新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統

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(1)科技部補助專題研究計畫報告. 新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統. 報計計執執. 告畫畫行行. 類類編期單. 別別號間位. ：：：：：. 成果報告個別型計畫 MOST 108-2221-E-006-203108年08月01日至109年07月31日國立成功大學工程科學系（所）. 計畫主持人：林裕城. 計畫參與人員：此計畫無其他參與人員報告附件：出席國際學術會議心得報告. 本研究具有政策應用參考價值：■否 □是，建議提供機關（勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關）本研究具影響公共利益之重大發現：□否 □是 . 中華民國 109 年 10 月 27 日.

(2) 中文摘要：糖尿病為全世界所共通之疾病，其中又以亞洲地區所罹患之比例最高，且在臺灣為國內十大死因中的第5名；糖尿病至今仍尚未完全釐清患病原因且亦無法徹底治療根除，患者僅能夠過長期的血糖監測並搭配藥物控制來維持體內血糖值，期望在適當治療下延遲糖尿病誘發的併發症，如：視網膜病變、神經、血管病變和腎病，進而降低更進一步的視力障礙、截肢、高血壓、中風甚至死亡的發生率。而在傳統的血糖儀所檢測的是患者當下的葡萄糖濃度，並無法反應出長期血液中葡萄糖的含量，而若能檢測出血液中的糖化血色素與血色素比例，即可作為長期的體內血糖值參考依據，故本計畫預計完成糖化血色素(HbA1c)與血色素(Hb)之側流層析免疫快篩試劑，並使用電阻量測儀偵測其電極訊號，量測出兩者的訊號差異，並產出兩者之檢量線數據，最後將完成的側流層析免疫試劑放入快篩試劑盒中，使用本團隊過去所開發之快篩試劑判讀設備，量測糖化血色素與血色素的光學影像數據差異，並將其數據分析後建立糖化血色素與血色素快篩檢測專用資料庫，最後即可產出「新型糖化血色素檢測快篩判讀系統」。中文關鍵詞：糖化血色素、血色素、生醫檢測晶片、硝化纖維薄膜、阻抗量測儀英文摘要： Diabetes is a common disease in the world, with the highest proportion in Asia, and the fifth among the top 10 causes of death in Taiwan. Diabetes has not yet to clarified the cause of the disease and can not completely cure the eradication. Patients can only maintain long-term blood glucose monitoring and medication control to maintain blood sugar levels in the body. Expect to delay diabetes-induced complications by appropriate treatment. Such as: retinopathy, nerves, vascular disease and kidney disease, thereby reducing the incidence of visual impairment, amputation, hypertension, stroke and even death. In the traditional blood glucose meter, the glucose concentration of the patient is detected, and the glucose content in the long-term blood cannot be reflected. If the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin in the blood can be detected, it can be used as a reference for long-term blood glucose levels in the body. Therefore, the project is expected to complete the lateral immunochromatographic test for glycated hemoglobin (HbA1c) and hemoglobin (Hb). And use the inductance, capacitance and resistance meter (LCR meter) to detect the electrodes signal, measure the signal difference between two targets, and generate the calibration curve data. Finally put the completed lateral immunochromatographic test into the rapid test kit. And use the rapid test analyzer equipment developed by our team in the past, and measure the difference in optical image data between glycated hemoglobin and hemoglobin, after that establish a dedicated database for glycosylated hemoglobin and hemoglobin rapid test after data analysis. Finally, the.

(3) "The New Kind of Rapid Test Detection System for Glycated Hemoglobin" can be produced. 英文關鍵詞： Glycated Hemoglobin, HbA1c, Hemoglobin, Hb, Biomedical detection chip, Nitrocellulose filter membrane, LCR meter.

(4) 科技部補助專題研究計畫成果報告（□期中進度報告/期末報告）. 新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統計畫類別：個別型計畫 □整合型計畫計畫編號：MOST108－2221－E－006－203－執行期間：108 年08 月01 日至109 年07 月31 日執行機構及系所：國立成功大學工程科學系(所) 計畫主持人：林裕城教授共同主持人：計畫參與人員：本計畫除繳交成果報告外，另含下列出國報告，共 1 份： □執行國際合作與移地研究心得報告 出席國際學術會議心得報告 □出國參訪及考察心得報告. 中. 華. 民. 國 109 年 10 月 22 日.

(5) 中文摘要糖尿病為全世界所共通之疾病，其中又以亞洲地區所罹患之比例最高，且在臺灣為國內十大死因中的第 5 名；糖尿病至今仍尚未完全釐清患病原因且亦無法徹底治療根除，患者僅能夠過長期的血糖監測並搭配藥物控制來維持體內血糖值，期望在適當治療下延遲糖尿病誘發的併發症，如：視網膜病變、神經、血管病變和腎病，進而降低更進一步的視力障礙、截肢、高血壓、中風甚至死亡的發生率。而在傳統的血糖儀所檢測的是患者當下的葡萄糖濃度，並無法反應出長期血液中葡萄糖的含量，而若能檢測出血液中的糖化血色素與血色素比例，即可作為長期的體內血糖值參考依據，故本計畫預計完成糖化血色素(HbA1c) 與血色素(Hb)之側流層析免疫快篩試劑，並使用電阻量測儀偵測其電極訊號，量測出兩者的訊號差異，並產出兩者之檢量線數據，最後將完成的側流層析免疫試劑放入快篩試劑盒中，使用本團隊過去所開發之快篩試劑判讀設備，量測糖化血色素與血色素的光學影像數據差異，並將其數據分析後建立糖化血色素與血色素快篩檢測專用資料庫，最後即可產出「新型糖化血色素檢測快篩判讀系統」。. 關鍵字：糖化血色素、血色素、生醫檢測晶片、硝化纖維薄膜、阻抗量測儀 I.

(6) 英文摘要 Diabetes is a common disease in the world, with the highest proportion in Asia, and the fifth among the top 10 causes of death in Taiwan. Diabetes has not yet to clarified the cause of the disease and can not completely cure the eradication. Patients can only maintain long-term blood glucose monitoring and medication control to maintain blood sugar levels in the body. Expect to delay diabetes-induced complications by appropriate treatment. Such as: retinopathy, nerves, vascular disease and kidney disease, thereby reducing the incidence of visual impairment, amputation, hypertension, stroke and even death. In the traditional blood glucose meter, the glucose concentration of the patient is detected, and the glucose content in the long-term blood cannot be reflected. If the ratio of glycated hemoglobin to hemoglobin in the blood can be detected, it can be used as a reference for long-term blood glucose levels in the body. Therefore, the project is expected to complete the lateral immunochromatographic test for glycated hemoglobin (HbA1c) and hemoglobin (Hb). And use the inductance, capacitance and resistance meter (LCR meter) to detect the electrodes signal, measure the signal difference between two targets, and generate the calibration curve data. Finally put the completed lateral immunochromatographic test into the rapid test kit. And use the rapid test analyzer equipment developed by our team in the past, and measure the difference in optical image data between glycated hemoglobin and hemoglobin, after that establish a dedicated database for glycosylated hemoglobin and hemoglobin rapid test after data analysis. Finally, the "The New Kind of Rapid Test Detection System for Glycated Hemoglobin" can be produced.. Keywords: Glycated Hemoglobin, HbA1c, Hemoglobin, Hb, Biomedical detection chip, Nitrocellulose filter membrane, LCR meter II.

(7) 目錄中文摘要··················································································I 英文摘要················································································· II 前言 ·······················································································1 研究目的··················································································2 文獻探討··················································································3 研究方法··················································································7 結果與討論············································································· 16 參考文獻················································································ 36 科技部補助專題研究計畫成果自評表 ············································38. I I I.

(8) 前言糖尿病[1]是一種體內醣類代謝異常疾病，也就是說患者無法有效地應用體內血糖。發生的原因大致可分成兩類：其一是患者無法分泌足夠能協助體內葡萄糖吸收的胰島素，因為病史多從童年期或青春期開始，所以又稱之為幼年起始型糖尿病，這一型的患者約佔所有糖尿病患 5%；其二是患者細胞無法正常對胰島素產生反應，導致患者體內葡萄糖持續地累積，通常是成人期開始發病因此又稱之為成人型糖尿病。然而，造成此一類型的糖尿病病因及可能發病機制十分複雜，至今仍尚未完全釐清，但顯而易見的原因是來自於身體對胰臟製造的胰島素的不能産生正常的反應，這一型糖尿病患者大約佔全球所有糖尿病病例的 95%。此一型糖尿病患者好發於中、老年人，但也有年輕人患有此類糖尿病，家族史是一個危險因素。一般於早期並無明顯症狀，通常在患病後數年，出現併發症時才能被診斷出來。相較於大多數幼年起始型糖尿病患者需要每日注射胰島素，成人型糖尿病患者是採取服用口服藥來控制血糖。事實上，約三分之一的成人型糖尿病患者需要藉助注射胰島素來控制血糖。至於非藥物治療則包括飲食控制和運動等。理想的血糖值在飯前應被控制在每 100 毫升血液中含有 80 至 120 毫克葡萄糖的理想範圍內[2] 。根據衛服部國民健康署統計，臺灣糖尿病患者已經超過 200 萬人，其年齡層也有逐漸降低的現象，且每年以 25,000 名的速度持續增加中[3] 。糖尿病患者容易罹患各種有關代謝和心血管的慢性併發症，進而造成更多疾病與不適。為達到及早發現與控制，必須定期追蹤血糖，但目前的血糖計都以測量當下血糖為主，易受飲食、運動而造成血糖浮動，若能直接測量到代表平均血糖值的糖化血色素(Hemoglobin A1c，又縮寫為 HbA1c)，則能得知血糖控制的成果及更精準的後續追蹤，因此糖化血色素的即時研判變得相當重要，是未來控制糖尿病的趨勢。. 1.

(9) 研究目的本計畫為進行「新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統」，在生醫檢測方面，有鑑於傳統免疫檢測分析方法通常受限於技術門檻高、高試劑量使用及必須使用人力判斷檢驗結果等問題，且為了降低生物樣本、節省偵測成本、增加分析速度與簡化操作程序等目的[4,5]，計畫中使用的電化學法，亦為電性鑑別法，利用電感、電容、電阻量測儀(LCR meter)偵測電極晶片之電性訊號進行檢測，藉由阻抗變化來判斷免疫反應的情況，並建立三明治免疫分析系統。以避免造成誤判檢驗結果，並結合電極晶片與金奈米粒子抗體標定技術，以助於定性偵測待測檢體之免疫反應並定量阻抗量測分析結果鑑別。因此本計畫將於生物阻抗分析技術之基礎下，進行新型檢測系統之開發，以及高品質與穩定的檢測晶片開發，將有助於提高檢測之準確性與靈敏度。. 2.

(10) 文獻探討計畫中利用相轉換法(Phase Inversion) [6, 7]製作薄膜，其中相轉化法是指將高分子由液相轉換為固相，藉由高分子、揮發性溶劑、及不易揮發之非溶劑三成份配製成之鑄膜溶液，在某固定溫度之下為均相溶液，在恆溫程序中溶劑逐漸揮發，溶劑的揮發造成溶液由均相產生相分離而生成兩相溶液，即高分子貧相與高分子富相。高分子富相即為高分子濃度較高的相態，而高分子貧相代表高分子濃度較低的相態。至溶劑完全揮發後，由於高分子溶解度降低，因相分離行為而形成多孔性薄膜結構。其中高分子富相經固化形成薄膜主體，而高子貧相形成連續性孔洞結構。相轉化法主要包括：熱誘導式相分離法(Thermal-Induced Phase Separation, TIPS)[8]、乾式法(Solvent Evaporation)[9, 10]、濕式法(Immersion Precipitation)[11]、蒸氣誘導式相分離(Vapor-Induced Phase Separation, VIPS)[12]。本計畫在相轉換法中使用乾式法，乾式成膜是相分離製膜方法中最簡單也是最早被發現的方法，將高分子溶於溶劑形成均相的高分子溶液，均勻塗佈於載體上，將其置於恆溫、恆濕箱中一段時間 (數十分鐘至數小時，依成膜條件而異)，待薄膜形成後，將其升溫乾燥且抽真空以除去殘餘非溶劑[7, 13]，並測試其性質。高分子可在溶液中的溶劑在惰性(如氮氣)環境下揮發，以避免水蒸氣的吸入。溶劑的揮發造成溶液由均相產生相分離而生成兩相溶液，即高分子貧相與高分子富相，高分子富相亦即高分子濃度較高，反之高分子貧相代表因溶液中非溶劑含量較高導致高分子濃度較低，其中高分子貧相經過乾式相轉換後，形成連續孔洞結構，藉由控制相分離過程之環境濕度、溫度、溶液組成比例等，以達到控制孔洞大小及薄膜結構之目的。此連續孔洞結構將利於研究中透過側流層析法及毛細現象使玻璃纖維中金奈米粒子隨著溶液流動至吸水墊端。成膜過程中，高分子-溶劑-非溶劑三成份之研究為探討成膜機制的基礎[14]。其中，以 Flory-Huggins Theory 之三元相圖描述高分子溶液之熱力學行為，並利用各成分間之引力參數求得吉布士混合自由能(Gibbs Free Energy of Mixing, ∆Gm)對溫度與組成的關係。其中，吉布士混合自由能，如式 1所示： ∆Gm = ∆Hm - T∆Sm. 式(1). 其中∆Hm 表示混合焓(Enthalpy of Mixing)，∆Sm 表示混合熵(Entropy of Mixing)，T 表示絕對溫度。當∆Gm<0 時，表示自發性地發生混合；當∆Gm=0 時，表示處於平衡狀態。而對高分子系統而言，其分子量較大，∆Sm 較小，因此∆Gm 大小之溶解與否主要受到∆Hm 影響。假設在一固定溫度與壓力下的密閉系統中，將在∆Gm 最小值處達平衡。熱力學之高分子、溶劑與非溶劑等溫平衡相圖之相關位置如圖 1 所示[15]。成膜過程由勻相高分子溶液組成(V 區)，藉由溶劑與非溶劑組成比例不同，對應(I, VI) 緻密結構 (Dense Structure)、(II) 海綿結構(Sponge Structure)、(III) 雙連續結構(Bi-Continuous or Lacy Structure) 、 (IV) 未成核(Nodules)，其各區域所對應可能發生的結構如圖 2 所示。因此，藉由系統組成成分，則可透過熱力學相圖初步判斷其可能形成的薄膜結構型態[16]。. 3.

(11) 圖 1 高分子、溶劑與非溶劑三相圖. 圖 2 (I, VI)緻密結構、(II)海綿結構、(III)雙連續結構、(IV)未成核. 4.

(12) 除了薄膜開發之外，本計畫亦進行檢測晶片之阻抗量測，因此需將待測溶液與電極進行接觸，而此量測行為可以透過一等效電路模型圖進行模擬，如圖 3 所示，且依照此等效電路模型之理想頻率阻抗量測圖形如圖 4 所示。藉由等效電路模型將待測溶液與電極表面的各種物理現象轉變為電路元件，以方便後續實驗中進行分析[17]，而各模擬元件所代表的意義與特性如下：電雙層電容(Cdl)：電極施加電位後，電荷聚集在電極表面上，並吸引異性電荷形成雙電層電容結構。溶液阻抗(Rs)：待測溶液本身的等效阻抗，與溶液內的離子濃度具有高度關聯。電子傳遞阻抗(Ret)：電子脫離電極表面的阻抗值，又為電子轉移速度之等效阻抗，屬於動力學控制。 Warburg 阻抗(Zw)：由待測溶液到電極表面的離子擴散阻抗，與離子濃度有關，屬於擴散控制。. 圖 3 等效電路模型. 圖 4 等效電路模型之理想頻率阻抗量測圖形 5.

(13) 經由圖 4 所示，由電荷傳遞和擴散過程共同控制時，在整個頻率域內，其奈奎斯特圖 (Nyquist)是由高頻區的一個半圓和低頻區的一條 45 度的直線構成。高頻區為電極反應動力學控制，即電荷轉移(Charger Transfer)的過程，而低頻區由電極反應的反應物或產物的擴散控制(Diffusion Control)[18]。當頻率降低時使得電雙層電容提高，阻抗圖形將成一條斜直線，而於理想狀態下，其斜率等於 1；高頻部分主要由電極上之動力學控制而呈現圓弧狀阻抗圖，隨著頻率增加，阻抗值快速降低，並且在足夠高的頻率下，其虛部阻抗將趨近於零。糖化血紅蛋白，又稱為糖化血紅素，縮寫成 hemoglobin A1c、A1C、Hb1c 以及 HbA1c ，是血液紅細胞中的血紅蛋白與葡萄糖結合之產物，常作為一段時間內平均血糖濃度的參考，一般來說糖化血紅素與一段時間內血漿葡萄糖濃度的水平呈正比。在檢測過程中，所抽取的血液檢體中紅血球所含的糖化血色素量是一種有高有低混合分佈形式，根據研究指出其中 50%糖化血色素的量是代表當月平均血糖值；而另外 25%糖化血色素的量是代表 1~2 個月的平均血糖值，剩下的 25%糖化血色素的量則是代表 3~4 個月的平均血糖值。最近有更多研究結果建議使用「糖化血色素佔總血色素百分比」做為糖尿病診斷之方式，也由於糖化血色素量測結果與每日血糖值的波動無直接的關連性，亦不受短期飲食攝取、生理狀況及藥物影響，所以糖化血色素百分率的高低更適合做為糖尿病普查、評估用藥治療成效及糖尿病患者血糖控制的良好指標。目前糖化血色素的臨床意義為檢測血液檢體中糖化血 HbAlc. 色素佔總血色素的濃度比例，即 Hb ×100%。一般正常人體的濃度比例約為 4～6.5%， 6.5%以上則為糖尿病的診斷標準之一[19, 20]。血糖控制與合併症實驗與英國前瞻性糖尿病研究對於接受治療的糖尿病患者均建議其糖化血色素量測結果應< 7%，若是經治療的糖尿病患的糖化血色素量測結果> 8%時便應該重新評估所使用的治療方式。又因為檢測的目標為比例關係，所以檢體在稀釋的情況下，比例依然存在，使用生醫微機電技術來檢測，可以有效減少檢體量需求與快速分析。血紅素（Hemoglobin），縮寫成 Hb 或 Hgb 是高等生物體內負責運載氧的一種蛋白質，可以用平均細胞血紅素濃度測出濃度。血紅素存在於幾乎所有的脊椎動物體內，在某些無脊椎動物組織也有分布。血液中的血紅素從呼吸器官中將氧氣運輸到身體其他部位釋放，以滿足機體氧化營養物質支持功能運轉之需要，並將由此生成的二氧化碳帶回呼吸器官中以排出體外。一般貧血的定義是指血液中的紅血球 (Red blood cell, RBC) 、血色素 (Hemoglobin, Hb)或平均血球容積(mean corpuscular volume, MCV)降低至參考值以下。評估貧血一般是以紅血球細胞濃度 (red blood cell, RBC)、血色素 (Hb) 作為指標。比較常見的是以血色素作為標準，成年男性低於 13.0 g/dL、女性低於 12.0 g/dL 稱之為貧血[21, 22]。. 6.

(14) 研究方法 (一)檢測試劑之反應區薄膜製程開發與製作本計畫檢測試劑之反應區薄膜使用硝化纖維膜，需使用高分子材料、溶劑與非溶劑進行硝化纖維溶液製備。製備方法為使用高分子材料-硝化纖維素(Nitrocellulose, NC) 12.2 wt%與溶劑包含丙酮(Propanone) 51.8 wt%、乙酸甲酯(Methyl Acetate, MA) 5.2 wt% 透過加熱型攪拌器在血清瓶之密閉環境中利用磁石進行均勻攪拌，而硝化纖維液體較為濃稠，需經過長時間緩慢攪拌，並且需避免過多氣泡產生，因此攪拌速度為 30 rpm，攪拌時間為五個小時。再於溶液中緩慢加入非溶劑，其包含異丙醇(Isopropanol, IPA) 20.2 wt%、甘油(Glycerol) 5 wt%、去離子水 (Deionized Water, DI Water) 5.6 wt%，透過磁石攪拌器進行兩小時攪拌，即完成硝化纖維溶液製備。為達成連續緻密孔洞結構以利實驗後端檢測反應進行，在硝化纖維溶液比例調整中，非溶劑(異丙醇、甘油、去離子水)比例組成為首要影響硝化纖維膜結構之因素，非溶劑中甘油以及去離子水為主要構成孔隙之來源，但若加入過多甘油及去離子水，將造成硝化纖維膜表面破裂，以及甘油與去離子水之組成比例，都是需列入硝化纖維溶液製備考量的重要因素 [23-25]。於塗佈液態硝化纖維溶液至檢測晶片探討中，為維持硝化纖維膜厚度以及寬度一致性，將使用針筒注射式幫浦以及本實驗室自行開發設計之單向輸送平台，塗佈硝化纖維溶液於檢測電極晶片表面，硝化纖維膜塗佈平台如圖 5 所示。首先，將硝化纖維溶液緩慢吸入至針筒中，並且避免空氣進入針筒中，針筒注射式幫浦維持固定速度將針筒中硝化纖維溶液通過矽膠管流動至輸送平台端，其中輸送平台上利用壓克力板固定各檢測電極晶片放置位置，確保硝化纖維溶液塗佈於檢測電極中央位置。其壓克力板運用雷射加工技術進行製作，使用 AutoCAD® 2019 版本設計其壓克力固定板以固定各檢測電極基板於輸送平台上之位置，並利用雷射雕刻機進行壓克力固定板製作程序。單向輸送平台固定矽膠管位置及高度，並透過單向輸送平台以穩定速度將檢測電極基板緩慢由右至左運送，藉由針筒注射式幫浦推動液體速度以及輸送平台移動速度配合，且以矽膠管作為媒介將其連接，檢測電極平面上以固定容量塗佈於限定位置中，以固定硝化纖維膜寬度和厚度，維持其穩定性。實驗將透過掃描式電子顯微鏡觀察製作之硝化纖維膜膜厚穩定性，確保各硝化纖維膜膜厚一致性。若各腫瘤標誌檢測晶片中硝化纖維膜厚度差距過大，將致使測量相同濃度抗原情況下，檢測線上一次抗體抓取之金奈米粒子數量不同，而導致實驗後端阻抗量測不穩定，造成濃度鑑別度不佳。因此，將觀察硝化纖維膜之厚度穩定性，以減少實驗因子變異性，以確保後端阻抗量測成果中，不同濃度的抗原與阻抗值分析中獲得較高鑑別度。. 7.

(15) 圖 5 硝化纖維膜塗佈平台相轉換過程為將塗佈硝化纖維溶液之檢測電極晶片放入至穩定濕度之烘箱中，烘箱溫度維持在 30˚C，為確保其環境可使硝化纖維膜維持穩定相轉換環境，使硝化纖維溶液由液態轉換至固態薄膜狀，並在高分子貧相溶液中轉換為連續孔洞結構。此連續孔洞結構將利於計畫中透過側流層析法及毛細現象使玻璃纖維中金奈米粒子隨著溶液流動至檢測線，透過檢測線上一次抗體鍵結上抗原，而抗原鍵結金奈米粒子，檢測線上金奈米粒子呈色深淺因應抗原濃度隨之改變，而金奈米粒子的多寡影響其阻抗值，從而利用阻抗值判斷抗原濃度，因此硝化纖維膜連續孔洞結構在此免疫反應分析中扮演重要的角色。而高分子溶液相轉換中，濕度為主要控制孔洞結構之因素，因此進行不同濕度相轉換情況下，針對其孔隙率進行探討。將進行相轉換濕度研究，實驗濕度由65~90% RH，取每5% RH 為間隔進行研究，根據不同濕度下形成之結構，找出硝化纖維膜相轉換最佳濕度。為確保完整相轉換過程，將硝化纖維膜維持在恆溫恆濕環境中一個小時。在相轉換完成後，進行恆溫且真空環境以利尚未揮發之非溶劑完全除去，環境條件以恆溫30˚C 並抽真空至76 cm-Hg 兩個小時，在抽真空過程中，硝化纖維膜表面將呈現越來越均勻顯現白色狀態。. 8.

(16) 檢測試劑反應區薄膜開發製作詳細步驟整理如下： 1. 調配硝化纖維溶液高分子與溶劑部分，其比例如下：NC 12.2 wt%, Propanone 51.8 wt%, MA 5.2 wt%，透過磁石攪拌器進行均勻攪拌五小時。 2. 調配硝化纖維溶液非溶劑部分，其比例如下：IPA 20.2 wt%, Glycerol 5 wt%, DI water 5.6 wt%，透過磁石攪拌器進行均勻攪拌兩小時。 3. 利用硝化纖維膜塗佈平台，固定針筒注射式幫浦流率為 1 ml/min、針筒面積大小為 20 mm2、容量為 4 ml，透過單向固定平台速度與壓克力固定板穩定將硝化纖維溶液塗佈至檢測電極表面。 4.塗佈完成之硝化纖維溶液放入恆溫恆濕烘箱中，時間為一個小時。 5. 將完成相轉換中溶劑揮發程序之硝化纖維膜進行非溶劑完全除去步驟，在真空烘箱中維持溫度 30˚C，並抽真空至 76 cm-Hg Vac.，時間為兩個小時。. 9.

(17) (二) 檢測試劑之抗體-膠體金鍵結製程檢測試劑抗體-膠體金鍵結與抗體-膠體金噴點製程之是利用實驗選定之抗體濃度進行抗體-膠體金接合，其順序為將抗體加入膠體金溶液中並均勻攪拌一段時間後，再加入牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)攪拌，作為固定抗體之功用。接著將攪拌完成之液體裝入離心瓶內高速離心，使鍵結抗體之膠體金沉澱於底部與未鍵結的抗體分離，再次加入清洗液洗滌並重覆離心步驟後，即可加入抗體-膠體金稀釋液復溶得到圖 6 中所選定抗體濃度之產物抗體-膠體金溶液。最後再利用 UV-vis 測定其從 450~700 nm 吸收光波長，與未鍵結抗體之膠體金粒子的吸收光波長比較，吸收光譜之波峰向右移動則稱為紅移現象。紅移現象即波長增加或頻率降低之現象，光譜儀量測結果顯示吸收光譜有紅移的現象，原因為膠體金粒子因鍵結上抗體而使顆粒大小變大，導致其折射率變小，以證明抗體確實有鍵結上膠體金粒子，如圖 7 所示。. 圖 6 鍵結完成之抗體-膠體金溶液 1.4 527. 1.2. Antibody-Nanogold Nanogold. 531. Absorbance (AU). 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 450. 475. 500. 525. 550. 575. 600. 625. 650. 675. 700. Wavelength (nm). (a). (b). 圖 7 抗體鍵結膠體金粒子 UV-vis 測定：(a)左側比色槽為未鍵結抗體膠體金，右側為鍵結抗體之膠體金，(b) 鍵結抗體之膠體金與未鍵結之膠體金吸收光波長比較. 10.

(18) (三) 檢測試劑之製作與整合本計畫在膠體金膜製備中，始製程，而改以移液器將抗體-金奈米粒子溶液均勻分布於纖維膜上，可使 150 mm 的纖維膜皆能吸收定量之抗體-金奈米粒子溶液，改進以浸泡法製程之膠體金膜可能有抗體-金奈米粒子溶液分布不均之現象。並將噴點完成膠體金膜置於真空冷凍乾燥機中六個小時進行真空低溫處理，使抗體-金奈米粒子溶液完全乾燥於聚酯纖維中。製備完成之膠體金膜 3 片如圖 8 所示。. 圖 8 膠體金膜檢測試劑整合中，樣品墊為最先接觸待測溶液之元件，因此樣品墊扮演過濾及處理待測溶液中干擾後端免疫反應之物質，並使標定待測物可隨著溶液順利流動至後方與免疫反應物接合，因此樣品墊材質選擇及前處理緩衝液調製則為重要影響因素。市面上之樣品墊通常有纖維素、玻璃纖維、人造纖維等過濾介質，本計畫中使用市售玻璃纖維作為樣品墊之材質，因其纖維可吸附血液中之大型蛋白質，如紅血球及黏蛋白等。另外前處理緩衝液則通常含有 pH 值鹽類緩衝液、界面活性劑、阻斷劑及其他增加免疫反應靈敏度之試劑，使待測溶液可順利通過樣品墊並在後續免疫反應可以有更佳的鍵結力，本計畫使用向聯華生技股份有限公司(Firstep Bioresearch Inc., R.O.C)承購之市售緩衝液進行樣品墊之前處理。於 150 mm 之樣品墊上滴入 1200 µL 緩衝液，使樣品墊完全浸漬在緩衝液中，並放入 50℃烘箱中烘乾四個小時，即完成樣品墊之前處理程序，如圖 9 所示。. 圖 9 樣品墊阻抗式檢測試劑整合分為四個部份：樣品墊、膠體金膜、硝化纖維膜、吸水墊。其中反應區之硝化纖維膜為主要帶動檢體流動之主要關鍵檢測試劑各元件完成前製處理後將進行貼合大板動作，如圖 10 所示。使其可透過前章所述之側流層析原理完成免疫反應。步驟 A，先將硝化纖維膜整合至檢測電極上，使其確實能被金膜及吸水墊覆蓋接觸且不翹曲，不致檢測時檢體流動因翹曲停止，導致檢測失敗。步驟 B，貼上先前凍乾完成之膠體金膜，使其覆蓋硝化纖維膜。步驟 C，將吸水墊覆蓋上硝化纖維膜約 1.5 mm 之長度，確保檢體可被吸水墊吸收。步驟 D，將 1.5 mm 之完成前處理樣品墊覆蓋於膠體金膜上。 11.

(19) 步驟 E，將寬度為 4 mm 的膠帶橫跨樣品墊、金膜及硝化纖維膜處貼上，此功用為當檢體大量流入時，將阻擋溢流現象發生，使檢體中抗原與金奈米粒子上抗體有完整鍵結反應時間，至此即完成檢測試劑。另外，在檢測電極晶片量測時，為了將檢測電極與快篩試劑整合，因此需要先將快篩試劑固定於塑膠片上，當檢體抗原抗體與金奈米粒子互相鍵結時，控制線和檢測線皆呈色，對準控制線和檢測線後，再將檢測電極與快篩試劑貼合，即可進行阻抗訊號量測，如圖 11 為實體之阻抗式檢測試劑五片。. 圖 10 大板貼合示意圖. 圖 11 阻抗式檢測試劑實體圖. 12.

(20) (四) 快篩試劑智慧行動檢測系統設計本計畫的阻抗感測晶片為 AD5933 IC[26-28]，如圖 12(a)所示，此晶片為 12 位元組抗轉換器，其頻率產生器可產生高達 50 kHz 電訊號，且量測範圍介於 100 Ω ~20 MΩ的複數阻抗，再利用傅立葉轉換反推阻抗中的電阻和電抗，再經由程式計算出實際阻抗值。 ATMEGA328 IC 為控制晶片[29]，如圖 12(b)所示，由 Atmel 公司開發的 megaAVR 系列中一個產品，ATMEGA328 IC 是八位元的微型控制器，同時具備寫入及讀取的快閃記憶體，因此將利用此晶片燒錄程式，達到計算阻抗值之目的。另外使用 MC34063 IC 為 DC-DC 的轉換晶片[30, 31]，如圖 12(c)所示，其目的為穩壓、升壓及降壓，除此之外，亦能將電路轉換成負向電壓，因為電壓轉換時，溫度變化低，故使用 MC34063 IC 作為電路板之電壓轉換晶片。電路板之電源供應為鋰電池，而 TP4056 IC 為鋰電池充電晶片[32]，如圖 12(d)所示，此晶片可配合 USB 電源進行充電，且有防倒充功能，故不需要另一個二極體輔助，為了使新型阻抗檢測系統可隨時量測阻抗電訊號，因此選擇使用 TP4056 IC 作為電路板之充電晶片。AMS1117 IC 為高效的線性穩壓晶片[33]，如圖 12(e)所示，經常用於交流電源為 5V 和 3.3V 的線性穩壓器和電池充電器，為了提供上述提到的鋰電池充電晶片(TP4056 IC)穩定的電壓，因此使用 AMS1117 IC 作為充電時的穩壓晶片。AD8606 IC 為低雜訊的 CMOS 運算放大器晶片，功能是將阻抗感測晶片(AD5933 IC) 量測的訊號進行運算，也因為其工作溫度範圍廣大(-40℃~125℃)，因此適合使用在手持式檢測系統的開發，如圖 12(f)所示。. (a). (b). (c). (d). (e). (f). 圖 12 晶片實體圖：(a)AD5933 IC，(b)ATMEGA328 IC，(c) MC34063 IC，(d)TP4056 IC， (e)AMS1117 IC，(f) AD8606 IC 本計畫使用電路圖規劃軟體(Altium Designer Bata V9.3)進行電路圖規劃，新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統之電路規劃圖為圖 13 所示，依照本計畫之阻抗量測需求，電路規劃主要分成五個部分，分別為微控制器(MCU)、晶片燒錄端(JTAG)、顯示器模組(OLED)、晶片通訊協定(I2C)以及電源供應系統(POWER)。其中，微控制器是由 ATMEGA328 IC 所控制，與市面上販售的 Arduino Uno 電路板使用相同的微控制器，屬於入門款的微控制器，並且容易撰寫程式。晶片燒路使用市售燒錄模組(FT232 USB UART)，如圖 14 所示，屬於邏輯閘數位積體電路，即 USB 端轉電晶體-電晶體邏輯電路（Transistor-transistor logic, TTL）的 13.

(21) 燒錄模組，其目的為 AMEGA328 IC 之程式燒錄。顯示器模組是使用市售的有機發光二極體螢幕(OLED)模組，如圖 15 所示，尺寸為 0.96 吋，其優點為高辨識率(128× 64)、低功耗 (0.06W)、寬供電範圍(直流 3V-5V)、工作溫度範圍(-30℃~70℃)並且支援兩種通訊協定方式 (SPI 與 I2C)。晶片通訊協定是由 AD5933 IC、AD8606 IC 搭配繼電器組成，繼電器的功能為控制開關，初始狀態設為常閉狀態，未量測阻抗訊號時，繼電器持續控制電路為斷路，反之，當量測阻抗訊號時，繼電器則會將電路板切換為通路。其過程為 AD5933 IC 接收阻抗訊號後，經傅立葉轉換，將訊號傳送至 AD8606 IC，再將訊號進行放大處理，最後傳至微控制器，並將阻抗量測結果線示於發光二極體螢幕模組上。電源供應系統則是使用 MC34063 IC、TP4056 IC 與鋰電池組成，為了避免電路板的電源暴衝，達到供應電壓穩定的狀態，因此使用 MC34063 IC 作為穩壓器，考慮手持式的新型糖化血色素檢測快篩判讀系統需要鋰電池作為無線狀態下的供電，因此選擇 TP4056 IC 作為鋰電池的充電晶片並設置一個 Micro USB 端，提供新型糖化血色素檢測快篩判讀系統電源穩定。. 圖 13 新型阻抗檢測系統之電路規劃圖. 圖 14 燒錄模組(FT232 USB UART). 圖 15 有機發光二極體螢幕模組(SSD 1306) 14.

(22) 本計畫現階段為了朝向微型化發展，一開始若依照電路設計圖直接開發電路板，易導致過多的成本損失，過程中需要一個測試版本的電路板，即為新型糖化血色素檢測快篩判讀系統，其特點必須能有即時更改的功能，因此目前依照圖 13 的電路規劃圖，使用電木萬用板，自行將所有零件焊接在電木萬用板上，如圖 16 所示。上述提到的電路設計圖，圖 17 為日後完成檢測系統微型化開發的電路設計圖，主要包括了電源開關、電源提示燈、訊號量測提示燈、訊號量測端、螢幕顯示器以及程式燒錄端。. 圖 16 新型糖化血色素檢測快篩判讀系統. 圖 17 快篩試劑檢測系統微型化之電路設計圖. 15.

(23) 結果與討論檢測試劑反應區薄膜結構觀察高分子溶液相轉換中，影響薄膜結構的因素有許多，其中濕度為主要控制孔洞結構之原因，由日前學長姊之實驗結果得知，相轉換中，濕度為75~80% RH 具有較佳孔隙率，若孔隙率越高，則表示硝化纖維膜具有較佳攜帶金奈米粒子能力進行側流層析偵測技術，將金奈米粒子傳遞至檢測區中與抗體鍵結，性能較佳的狀況下將使不同待測抗原濃度檢測中具有較佳鑑別度，因此控制濕度為 75~80% RH，作為本實驗參數之一。確定濕度參數後，修改高分子材料、溶劑與非溶劑之比例，目的是為了改善薄膜之表面結構，使薄膜結構更接近於市售之玻璃纖維膜，如表 1 為高分子材料、溶劑與非溶劑之參數表。表 1 硝化纖維膜製程參數表 Parameter. Experimental Condition. 硝化纖維素 (Nitrocellulose, NC). 12.2 wt%. 丙酮 (Propanone). 51.8 wt%. 乙酸甲酯 (Methyl Acetate, MA). 5.2 wt%. 異丙醇 (Isopropanol, IPA). 20.2 wt%. 甘油 (Glycerol). 5.0 wt%. 去離子水 (Deionized Water, DI Water). 5.6 wt%. 由上述製程參數可自製硝化纖維膜，其中達到穩定的薄膜厚度十分重要，若整體厚度不均，容易造成薄膜孔隙率過低，而無法順利使檢體抗原流動至硝化纖維膜之檢測區，因此使用掃描式電子顯微鏡進行硝化纖維膜之橫切面結構與厚度之研究，其量測出薄膜厚度經整理如表 2 為編號 1 至編號 5 之硝化纖維膜平均厚度，實際量測圖如下圖 18 所示。. 16.

(24) 表 2 硝化纖維膜平均厚度 Component. Membrane 1. Membrane 2. Membrane 3. Membrane 4. Membrane 5. Thickness (μm). 80.03. 78.30. 79.20. 77.23. 79.95. 圖 18 硝化纖維膜厚度實際測量圖 17.

(25) 經過研究計算，平均硝化纖維膜厚度為78.94 μm，標準差(SD)約為 1.06 μm，而變異係數 (CV%)為 1.34%。此薄膜厚度穩定性仍在可接受範圍內，將不會造成在相同濃度之檢測抗原下，阻抗量測誤差過大之影響。若阻抗量測誤差過大，將造成阻抗電性分析中無法判別 HbA1c 抗原和 Hb 抗原濃度，阻抗值與 HbA1c 抗原和 Hb 抗原濃度分析中，無濃度鑑別度，因此經由硝化纖維膜厚度研究，確認其厚度一致性。另外，硝化纖維膜製程中，除了薄膜厚度均勻之外，薄膜之表面結構更為重要，若表面結構不佳，將直接影響薄膜孔隙率，使薄膜孔隙率過低，檢測抗原、二次抗體與金奈米粒子則無法順利傳遞至硝化纖維膜之檢測區域，因此針對硝化纖維膜表面結構進行研究。實驗過程中發現若加入過多的甘油以及去離子水，容易造成硝化纖維膜表面產生裂痕，使本計畫之檢測失敗，如圖 19 所示，在掃描式電子顯微鏡觀察下，因製程時甘油和去離子水比例過高，使硝化纖維膜表面產生許多裂痕。. 圖 19 產生裂痕之硝化纖維膜表面最後，調整各種高分子材料、溶劑與非溶劑之比例，確認參數後，製作出較接近於市售硝化纖維膜之表面孔隙。在掃描式電子顯微鏡觀察硝化纖維膜表面時，如圖 20 為使用掃描式電子顯微鏡觀察市售硝化纖維膜表面結構，圖 21 為使用掃描式電子顯微鏡觀察自製之硝化纖維膜結構，兩者之孔隙率分別為 63.86 %與 59.35 %，相較之下，市售之硝化纖維膜表面更為粗糙，但有助於金奈米粒子滯留，使金奈米粒子不迅速流過檢測區域，能有足夠的時間與檢體抗原抗體鍵結。而自製之硝化纖維膜表面較為平滑，但經實驗測試後，仍然可達到與市售硝化纖維膜相似的反應結果。. 18.

(26) 圖 20 市售硝化纖維膜表面結構(掃描式電子顯拍攝). 圖 21 自製硝化纖維膜表面(掃描式電子顯拍攝). 19.

(27) 檢測電極之設計與實體檢測電極本設計使用電腦輔助設計 (Computer-aided design, CAD) 軟體 AutoCAD 2019 (Autodesk, USA)來設計檢測電極，其中檢測電極設計圖如圖 22 所示。將其設計成所需之圖形，並將圖檔輸出至印刷電極製作公司後，由專業之超高解析度之雷射印表機印製設計圖案於膠片上，即完成檢測電極的設計與製作，檢測電極實體圖如圖 23 所示。. (a). (b). (c) 圖 22 阻抗式檢測電極晶片設計尺寸圖：(a) 阻抗式檢測電極晶片設計圖，(b)量測電極尺寸示意圖，(c)檢測區電極尺寸示意圖. 20.

(28) 圖 23 檢測電極實體圖. 21.

(29) 完成抗體-膠體金噴點製作玻璃纖維膜上之測試線(T 線)與控制線(C 線)是檢測試劑中主要免疫反應區，因此依照 HbA1c 及 Hb 檢體濃度不同，T 線顏色深淺也有所差異，即血清中 HbA1c 及 Hb 濃度越高則於 T 線上附著之膠體金奈米粒子越多，T 線顏色也越深。而剩餘的血清檢體則繼續流動至 C 線，C 線上則具備高濃度之 IgG 抗體，此 IgG 會強迫與流過之 HbA1c–GC 及 Hb-GC 接合，不論 HbA1c–GC 及 Hb-GC 上是否有接上 HbA1c 及 Hb 抗體抗原都會與 IgG 接合，所以此為非專一性反應。[34, 35]因此 C 線主要功能為確認本免疫反應試劑功能是否正常，功能和操作皆正常的試劑不論血清中 HbA1c 及 Hb 抗原濃度多寡，其 C 線上必會留下膠體金奈米粒子而呈現紫紅色。主要原理為噴點至玻璃纖維膜上之抗體會附著於纖維上，等待已鍵結二次抗體-膠體金之抗原流動經過進而產生免疫反應。而一次抗體與抗原鍵結後，標記在二次抗體上之膠體金可因濃度多寡呈現肉眼可觀測的顏色深淺，因此線寬距離成為重要決定因素，若過寬會使藥品用量過大所需成本增加，若過窄則可能因鍵結數量不夠而使膠體金粒子呈色無法觀測，因此本計畫中採用市售試紙標準線寬 1 mm 做為參數設定依據，本計畫檢測品項為糖化血色素以及野色素兩種品項，因此有兩條測試線，上述兩種品項分別簡稱為 T1 線及 T2 線如圖 24 為使用陶瓷針點膠機進行抗體與膠體金噴點之實作圖。. 圖 24 陶瓷針點膠機. 22.

(30) 阻抗量測平台及量測測試利用新型阻抗檢測系統連接本實驗之阻抗式檢測電極晶片，當進行阻抗量測時，為避免電極晶片與 LCR meter 感測電極因人力施壓力量大小造成阻抗量測訊號偏差導致實驗誤差，因此製作阻抗量測平台維持各電極晶片量測環境。使用電腦輔助設計(Computer-Aided Design, CAD)軟體 AutoCAD® 2019 (Autodesk, United States of America)進行量測平台設計，量測平台尺寸為 95×46 mm，配合阻抗式檢測電極晶片之電極位置進行設計，利用二氧化碳雷射雕刻機進行 PMMA 之裁切，建立維持量測一致性之量測平台，阻抗量測平台如圖 25 所示，架設能即時分析阻抗訊號之穩定量測環境。. 圖 25 檢測電極晶片阻抗量測平台在阻抗量測平台測試中，使用相同參數製程之檢測試劑，滴入血色素抗原濃度為 240 μg/mL，檢測頻率由 100 Hz 至 1000 Hz 掃頻分析，進行三重覆實驗，量測使用量測平台前後之電訊號差異，表 3 和表 4 分別為使用量測平台前後之阻抗值。結果顯示，若使用量測平台放置檢測晶片所量測之阻抗值，其阻抗分析圖如圖 26 所示，頻率從 100 Hz 至 1000 Hz，在低頻率時，標準差較大，隨著量測頻率逐漸提高至 1000 Hz 時，經三重覆實驗所量測之阻抗值穩定。反之，若未使用量測平台放置檢測晶片所量測之阻抗值，其阻抗分析圖如圖 27 所示，當頻率從 100 Hz ~ 1000 Hz，無論在低頻或高頻，經三重覆實驗後，標準差和變異係數皆過大，表示量測訊號不穩定，容易導致日後檢體濃度判別的誤差，綜合上述，選擇使用量測平台輔助，達到量測穩定電訊號之目的。. 23.

(31) Frequency (Hz). 表 3 使用量測平台之阻抗值分析表 Impedance (Ohm) 1st 2nd 3rd Average. 標準差 (SD). 變異係數 (CV%). 100. 24429. 22199. 22357. 22995. 1016.0. 4.42%. 200. 19606. 18748. 18841. 19065. 384.4. 2.02%. 300. 17439. 17379. 17134. 17317. 131.6. 0.76%. 400. 16631. 16469. 16430. 16510. 87.3. 0.53%. 500. 16169. 15873. 15900. 15981. 133.7. 0.84%. 600. 15728. 15460. 15329. 15506. 166.3. 1.07%. 700. 15164. 14976. 15036. 15059. 78.4. 0.52%. 800. 14890. 14716. 14669. 14759. 95.0. 0.64%. 900. 14373. 14495. 14439. 14436. 50.2. 0.35%. 1000. 14201. 14271. 14270. 14247. 32.5. 0.23%. 圖 26 使用量測平台之阻抗分析圖. 24.

(32) Frequency (Hz). 表 4 未使用量測平台之阻抗值分析表 Impedance (Ohm) 1st 2nd 3rd Average. 標準差 (SD). 變異係數 (CV%). 100. 20400. 22338. 25139. 22625. 1945.4. 8.60%. 200. 17851. 18001. 19034. 18295. 525.9. 2.87%. 300. 16194. 16630. 17309. 16711. 458.6. 2.74%. 400. 15180. 15826. 16497. 15834. 537.5. 3.39%. 500. 14700. 15252. 15870. 15274. 478.1. 3.13%. 600. 14203. 14965. 15323. 14830. 467.1. 3.15%. 700. 13994. 14543. 14899. 14479. 372.6. 2.57%. 800. 13599. 14227. 14559. 14128. 398.3. 2.82%. 900. 13272. 14067. 14310. 13883. 443.3. 3.19%. 1000. 13150. 13879. 14107. 13712. 408.1. 2.98%. 圖 27 未使用量測平台之阻抗分析圖. 25.

(33) 快篩試劑智慧行動檢測系統與檢測試劑卡匣之整合為了開發新型阻抗檢測系統，本計畫選擇使用 AD5933 IC 和 ATMEGA328 IC 作為新型阻抗檢測系統的核心晶片，再配合 MC34063 IC、TP4056 IC 和 AMS1117 IC，這三種晶片可提供新型阻抗檢測系統穩定的電壓，而 AD5933 IC 和 ATMEGA328 IC 則是量測阻抗值中電阻值和電抗值，並經由程式計算及燒錄，完成新型阻抗檢測系統。而新型阻抗檢測系統，須配合檢測試劑卡匣(即檢測電極晶片阻抗量測平台)進行量測，如圖 28 所示，當檢測試劑滴入檢體抗原，檢體溶液中的抗原流經硝化纖維膜時，將與硝化纖維膜上的抗體鍵結，反應完畢後，測試線(T 線)則因不同濃度而有不同深淺的呈色，此時再將印刷電極與測試線(T 線)貼合，最後再由檢測試劑卡匣固定檢測試劑並進行阻抗訊號量測。. 圖 28 新型阻抗檢測系統與檢測試劑卡匣. 26.

(34) 完成快篩試劑智慧行動檢測系統對 HbAlc 及 Hb 檢測本計畫製作之檢測試劑可同時檢測兩種品項，即為 1C2T 之檢測試劑，其中測試線 T1 和測試線 T2 分別是檢測血色素抗原(Hb)和糖化血色素抗原(HbA1c)之抗原濃度。當不同濃度之抗原滴入檢測試劑後，將會與奈米金粒子和抗體結合，在測試線區域產生不同深淺的呈色，由於呈色深淺與奈米金粒子數量有關，因此可藉由新型阻抗量測系統量測阻抗電訊號，計算抗原濃度與阻抗值之間的關係，求得具專一性的檢量線。目前市售血糖機檢測範圍普遍為 2% ~ 14%，其中糖化血色素濃度 4% ~ 6.5%為正常值，若糖化血色素濃度高於 6.5%，可判斷為具糖尿病之風險，因此選擇糖化血色素濃度為 2, 4, 6.5, 8, 10 %做為檢測濃度。而目前血色素主要檢測範圍為 60 ~ 240 mg/ml，Hb 正常濃度範圍則是 120 ~ 180 μg/mL，血色素濃度太低即可能有貧血之風險，太高則可能有心血管疾病之風險，因此選擇血色素濃度為 80, 120, 180, 200, 240 μg/mL，進行檢測。選取上述濃度進行阻抗檢測，利用檢測之阻抗電性結果判斷不同濃度下之 HbA1c 和 Hb 濃度鑑別度與靈敏度。本計畫為不同濃度之血色素抗原(Hb)與糖化血色素抗原(HbA1c)，使用新型阻抗檢測系統進行阻抗訊號量測，其量測參數為表 5 所示，其目的為求出血色素抗原(Hb)與糖化血色素抗原(HbA1c)之檢量線。表 5 阻抗式檢測電極晶片線性趨勢分析實驗之參數表 Parameter. Experimental Condition. Frequency. 1000 Hz. HbA1c-Ab. 15 mg/mL. HbA1c. 2 , 4, 6.5, 8, 10 %. Hb-Ab. 6 μg/mL. Hb. 80, 120, 180, 200, 240 μg/mL. HbA1c -GC. 5 μg/mL. Hb -GC. 3 μg/mL. Reaction time. 15 min. LCR driving voltage. 10 mV. 首先量測測試線 T1，檢測品項為血色素，血色素抗原(Hb)之阻抗量測值如表 6 所示。因為在不同濃度的糖化血色素中(2 , 4, 6.5, 8, 10 %)，皆可量測到血色素在不同濃度 (80, 120, 180, 200, 240 μg/mL)下的阻抗值，因此在計算檢量線前，需先將血色素之阻抗量測值平均，如表 7 所示。阻抗量測值平均後，以血色素濃度為 X 軸，其阻抗平均值為 Y 軸作圖，如圖 29 所示，可得到一條線性趨勢線以及其公式，此趨勢線即為減量線與檢量線公式，求得檢量線公式為 y = -77.653 x + 32802，其中 y 代表量測之阻抗值，再由已知的阻抗值反推出互相對應的血色素抗原(Hb)濃度。. 27.

(35) 表 6 血色素抗原之阻抗量測值分析表糖化血色素濃度為 10 % 阻抗 (ohm). Hb 抗原 (μg/mL). 3. 平均阻抗值 (ohm). 1. 標準差. 240. 14115. 14153. 14272. 14180. 67.1. 200. 17389. 17473. 17467. 17443. 38.0. 180. 18582. 18484. 18458. 18508. 53.2. 120. 24008. 23974. 23493. 23825. 235.5. 80. 26146. 26494. 26459. 26366. 156.3. 3. 平均阻抗值 (ohm). 標準差. st. nd. 2. rd. 糖化血色素濃度為 8 % 阻抗 (ohm). Hb 抗原 (μg/mL). 1. 240. 14201. 14271. 14270. 14247.4. 32.5376. 200. 17611. 17377. 17474. 17487.4. 96.0971. 180. 18676. 18711. 18625. 18670.9. 35.2032. 120. 23850. 23614. 23602. 23688.4. 114.382. 80. 26442. 26711. 26595. 26583. 109.9. 3. 平均阻抗值 (ohm). 標準差. st. nd. 2. rd. 糖化血色素濃度為 6.5 % 阻抗 (ohm). Hb 抗原 (μg/mL). 1. 240. 14290. 14212. 14256. 14252.9. 31.9306. 200. 17419. 17413. 17558. 17463.3. 66.9258. 180. 18478. 18410. 18462. 18450.3. 28.9383. 120. 23656. 23738. 23705. 23699.6. 33.6088. 80. 25910. 26167. 26275. 26117. 153.4. 3. 平均阻抗值 (ohm). 標準差. st. nd. 2. rd. 糖化血色素濃度為 4 % 阻抗 (ohm). Hb 抗原 (μg/mL). 1. 240. 14182. 14126. 14016. 14108.3. 69.0129. 200. 17460. 17406. 17500. 17455.4. 38.1732. 180. 18534. 18450. 18412. 18465.3. 50.7388. 120. 23391. 23383. 23335. 23369.8. 24.776. 80. 27217. 27070. 27219. 27169. 69.7. st. nd. 2. rd. 28.

(36) 糖化血色素濃度為 2 % 阻抗 (ohm). Hb 抗原 (μg/mL). 3. 平均阻抗值 (ohm). 1. 標準差. 240. 14267. 14215. 14225. 14235.6. 22.4692. 200. 17465. 17383. 17401. 17416.1. 35.0757. 180. 18254. 18160. 18208. 18207.4. 38.2524. 120. 24442. 23542. 23556. 23846.4. 421.191. 80. 26442. 26336. 26438. 26405. 49.4. st. nd. rd. 2. 表 7 不同濃度血色素抗原之阻抗平均值分析表 Hb 抗原 (μg/mL) 240 200 180 120. 80. 阻抗平均值 (ohm). 14205. 17453. 18460. 23686. 26528. 標準差 (ohm). 73.3. 64.2. 154.7. 280.3. 371.7. 圖 29 血色素抗原之阻抗線性分析圖. 29.

(37) 量測測試線 T2，檢測品項為糖化血色素，在不同濃度的血色素中(80, 120, 180, 200, 240 μg/mL)，可量測到糖化血色素在不同濃度(2 , 4, 6.5, 8, 10 %)下的阻抗值，表 8 為糖化血色素抗原(HbA1c)之阻抗量測值。在計算其檢量線前，需先將糖化血色素之量測阻抗值平均，如表 9 所示。圖 30 則為糖化血色素抗原(HbA1c)之檢量線分析圖，其中因糖化血色素抗原 (HbA1c)濃度為百分比表示，因此其濃度會隨著血色素抗原(Hb)濃度浮動，故可求出多條檢量線，為了求出糖化血色素抗原(HbA1c)之檢量線，圖 30 中的多條檢量線，分別以糖化血色素抗原(HbA1c)濃度、血色素抗原(Hb)濃度和阻抗值作為空間中的 x、y 和 z 三軸，可模擬出一斜平面，如圖 31 為血色素抗原濃度、糖化血色素抗原濃度與阻抗值三者之間的分佈圖，因此將平面方程式求出，即可得到糖化血色素抗原 (HbA1c) 之檢量面公式為 x = 1−(1.26×10−3 )𝒚−(3.14×10−5 )𝒛 (4.52×10−2 ). ，由已知的血色素抗原濃度(Hb)和量測的阻抗值，即可求得糖化血色. 素抗原(HbA1c)濃度。表 8 糖化血色素抗原之阻抗量測值分析表血色素濃度為 240 μg/mL 阻抗 (ohm). HbA1c 抗原 (%). 3. 平均阻抗值 (ohm). 1. 標準差. 2. 8029. 8011. 7973. 8004. 23.3. 4. 10147. 10150. 10104. 10134. 20.6. 6.5. 11266. 11314. 11246. 11275. 28.2. 8. 13230. 13174. 13283. 13229. 44.7. 10. 15411. 15261. 15399. 15357. 68.2. 3. 平均阻抗值 (ohm). 標準差. st. nd. 2. rd. 血色素濃度為 200 μg/mL 阻抗 (ohm). HbA1c 抗原 (%). 1. 2. 10299. 10262. 10336. 10299. 30.1. 4. 11934. 11851. 11839. 11875. 42.3. 6.5. 13176. 13118. 13100. 13131. 32.5. 8. 15362. 15425. 15412. 15400. 27.1. 10. 17379. 17448. 17285. 17371. 66.6. st. nd. 2. rd. 30.

(38) 血色素濃度為 180 μg/mL 阻抗 (ohm). HbA1c 抗原 (%). 3. 平均阻抗值 (ohm). 1. 標準差. 2. 11576. 11587. 11621. 11595. 19.2. 4. 13236. 13276. 13210. 13241. 27.1. 6.5. 14920. 14874. 14780. 14858. 58.1. 8. 17162. 17126. 17235. 17174. 45.6. 10. 18554. 18454. 18519. 18509. 41.6. 標準差. st. nd. 2. rd. 血色素濃度為 120 μg/mL 阻抗 (ohm). HbA1c 抗原 (%). 1st. 2nd. 3rd. 平均阻抗值 (ohm). 2. 14602. 14656. 14738. 14665. 56.0. 4. 16777. 16811. 16944. 16844. 72.2. 6.5. 17777. 17751. 17826. 17785. 31.2. 8. 19998. 19914. 19802. 19905. 80.3. 10. 22149. 22233. 22215. 22199. 36.1. 3. 平均阻抗值 (ohm). 標準差. 血色素濃度為 80 μg/mL 阻抗 (ohm) HbA1c 抗原 (%). 1. 2. 18125. 18275. 18167. 18189. 63.3. 4. 20329. 20384. 20318. 20344. 28.7. 6.5. 21515. 21418. 21363. 21432. 62.6. 8. 23122. 23212. 23413. 23249. 121.9. 10. 25517. 25370. 25519. 25469. 69.7. st. nd. 2. rd. 表 9 不同濃度糖化血色素抗原之阻抗平均值分析表 HbA1c 抗原 (%). 平均阻抗值 (Ohm). 10. 8. 6.5. 4. 2. Hb_240 Hb_200. 8004 10299. 10134 11875. 11275 13131. 13229 15400. 15357 17371. Hb_180. 11595. 13241. 14858. 17174. 18509. Hb_120. 14665. 16844. 17785. 19905. 22099. Hb_80. 18189. 20344. 21432. 23249. 25469. 31.

(39) 圖 30 糖化血色素抗原之阻抗圖. 圖 31 阻抗值與抗原濃度關係分佈圖. 32.

(40) 上述檢量面公式(x =. 1−(1.26×10−3 )𝒚−(3.14×10−5 )𝒛 (4.52×10−2 ). )，x、y 和 z 三軸分別表示為糖化血色素抗. 原(HbA1c)濃度、血色素抗原(Hb)濃度和阻抗量測值，當血色素抗原(Hb)濃度和阻抗量測值已知時，即可反推糖化血色素濃度，如表 10 所示，並且能計算其反推值與理論值之間的誤差，如表 11 所示。由於糖化血色素濃度過低時，接近新型阻抗檢測系統的量測極限，導致誤差值容易被放大，因為不影響糖化血色素濃度在正常範圍的判讀，且糖化血色素濃度在正常範圍中的誤差皆可接受，因此確認使用上述方法求得之檢量面公式是可行的。表 10 量測阻抗值反推糖化血色素抗原濃度分析表 HbA1c 抗原 (%) 10. 8. 6.5. 4. 2. Hb_240 Hb_200. 9.75 9.94. 7.38 8.19. 6.11 6.79. 3.94 4.27. 1.57 2.08. Hb_180. 9.88. 8.05. 6.25. 3.67. 2.19. Hb_120. 10.58. 8.16. 7.12. 4.76. 2.32. Hb_80. 9.41. 7.02. 5.81. 3.79. 1.32. 表 11 糖化血色素抗原濃度之誤差值分析表 HbA1c_10. HbA1c_8. HbA1c_6.5. HbA1c_4. HbA1c_2. Hb_240 Hb_200. 2.54% 0.58%. 7.77% 2.38%. 6.01% 4.52%. 1.55% 6.81%. 21.37% 4.09%. Hb_180. 1.25%. 0.57%. 3.87%. 8.16%. 9.49%. Hb_120. 5.83%. 2.01%. 9.47%. 18.98%. 16.00%. Hb_80. 5.87%. 12.27%. 10.63%. 5.28%. 33.91%. 本計畫將未知濃度之血色素抗原(Hb)和糖化血色素抗原(HbA1c)之抗原濃度利用電性鑑別法原理，即利用新型阻抗檢測系統進行阻抗量測，應用檢量線之阻抗值對應其抗原濃度，透過檢量線對照方式得知未知濃度之檢體樣品，證明此檢測試劑阻抗量測方式可由原本檢測試劑呈色定性判斷進階為應用電性鑑別之定量量測。由上述之檢測結果顯示，檢測試劑之定量量測可行性。將導入本實驗所自行開發的新型阻抗檢測系統，利用檢測試劑免疫反應呈色結果作為檢測標的，使免疫呈色反應之偵測在定性、定量分析上更加精確，朝向高靈敏度及檢測物專一性佳的趨勢。. 33.

(41) 完成光學影像辨識系統檢測糖化血色素與血色素最後，檢測試劑在相同條件下，使用本團隊過去所開發之快篩試劑光學影像判讀系統，如圖 32 所示，量測糖化血色素與血色素的光學影像數據並作圖，再與新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統所量測的阻抗分析比較兩者之間的差異。在光學影像判讀設備中，血色素抗原之量測結果如表 12 所示，血色素抗原濃度為 80, 120, 180, 200, 240 μg/mL 條件下，量測光學影像數據後，將其數據平均得到平均灰階值分別為 255、237、183、172 和 139，接著以血色素抗原濃度為 X 軸，量測後計算的平均灰階值為 Y 軸作圖，即可得到一條光學判讀系統的線性趨勢線，其公式 y = - 0.7453 x + 319.44 則為血色素抗原在光學判讀系統上的檢量線公式，若量測到未知血色素抗原濃度的灰階值時，仍可從灰階值反推血色素濃度，其檢量線與上述圖 33 快篩試劑智慧行動檢測系統求得之血色素抗原濃度檢量線公式 y = - 77.653 x + 32802 相比，兩者之間，其斜率與截距因為數值的關係，幾乎只有倍數上的差異，因此可說明光學影像判讀系統與自製的快篩試劑智慧行動檢測系統兩者檢測結果吻合，未來仍可朝此方向進行系統硬體與韌體的優化，期望將檢測誤差盡可能降低。. 圖 32 快篩試劑光學影像判讀系統表 12 不同濃度血色素抗原之平均灰階值分析表. Hb 抗原 (μg/mL). 240. 200. 180. 120. 80. 平均灰階值. 139. 172. 183. 237. 255. 標準差. 1.738. 2.647. 1.875. 3.768. 3.645. 34.

(42) 圖 33 血色素抗原之灰階值線性分析圖. 35.

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(44) [21] Vip Viprakasit, Sarah Green, Sue Height, Helena Ayyub, Douglas R. Higgs, “Hb H hydrops fetalis syndrome associated with the interaction of two common determinants of α thalassaemia (‐ ‐ MED/αTSaudiα)”, British Journal of Haematology, 117, pp. 759-762, 2002. [22] B. Leyland-Jones, V. Semiglazov, M. Pawlicki, T. Pienkowski, S. Tjulandin, G. Manikhas, A. Makhson, A. Roth, D. Dodwell, J. Baselga, M. Biakhov, K. Valuckas, E. Voznyi, L. Xiangyang, and E. Vercammen, “Maintaining Normal Hemoglobin Levels With Epoetin Alfa in Mainly Nonanemic Patients With MetastaticBreast Cancer Receiving First-Line Chemotherapy: A Survival Study”, American Society of Clinical Oncology, 23, pp. 5960-5972, 2005 [23] A. L. Ahmad, S. C. Low, S. R. Abd Shukor, A. Ismail, and A. R. Sunarti, “Development of lateral flow membranes for immunoassay separation,” Desalination and Water Treatment, 5, p. 99-105, 2009. [24] A. L. Ahmad, S. C. Low, S. R. Abd Shukor, and A. Ismail, “Investigating membrane morphology and quantity of immobilized protein for the development of lateral flow immunoassay,” Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 33, p. 48-58, 2012. [25] 賴君義，以非溶劑誘導相分離來製備具雙連續結構之微孔膜-機制探討、製程設計及應用評估，行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告，民國九十八年。 [26] Yen-Chi Chen, “The Development of Compact Electrochemical Impedance Analyzer,” I-Shou University, 2013. [27] 阻抗量測中的萬能法寶，醫療物聯網，2019 年 7 月，取自 http://www.compotechasia.com/u ploads/technology/243/243_adi_iomt.pdf [28] 數位波形產生器為感測器阻抗測量提供靈活頻率調節，電子工程專輯，2006 年 8 月，取自 https://archive.eettaiwan.com/www.eettaiwan.com/ART_8800428097_480502_TA_7f0bf765.HTM [29] 在麵包板上建構 Arduino，2013 年 9 月，取自 http://yehnan.blogspot.com/2013/09/arduino_ 9.html [30] 基於 MC34063 的開關電源設計，電子技術應用，2016 年 2 月，取自 https://kknews.cc/zh -tw/design/rx64y2o.html [31] MC34063 電源升壓電路板，喬治查爾電子電路網，2007 年 5 月，取自 http://gc.digitw.co m/new_page_22.htm [32] TP4056 (1A 線性鋰離子電池充電器)，南京拓微集成電路有限公司，取自 http://www.tpasic.com/res/tp-asic/pdres/201802/TP4056esop8.pdf [33] AMS1117 典型電路圖淺談 AMS1117 電路應用，電子發燒友，2018 年 9 月，取自 http:// m.elecfans.com/article/787967.html [34] Shu Hwang Ang , Choo Yee Yu , Geik Yong Ang , Yean Yean Chan , Yatimah binti Alias and Sook Mei Khor,” A colloidal gold-based lateral flow immunoassay for direct determination of haemoglobin A1c in whole blood,” Analytical Methods, vol.7, pp.3972-3980, 2015. [35] Torill Furuset, Camilla R. Hestbraten, Marit H. Hallberg, Astrid Steiro, Iren R. Orset and Jens P. Berg, “HbA1c analysis by capillary electrophoresis – comparison with chromatography and an immunological method,” Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, vol.77, pp.458-464,2017.. 37.

(45) 科技部補助專題研究計畫成果自評表請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況、研究成果之學術或應用價值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）、是否適合在學術期刊發表或申請專利、主要發現（簡要敘述成果是否具有政策應用參考價值及具影響公共利益之重大發現）或其他有關價值等，作一綜合評估。 1.請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況作一綜合評估. 達成目標未達成目標（請說明，以100 字為限） □實驗失敗 □因故實驗中斷 □其他原因說明：. 2. 研究成果在學術期刊發表或申請專利等情形(請於其他欄註明專利及技轉之證號、合約、申請及洽談等詳細資訊) 論文：□已發表□未發表之文稿 撰寫中□無專利：□已獲得□申請中 無技轉：□已技轉□洽談中無其他：（以200 字為限） 3. 請依學術成就、技術創新、社會影響等方面，評估研究成果之學術或應用價值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性，以 500 字為限）。長年以來學界都致力於希望能快速檢查出糖尿病，期望達到即早發現，即早治療之目的，由於市面上糖尿病的檢測項目大多為血糖濃度檢測，但血糖濃度容易受是否進食影響，因此使用在人體中濃度較為穩定的糖化血色素為標的物。本研究計畫成功開發出之新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統，可使用少量的檢測抗原初步檢測血色素與糖化血色素濃度。未來期望可切入全球正在快速發展中之體外檢測產業市場，結合企業開發可迅速商品化且量產之快速檢驗試劑，實現產業效益，並可為居家照護及偏遠地區醫療院所提供方便、低成本之糖尿病速檢測診斷設備，建立第一道預防醫療防線。. 38.

(46) 4. 主要發現. 否. □是，建議提供機關 □是. 說明：(以 150 字為限). 39.

(47) 科技部補助國內專家學者出席國際學術會議報告 108 年 11 月 8 日服務機構. 國立成功大學工程科學系教授. 報告人姓名. 林裕城. 會議時間地點. 108 年 10 月 26 日至 108 年 10 月 31 本會核定日補助文號加拿大，蒙特婁. 會議名稱. Committee Meetings、AdCom Meeting、IEEE SENSORS 2019 研討會、Editorial Board Meeting、SENSORS 2019 Wash-up Meeting. 發表論文題目. 此次為出席 IEEE SENSORS COUNCIL 行政會議及研討會,無發表論文. 及職稱. MOST 108-2221-E-006-203 -. 一、參加會議經過本人於 2019 年繼續擔任 IEEE 感知器委員會（ IEEE Sensors Council ）之 Members-at-Large，主要負責協助國際會議長（VP-Conferences）推動有關會議進行，因擔任國際會議長(VP-Conferences)長達四年(2013-2017)規定只能擔任二任期，但本人在推動會議上經驗豐富，故再次被選為 Members-at-Large(2018-2019),協助國際會議長推動會議工作，本年度行前行政會議與研討會於 108 年 10 月 26 日-10 月 31 日在加拿大，蒙特婁舉辦，會議與研討會行程如下: (1)10/26 8:00 - 12:00 Committee Meetings：參加會議。 12:00 - 18:00 AdCom Meeting：參加會議。 (2)10/27 8:00 - 16:00 AdCom Meeting ：參加會議。 (3)10/27-10/30 IEEE SENSORS 2019 研討會：觀察並監督檢討本次會議優缺點。 (4)10/28 15:00-17:00 SENSORS 2019 Committee Meeting 及 IEEE Sensors Journal、IEEE Sensors Letters 短文期刊的 Editorial Board Meeting：參加會議。 (5)10/31 SENSORS 2019 Wash-up Meeting：參與 IEEE SENSORS 2019 研討會會後總檢討。其中第(1)-(5)項皆是以 IEEE SENSORS Council 核心人物 Members-at-Large 的身分主持或參加，第(4)項 Editorial Board Meeting 則是在 IEEE Sensors Journal 以期刊副主編身份參加，而在 IEEE Sensors Letters 則是以副總主編身份參加。. 附件三.

(48) 圖一為本次行前行政會議所有與會人員，圖二為其中一場 AdCom Meeting 的開會現場：. 圖一行政會議所有與會人員.

(49) 圖二 AdCom Meeting開會現場圖三為研討會開幕演講、圖四為研討會現場：. 圖三研討會開幕演講.

(50) 圖四研討會現場.

(51) 圖五為本人於研討會現場留影：. 圖五本人於研討會現場留影二、與會心得我國學者參與國際知名組織的運作並不積極，如本人所參與的IEEE Sensors Council, 主要職位有10個，次要職位有5個，總共15個職位中，在近8年中，其他台灣的學者只有一位擔任次要職位二年，另外就是本人所擔任的Vice President for Conferences共4年及 Members-at-Large共兩年，實在太少了，難以產生國際影響力。三、建議鼓勵年輕學者多參加國際組織，提高台灣在國際的影響力。.

(52) 108年度專題研究計畫成果彙整表計畫主持人：林裕城. 計畫編號：108-2221-E-006-203-. 計畫名稱：新型糖化血色素檢測之快篩判讀系統成果項目. 質化（說明：各成果項目請附佐證資料或細單位項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起訖頁數、證號...等） . 量化. 期刊論文. 0. 研討會論文. 0. 篇. 專書國學術性論文內專書論文. 0 本. 技術報告. 0 篇. 其他. 0 篇. 期刊論文. 0. 研討會論文. 0. 0 章. 篇. 專書國學術性論文外專書論文. 0 本. 技術報告. 0 篇. 其他. 0 篇. 大專生. 0. 碩士生. 0. 博士生. 0. 博士級研究人員. 0. 專任人員. 0. 大專生. 0. 碩士生. 0. 博士生. 0. 博士級研究人員. 0. 專任人員. 0. 本國籍參與計畫人力非本國籍. 其他成果（無法以量化表達之成果如辦理學術活動、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國際影響力及其他協助產業技術發展之具體效益事項等，請以文字敘述填列。） . 0 章. 人次.

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