀態，加入指示劑 Resazurin solution （0.0001%）。加入指示劑後，培養基會呈現紫紅色。此時將裝在氣 密瓶的培養基放在加熱台上煮至沸騰，待顏色退掉變回原來的黃棕色再將墊片與鋁蓋 套上蓋緊。將煮好的培養基移到高溫滅菌釜以 121℃滅菌 20 分鐘，滅完菌後將培養 基移到厭氧操做檯，注意轉移的時間不要太久以免氧氣回溶。準備冰浴，將滅過菌之 培養基置於冰浴中，使培養基中殘存的氧氣藉由溫度差排出。在厭氧操做檯內先用抽 氣幫浦將氣密瓶內的空氣抽出，再用純氮氣灌入氣密瓶中直至液面不再擾動。這時液 態 RCM 培養基即製備完成。配置固態 RCM 培養基的成份與液態 RCM 培養基類似，

僅在 Agar 的量上提高到 15gL^-1。

表 8. RCM 培養基組成

Typical formula gL^-1

A pproximate Digest of Casein 5

Proteose Peptone NO.3 5

Beef Extract 10

Yeast Extract 3

Dextrose 5

Sodium Chloride 5

Soluble Starch 1

Cysteine HCL 0.5

Sodium Acetate 3

Agar 0.5

工作培養基的配置如表 9（1 公升），配置方式一：在批次實驗中使用緩衝溶液做

為溶劑來混合，無需再調整 pH，僅需要加入厭氧指示劑；方式二：使用 DI 水做為溶 劑混合，加入厭氧指示劑來確保培養基為驗氧狀態，pH 值使用 NaOH（4N）與 HCl

（4N）調整到 6，最後再置入 121 ^oC、15 psig 高壓滅菌釜中 20 分鐘。

表 9. 工作培養基[Yang, 2002]

名稱 gL^-1

glucose 30

yeast extract 5

peptone 5

(NH₄)₂SO₄ 3

K2HPO4 1.5

MgSO₄·7H₂O 0.6

FeSO4·7H2O 0.03

3. 固定化顆粒製作

將活化後之菌液轉殖在 5L 發酵槽內進行大量增富，發酵槽體中含有 3L 使用 RO 水配置的工作培養基，pH 藉由 NaOH 及 HCl 調整至 6.0，接著使用純氮曝氣 2 分鐘，

最後在進入滅菌釜滅菌。將滅完菌之發酵槽體置於室溫中冷卻整晚，接種前先將槽體 溫度維持在 37^oC、pH6.0，使用蠕動幫浦將菌種接入發酵槽中培養。發酵培養體積為 3L，接菌的菌液為 100ml。當菌液 OD 值達到 3.5 左右，將槽體中的菌液體離心，將 離心完之菌液及菌體分開收集，將收集之菌體置入冰浴中備用。

本次實驗使用國立清華大學陳國誠教授實驗室開發之磷酸酯化法[Chen and Lin, 1994]。將溶解後的 PVA 溶液以特定的比例與 2%的 C. tyrobutyricum 菌體混合，

成形液的配置與先前學者文獻一致 [林, 1992]。PVA 在成形液中成形後，將成行 完的顆粒收集備用。

3-4 特製填充床反應器批次實驗

除了發酵槽外，本研究還準備了另一組填充床反應器系統來參與實驗的進行，如 圖 7。所示。顆粒填充床的體積固定(直徑 4cm、高 20cm，總體積 252cm³)，所以菌 體體積填充量固定（250 ml）。

pH

pH

in air

圖 7. 顆粒填充床反應器。左起為 5L 發酵槽體，中間為填充床反應器，右邊為發酵 槽操作設備，設備上方為採氣袋

3-5 反應動力模擬

3-5-1 Clostridium tyrobutyricum 降解萄葡糖的反應機制

本研究的主要對象是丁酸的發酵，我們參考 Shinto et al.等學者（2007）文獻中對 菌體代謝萄葡糖時的反應機制以及瓹物瓹出速率方程式來進行模擬。經簡化修飾後的 C. tyrobutyricum 降解萄葡糖的反應路徑描述於圖 8，且根據此示意圖來做數值的解析 與各物質濃度的模擬。由圖得知 C. tyrobutyricum 的代謝路徑，葡萄糖首先會先被轉 化成 pyruvate 再到丁酸，而中間會有乳酸的生成及被再利用轉換成丁酸。

Glucose Pyruvate Butyric acid

Lactic acid

r2 r3

r4 r1

圖 8. C. tyrobutyricum 的代謝路徑示意圖

3-5-2 反應動力速率方程式

表 10. 動力模式符號說明

符號 說明

[Biomass] 細胞濃度(gL^-1) [Glucose] 葡萄糖濃度(gL^-1) [Lactic acid] 乳酸濃度(gL^-1) [Butyric acid] 丁酸濃度(gL^-1)

Vmax1 葡萄糖代謝時最大反應速率

Vmax2 乳酸生成時最大反應速率

Vmax3 乳酸轉換到 Pyruvate 時最大反應速率 Vmax4 Pyruvate 到丁酸時最大反應速率

km1 葡萄糖轉換到 pyruvate 的代謝物濃度，生成速率相當於是

Vmax 的一半

km2 pyruvate 轉換到乳酸的代謝物濃度 km3 乳酸轉換到 pyruvate 的代謝物濃度 km4 pyruvate 轉換到丁酸的代謝物濃度

根據圖 8 的代謝路徑，各別的代謝速率方程式，以莫耳濃度的表示方法如下：

] [

] [

* ] [

*

1 1 max

1 k Glucose

Glucose Biomass

r V

m 

 (3-1)

] [

] [

* ] [

*

2 2 max

2 k Lacticacid acid Lactic Biomass

r V

m 

 (3-2)

] [

] [

* ] [

*

3 3 max

3 k Pyruvate

Pyruvate Biomass

r V

m 

 (3-3)

] [

] [

* ] [

*

4 4 max

4 k Butyricacid acid Butyric Biomass

r V

m 

 (3-4)

在定義各路徑的反應速率方程式後，接著就是基質的代謝與瓹物的生成速率方程式。

方程式(3-5)說明葡萄糖基質的利用速率，式子中係數為葡萄糖分子量，方程式(3-6) 在說明中間瓹物乳酸的生成及消耗，式子中係數為乳酸分子量，而方程式(3-7)在表示 丁酸的生成，式子中係數為丁酸分子量，最後方程式(3-8)則是在說明 pyruvate 的變化，

式子中係數為 pyruvate 分子量，以上皆是以重量濃度表示。

 

180 r1 t

G 



 (3-5)



90.8



*r3 r2 t

L  



 (3-6)

 

88.1 *r4 t

B 



 (3-7)



88.06

 

* r1 r3 r2 r4



t

P    



 (3-8)

3-5-3 速率方程式參數的推估與求解

本研究所列的速率方程式(3-5)到(3-8)的參數推估方法乃是利用Matlab 軟體所附 的lsqcurvefit求得；而方程式(3-1)到(3-4)各基質與瓹物濃度的求解則是使用 Matlab 軟 體所附的 ode23s 求得。

在參數的推估上，由於四個最大反應速率與四個飽和係數都是未知值，必頇仰賴 四個自變數（萄葡糖、乳酸、丁酸及 pyruvate）的實驗值來進行推估。然而我們可量 測的變數僅有萄葡糖、乳酸及丁酸等三個變數，所以必頇先假設 pyruvate 的變化近 似為零，如方程式(3-9)及(3-10)所示。然後在 lsqcurvefit 求解的 routine 中不斷地以 Matlab 軟體所附的 fsolve 求得修正後的 pyruvate 濃度，直到其值收斂為止。其邏 輯圖如圖9所示。在確認各參數後，則可以利用方程式(3-5)到(3-8)等四個方程式直接 求得四個基質與瓹物自變數（萄葡糖、乳酸、丁酸及pyruvate）的濃度變化圖。



^88.06

 

^{* 1 3 2 4}



^0

 

 r r r r

t P

(3-9) 所以

] [

] [

* ] [

* ]

[

] [

* ] [

*

] [

] [

* ] [

* ]

[

] [

* ] [

*

4 4 max

2 2 max

3 3 max

1 1 max

acid Butyric k

acid Butyric Biomass

V acid

Lactic k

acid Lactic Biomass

V

Pyruvate k

Pyruvate Biomass

V Glucose

k

Glucose Biomass

V

m m

m m

 

 

 



(3-10)

Initial data Glucose Lactic acid Butyric acid

Close to Initial G, L, B?

Y_model eq.

dG/dt, dL/dt, dB/dt

Matlab lsqcurvefit Initial parameters

Vmi, Kmi guess (i=1~4) Matlab fsolve

To get Vmi, Kmi Residual, error

Matlab ODE23s

Solved G, L, B

Yes

No

Glucose, Lactic acid, Butyric acid and pyruvate versus time profiles

to get Pyruvate

Solved Glucose Lactic acid Butyric acid

圖 9. 電腦模擬程式的求解過程。圖中 G 代表葡萄糖，L 代表乳酸，B 代表丁酸

3-6 分析方法

1. 菌體密度及菌量分析

細胞密度測量：以 RO 水稀釋菌液，再以分光光度計在 600nm 下測量吸光度

（Absorbance），OD600值再乘回稀釋倍數，即可得到菌液細胞濃度。

菌重測量：量取 2ml 的菌液，以 8000rpm 離心後將上層液抽掉，放入 105℃的烘 箱，經過 24 小時後，取出後冷卻秤重。在 105℃所得到重量減掉先前所秤的離心管

重（空的離心管需先置於乾燥箱 24 小時後才秤重），即可求得菌重。其檢測方法依據

水質分析標準方法。

2. 蛋白質分析

使用 BCA Protein Assay Kit 進行菌體與顆粒蛋白質分析，內容物如下表 11：

表 11. BCA Protein Assay Kit

名稱 內含物

BCA reagent A 碳酸鈉、碳酸氫鈉、bicinchoninic acid 和 酒石酸溶於 0.1M 清氧化鈉中。

BCA reagent B 含 4%硫酸銅。

Albumin standard ampules

含 2.0 mg/ml 牛血清蛋白（Bovine serum albumin, BSA），於 0.9%鹽分及 0.05%疊 碳化鈉中。

蛋白質標準詴劑為 Albumin Standard Ampules，內含 2.0 mg/mL 的牛血清蛋白

（bovine serum albumin, BSA），可將 BSA 稀釋成 5-250μg/mL。首先將 50 單位的 A 詴劑以及 1 單位的 B 詴劑配製成工作溶液（BCA working solution）詴劑（可保存一 周），測定時需要 0.25 mL 的蛋白質標準詴劑（或樣品）與 5 mL 的 working solution 詴劑混合均勻（1：20），置入 60 ℃恆溫水浴槽中 30 min，取出後以冷水降溫（1 min）。

最後，於 10 min 內將樣品以分光光度計於波長 562 nm 下測出吸光值。最後將不同濃

度的蛋白質標準品與吸光度作圖，再以線性迴歸求出檢量線，如下圖 10 所示。

0 50 100 150 200 250

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

OD 562

Concentration(ug/ml)

Equation y = a + b*x Adj. R-Squa 0.99791

Value Standard Err OD Intercept 0.0070 0.00809 OD Slope 0.0034 6.95129E-5

圖 10. 蛋白質牛血清蛋白標準品檢量線

3. 懸浮菌液檢量線建置

以穩定期的菌液，量測其乾菌重（即已知濃度），再以 2ml 菌液離心轉速 6000rpm、

10min 將菌體離出，取出上清液至另一 2ml 離心管加入 2% SDS（sodium dodecyl sulfate）

將蛋白質溶解，再以 BCA Protein Assay 法，將所測得的吸光度代入之前所建立的蛋 白質對吸光度檢量線，以求取其蛋白質含量。同時，可利用已知的菌體濃度（SS）與 求得之蛋白質濃度，建立菌體濃度（SS）對蛋白質之檢量線如下圖 11。

在文檔中 中 華 大 學 碩 士 論 文 (頁 42-60)