藥品中亞硝胺類化合物之檢驗方法

藥品中亞硝胺類化合物之檢驗方法

多重分析(液相層析串聯質譜法) Method of Test for Nitrosamines in Medicines - Multiple Analysis (LC-MS/MS

Method)

1. 適用範圍：本檢驗方法適用於藥品中N-nitrosodiethanolamine (NDELA)等12 項亞硝胺類化合物之檢驗。如有不適用之藥品，可自行探討並 經確效後使用。

2. 檢 驗 方 法 ： 檢 體 經 萃 取 後 ， 以 液 相 層 析 串 聯 質 譜 儀 (liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC-MS/MS)分析 之方法。

2.1. 裝置：

2.1.1. 液相層析串聯質譜儀：

2.1.1.1. 離 子 源 ： 大 氣 壓 力 化 學 游 離 (atmospheric pressure chemical ionization, APCI)。

2.1.1.2. 層析管：XSelect HSS T3，3.5 μm，內徑3 mm × 15 cm，或同級品。

2.1.2. 超音波振盪器(Ultrasonicator)。

2.1.3. 離心機(Centrifuge)：可達3000 ×g以上者。

2.2. 試藥：甲醇、乙腈及甲酸均採用液相層析級；去離子水(比電阻於25℃

可 達 18 MΩ ． cm 以 上 ) ； NDELA 等 12 項 對 照 用 標 準 品 ；

(NDELA-d

)等5項同位素內部標準品 (品項見附表)。

2.3. 器具及材料：

2.3.1. 容量瓶：10 mL，褐色。

2.3.2. 離心管：15 mL，PP材質。

2.3.3. 濾膜：孔徑0.22 μm，PVDF材質。

2.3.4. 研缽。

2.4. 10%甲醇溶液之調製：

取甲醇與去離子水以1：9 (v/v)之比例混勻。

2.5. 移動相溶液之調製：

2.5.1. 移動相溶液A：

取甲酸1 mL，加去離子水使成1000 mL，混合均勻後，經濾膜過濾，

取濾液供作移動相溶液A。

2.5.2. 移動相溶液B：

取甲酸1 mL及乙腈200 mL，加甲醇使成1000 mL，混合均勻後，供

作移動相溶液B。

2.6. 內部標準溶液之配製：

取適量NDELA-d

等5項同位素內部標準品，精確稱定，分別以甲醇溶解 並稀釋至50 μg/mL，作為內部標準原液，冷凍避光貯存。臨用時取適量 各內部標準原液混合，以甲醇稀釋至0.4 μg/mL，供作內部標準溶液。

2.7. 標準溶液之配製：

取適量NDELA等12項對照用標準品，精確稱定，分別以甲醇溶解並稀 釋至50 μg/mL，作為標準原液，冷凍避光貯存。臨用時取適量各標準原 液與內部標準溶液混合，以10%甲醇溶液稀釋至2.5～50 ng/mL (含內部 標準品濃度20 ng/mL)，供作標準溶液。

2.8. 標準曲線之製作：

精確量取標準溶液各10 μL，分別注入液相層析串聯質譜儀中，依下列 條件進行分析，就各亞硝胺類化合物與內部標準品之波峰面積比，與對 應之亞硝胺類化合物濃度，分別製作標準曲線。

液相層析串聯質譜分析測定條件

：

層析管：XSelect HSS T3，3.5 μm，內徑3 mm × 15 cm。

層析管溫度：40℃。

移動相溶液：A液與B液以下列條件，進行梯度分析

時間(min) A (%) B (%) 0.0 → 1.0 95 → 95 5 → 5 1.0 → 5.0 95 → 50 5 → 50 5.0 → 6.5 50 → 50 50 → 50 6.5 → 7.5 50 → 35 50 → 65 7.5 → 8.5 35 → 35 65 → 65 8.5 → 9.5 35 → 0 65 → 100 9.5 → 12.0 0 → 0 100 → 100 12.0 → 12.1 0 → 95 100 → 5 12.1 → 15.0 95 → 95 5 → 5 移動相流速：0.6 mL/min。

注入量：10 μL。

離子化模式：APCI正離子。

放電電流(Nebulizer current)：5 μA。

氣簾氣體(Curtain gas)：25 psi。

霧化氣體(Gas 1)：50 psi。

碰撞氣體(Collision gas)：medium。

加熱溫度(Temperature)：400℃。

偵測模式：多重反應偵測(multiple reaction monitoring, MRM)。偵測 離子對、去集簇電壓(declustering potential)及碰撞能量 (collision energy)如附表。

註：上述測定條件分析不適時，可依所使用之儀器，設定適合之測定條 件。

2.9. 檢液之調製：

將檢體磨碎混勻，取約250 mg，精確稱定，置於離心管中，加入內部標 準溶液0.25 mL及甲醇0.25 mL，混合均勻，超音波振盪5分鐘，加入去 離子水4.5 mL，混合均勻，超音波振盪5分鐘，以3000 ×g離心5分鐘，

取上清液，經濾膜過濾，供作檢液。

2.10. 鑑別試驗及含量測定：

精確量取檢液及標準溶液各10 μL，分別注入液相層析串聯質譜儀中，

依2.8.節條件進行分析。就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間及多重 反應偵測相對離子強度

鑑別之，並依下列計算式求出檢體中各亞硝 胺類化合物之含量(μg/g)：

檢體中各亞硝胺類化合物之含量(μg/g) = C × V

M × 10

C：由標準曲線求得檢液中各亞硝胺類化合物之濃度(ng/mL) V：萃取檢體之甲醇溶液體積(5 mL)

M：取樣分析檢體之重量(g)

註：相對離子強度由定性離子對與定量離子對之波峰面積相除而得(≦

100%)，容許範圍如下：

相對離子強度(%) 容許範圍(%)

＞ 50 ± 20

＞ 20～50 ± 25 ＞ 10～20 ± 30

≦ 10 ± 50

附註：1. 本檢驗方法之定量極限，NDELA等12項亞硝胺類化合物均為0.05 μg/g。

2. 檢體中有影響檢驗結果之物質時，應自行探討。

參考文獻：

1.

Ripollés, C., Pitarch, E., Sancho, J. V., López, F. J. and Hernández, F. 2011.

Determination of eight nitrosamines in water at the ng L

levels by liquid

chromatography coupled to atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry. Anal. Chim. Acta 702: 62-71.

2.

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Karlsruhe. 2019.

Method for the determination of NDMA and NDEA by LC-MS/MS in Sartan containing film coated tablets. CVUA Karlsruhe, Germany (OMCL BW).

3.

Parr, M. K. and Joseph, J. F. 2019. NDMA impurity in valsartan and other

pharmaceutical products: Analytical methods for the determination of

參考層析圖譜

m/z 75 > 43 m/z 135 > 74 NDELA

NDMA

m/z 117 > 87 NMOR

NDiPLA m/z 163 > 88

m/z 147 > 117 m/z 89 > 61 NMBA

NMEA

NPYR m/z 101 > 55

m/z 103 > 75 NDEA

NPIP m/z 115 > 69

m/z 117 > 75 NEiPA

m/z 131 > 89 m/z 131 > 89 NDiPA

NDPA

m/z 143 > 111 m/z 81 > 46

m/z 150 > 120 NDELA-d₈

NDMA-d

6

NMBA-d

3

NDEA-d₄

NDPA-d

14

m/z 107 > 77 m/z 145 > 50

圖、以 LC-MS/MS 分析 NDELA 等 12 項對照用標準品及 NDELA-d₈等 5 項同位素內部 標準品之 MRM 圖譜

附表、NDELA 等 12 項亞硝胺類化合物及同位素內部標準品之多重反應偵測模式參數

項次 分析物

定量離子對 定性離子對

內部標準品 前驅離子(m/z)＞

產物離子(m/z)

去集簇 電壓

(V)

碰撞 能量 (eV)

前驅離子(m/z)＞

產物離子(m/z)

去集簇 電壓

(V)

碰撞 能量 (eV)

1 N-Nitrosodiethanolamine (NDELA) 135 > 74 29 17 135 > 104 29 9 NDELA-d₈ 2 N-Nitrosodiethylamine (NDEA) 103 > 75 25 13 103 > 47 25 29 NDEA-d4

3 N-Nitrosodiisopropanolamine (NDiPLA) 163 > 88 44 17 163 > 70 44 28 NMBA-d3

4 N-Nitrosodiisopropylamine (NDiPA) 131 > 89 50 13 131 > 43 50 22 NDPA-d14

5 N-Nitrosodimethylamine (NDMA) 75 > 43 28 21 75 > 58 28 15 NDMA-d6

6 N-Nitrosodipropylamine (NDPA) 131 > 89 59 14 131 > 43 59 21 NDPA-d₁₄ 7 N-Nitrosoethylisopropylamine (NEiPA) 117 > 75 16 14 117 > 47 16 22 NDEA-d4

8 N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric acid (NMBA) 147 > 117 10 8 147 > 87 10 16 NMBA-d₃ 9 N-Nitrosomethylethylamine (NMEA) 89 > 61 7 16 89 > 29 7 27 NMBA-d3

10 N-Nitrosomorpholine (NMOR) 117 > 87 38 17 117 > 86 38 20 NMBA-d3

11 N-Nitrosopiperidine (NPIP) 115 > 69 42 21 115 > 41 42 33 NDEA-d₄ 12 N-Nitrosopyrrolidine (NPYR) 101 > 55 58 22 101 > 41 58 37 NMBA-d3

I.S. N-Nitrosodiethanolamine-d₈ (NDELA-d₈) 143 > 111 23 8 － － － － I.S. N-Nitrosodiethylamine-d4 (NDEA-d4) 107 > 77 48 16 － － － － I.S. N-Nitrosodimethylamine-d₆ (NDMA-d₆) 81 > 46 106 25 － － － － I.S. N-Nitrosodipropylamine-d14 (NDPA-d14) 145 > 50 130 46 － － － － I.S. N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric acid-d3

(NMBA-d₃) 150 > 120 36 9 － － － －