科技部補助
大專學生研究計畫研究成果報告
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計 畫 ：
名 稱
油茶種殼等廢棄物之免疫調節功效研究
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執行計畫學生： 葉秋伶
學生計畫編號： MOST 104-2815-C-041-001-B
研 究 期 間 ： 104 年 07 月 01 日至 105 年 02 月 28 日止，計 8 個月 指 導 教 授 ： 吳明娟
處理方式： 本計畫可公開查詢
執 行 單 位： 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學生物科技系
一、摘要
油茶為山茶科山茶屬的常綠小喬木，其種子成熟後經榨油，俗稱苦茶油。油 茶除種子提供榨油外，果殼 (fruit coat)、種殼 (seed shell) 及油茶粕 (pomace) 皆 為榨油後之油茶廢棄物。研究中鑑定出來的油茶廢棄物生理活性成分主要為三萜 皂素、多酚類、多醣類。台灣主要栽種之油茶分為兩類，大果種油茶 (Camellia oleifera) 及小果種油茶 (Camellia tenuifolia)。其中大果種由大陸引進，免疫功效
之相關研究甚多，而台灣原生小果種尚未有人發表。
本研究與花蓮農改場合作，以當地生產小果油茶後產生之廢棄物為材料，進 一步以溶劑萃取分層得到不同區分。利用 DPPH 自由基的清除和總多酚含量，
評估小果油茶之廢棄物的區分之抗氧化功效。接著以脂多醣 (LPS) 刺激巨噬細 胞 RAW264.7 試驗，探討小果油茶之廢棄物區分抑制發炎媒介物一氧化氮 (NO) 的產生以及細胞激素介白素-6 (IL-6) 分泌能力的功效，並進一步探討抗發炎機 轉。結果發現小果種殼乙醇粗萃取物的甲醇區分具有明顯抗氧化及抗發炎效果，
並且能抑制誘導型一氧化氮合成酶 (iNOS) 的蛋白表現並降低 IL-6 產量。由上 述結果可推論，小果油茶廢棄物可能具抗氧化及抗發炎功效，有進一步開發的機 會，促使油茶廢棄物再利用，實現環保理念。
二、研究動機與研究問題
油茶除種子提供榨油外，果殼 (fruit coat)、種殼 (seed shell) 及油茶粕 (pomace) 皆為油茶榨油後之加工廢棄物。有關油茶廢棄物可作為資源化的相關 研究甚多，在研究中鑑定出來的生理活性成分主要為皂素。然而；根據許多研究 顯示，大果種油茶廢棄物生理活性成分主要為皂素、黃酮類及多醣類，並且具有 抗發炎及抗氧化功效；相較之下，小果種油茶廢棄物之相關研究報告僅一篇，其 在探討有關小果種油茶廢棄物之抗氧化及抗衰老功效。本實驗欲探討小果種油茶 廢棄物之抗氧化及抗發炎功效，以作為開發油茶副產物功能性產品之基礎，另一 方面也促使油茶廢棄物再利用。
三、文獻回顧與探討
油茶為山茶科山茶屬的常綠小喬木，其種子成熟後經榨油，俗稱苦茶油。苦 茶油為世界四大木本食用油之一，它的物理、化學特性和橄欖油極為相似，有東 方的橄欖油之稱。苦茶油英名 camellia seed oil，目前台灣種植的油茶品種有二 種，一為栽培種油茶，又稱大果種油茶 (Camellia oleifera)，另一種為野生細葉 油茶，又稱小果種油茶 (Camellia tenuifolia) (陳俊仁 and 孫文章 2011)。
苦茶油除種子提供榨油外，果殼 (fruit coat)、種殼 (seed shell) 及油茶粕 (pomace) 皆為榨油後之油茶廢棄物。油茶粕在榨油後產生，通常含有未完全榨 出的油脂，以及醣類、粗纖維、粗蛋白、皂素、黃酮等種物質，具多種生物活性。
因其含有皂素，具有良好起泡性，將其與茶箍敲碎，研磨成粉，即為茶粉，亦稱 茶麩，被利用為天然環保清潔劑，可清洗蔬果、碗盤、衣物、衛浴等物品，或清 潔臉、手、泡腳等身體部位。茶粕也常被應用於清除水田內之福壽螺或其他軟體 動物。此外，茶粕尚具生物活性，例如：溶血、消炎、抑制蟎、菜蟲等(吳嘉盈 2009;
楊正偉 2007)。油茶廢棄物相關研究文獻甚多，在研究中鑑定出來的生理活性成 分主要為三萜皂素、多酚類、多醣類，其中皂素具有抗菌、抗發炎及抗氧化的活 性(Chen et al. 2010; Hu et al. 2012; Ye, Xing, and Chen 2013; Zhang et al. 2014)。
除了皂素外，油茶廢棄物尚有含多種類黃酮及類黃酮的配糖體 (Chen et al.
2009)，其中尤以山奈酚 (kaempferol) 衍生物的相關研究最多(Chen et al. 2009;
Cheng et al. 2014; Gao et al. 2011; Liu et al. 2014; Ye et al. 2012; Ye, Guo, and Luo 2012; Huang 2009)。這些類黃酮具有強抗氧化性(Chen et al. 2010)，抗發炎及止痛 功效(Ye, Guo, and Luo 2012)，不管在試管實驗或是活體實驗中，都具良好的抗氧 化能力，可當作氧化劑保護腦部免於受到自由基之傷害(Ye et al. 2012)，也具強抗 發炎能力(Liu et al. 2014)，可保護腸胃道黏膜發炎的功能(Cheng et al. 2014)。
油茶果殼多醣類分子量為 362 kDa 的區分在試管實驗中，具有清除超氧離 子及羥自由基的能力，且成分含有 rhamnose、fructose、arabinose、mannose、
galactose、glucose (Jin 2012)；另外油茶粕的多醣體在動物實驗中，具有毒殺 sarcoma 180 腫瘤細胞的能力 (Jin and Ning 2012)。
以上為油茶廢棄物之利用，相較之下油茶種殼之免疫調節的相關研究較少，
又因小果種部分免疫調節相關功效尚未有人發表，因此本研究擬以細胞培養 (RAW264.7) 試驗，探討小果油茶廢棄物之各區分抑制免疫 mediator (NO) 的產 生、細胞激素 (IL-6) 的分泌能力，以評估小果油茶廢棄物之抗發炎功效活性及 機轉。
四、研究方法及步驟
1. 小果油茶廢棄物的製備
首先以酒精粗萃後得粗萃物 (crude extract)，粗萃物再以不同溶劑進行再次 萃取分層，分為正己烷區分 (n-hexane fraction)、甲醇區分 (methanol fraction)、
正丁醇區分 (n-butanol fraction) 與 H2O (H2O fraction) (圖一、二)；而茶粕粗萃後
之酒精不溶物再以水進行一次萃取得酒精不溶層 (圖三)。
圖一、小果油茶廢棄物果殼萃取流程。
圖二、小果油茶廢棄物種殼萃取流程。
圖三、小果油茶廢棄物茶粕萃取流程。
2. Folin-Ciocalteu 分析
在 ELISA plate 中，加入 8 l Folin-Ciocalteu 試劑，再加入 20 l 適當稀 釋後的樣品混合均勻，在室溫下反應 10 分鐘。加入 2% Na2CO3 溶液 (200
l/well) 混合均勻，於室溫下反應 10 分鐘。以 ELISA reader 偵測 A620 並記 錄，結果以每毫克的萃取物含有多少微克的沒食子酸 (gallic acid) 來表示 (g GAE/mg dw)。
3. DPPH 自由基清除能力測定
取 990 l 新鮮配製 0.1 mM DPPH 之甲醇溶液 (Merck)，加入 10 l 待測 樣品，另以 α-Tocopherol (vitamin E) 來作為評估的對照組。混合後，於水浴 37oC 反應 30 分鐘，測定 A517 並紀錄之。DPPH 清除能力的計算公式:
scavenging % = (Ac-As)/Ac × 100%，As 及 Ac 分別為樣品及未加樣品的
A517nm。利用樣品濃度與 DPPH 清除能力的線性迴歸公式，計算出清除 50% 的
DPPH 所需的樣品濃度 (IC50)，每個樣品做三重複。
4. 細胞培養
小鼠巨噬細胞 (RAW264.7) 來自生物資源保存研究中心 (台灣新竹)，以含 有 10% 胎牛血清 (FBS) 以及 2 mM glutamine, 1% non-essential amino acid, 1
mM pyruvate, 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin 之 DMEM 培養 基，培養在 37℃、5% CO2 之培養箱。
5. 亞硝酸鹽濃度測定
RAW264.7 細 胞 以 1×107 /ml 培 養 於 96-well 細 胞 培 養 盤 中 ， 加 入 polymyxin B (PMB, 10 g/ml) 或小果油茶萃取物區分 (0.05, 0.1 mg/ml)，預先處 理反應 30 分鐘後，再以 LPS (100 ng/ml) 誘導發炎，共同培養 18 小時。吸取 上 層 液 加 入 Griess reagent (100 l/well) 反 應，並在 30 分鐘內 以 ELISA microplate reader 測定波長 550 nm 之吸光值，以不同濃度 NaNO2 標準品製作 檢量線比對。
6. 細胞存活率測定
本 實 驗 採 用 MTT assay。 活 細 胞 內 粒線 體之 琥 珀酸 去 氫酶 會與 MTT
【3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide】 進行氧化還原而 形成紫色結晶 formazan，顏色越深代表存活率越高，此不溶物會堆積於細胞內，
需先經過 DMSO 打破細胞才能測得存活率。
上述亞硝酸鹽濃度測定之細胞培養盤的盤底細胞，在吸取上層液後，加入 0.5% MTT 溶液 (100 l/well) 並放回 37℃、5% CO2 之培養箱反應三小時，以 suction 吸除上層液，加入 DMSO (100 l/well) 後輕拍，以 ELISA microplate reader 測定波長 550 nm 之吸光值。
7. 細胞激素 (IL-6) 測定
RAW264.7 細胞以 1×107 /ml 培養於 96-well 細胞培養盤中，預先處理 PMB (10 g/ml) 或小果油茶萃取物 (0.05, 0.1 mg/ml)，反應 30 分鐘後，再以 LPS 誘導發炎，共同培養 18 小時，吸取上層液，以 OptEIATM Set Mouse IL-6 套 組分析細胞激素 IL-6 之濃度。
8. 西方墨點法
將等量蛋白以 8 到 12% 的 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 進行 分 離 ， 再 將 分 離 的 蛋 白 轉 漬 至 PVDF Transfer Membrane (GE Healthcare, Amersham Hybond-P) 上，以含有 5% 脫脂奶粉的 TBST 當作 Blocking buffer 於 4℃ 下進行 Blocking 6 至 8 小時，利用一級抗體於 4℃進行雜交作用 14 至 16 小時。再以 horse-radish peroxidase-conjugated 對應的二級抗體於室溫雜交作 用 2 小時，最後以 ECL plus (GE Healthcare, Germany) 及 Hyperfilm ECL 壓片 掃描，利用 ImageJ 影像分析軟體定量。
9. iNOS mRNA 表現分析
此部分採取 RT-Q-PCR 測定 iNOS mRNA 的表現。RAW264.7 細胞以 1×106 /mL 密度培養於 6-well 細胞培養盤中，加入小果油茶萃取物，共同培養 12 小時，用 illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare) 配合 High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, CA) 來進行反轉錄實驗。接 著以 Power SYBR Green PCR (Applied Biosystem) 利用下表的 iNOS 及 -actin (控制組) 引子對，進行 real-time PCR，以 2－△△Ct 定量化後為其表現數值。
Gene Primers Amplicon (bp)
-actin GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
154
iNOS GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA GTGGACGGGTCGATGTCAC
127
10. 統計分析
本文所提及之實驗皆作三重複以上，且實驗結果以平均值±標準差表示，並 利用 Tukey 多重比較法事後比較檢定，當 p-value 小於 0.05 即表示具有統計學 上之顯著性差異。
五、結果
1. 小果油茶廢棄物抗氧化活性分析
利用 Folin-Ciocalteu 試劑測定粗萃物及各區分之總多酚含量，結果如表一 所示，甲醇區分明顯含量皆最高，乙醇及正丁醇區分次之，H2O 區分含微量，
而正己烷區分在此試驗中未被檢測出含有酚類化合物。在 DPPH 自由基清除能 力測定中，發現結果 (表二) 與總多酚含量相對應，即總多酚含量愈高，自由基 清除能力愈佳；反之，總多酚含量愈低，自由基清除能力愈低。在 DPPH 試驗 中使用具強抗氧化能力的 -tocopherol 作為正對照組，而甲醇層自由基清除率 與 -tocopherol 相當，甚至更強。由於總多酚含量與 DPPH 自由基清除率有強 烈相關性，可顯示出小果種油茶果殼等萃取物的抗氧化化合物成分大多是酚類化 合物，且主要存在於甲醇層，故以甲醇層萃取物進行後續實驗。
表一、小果油茶乙醇粗萃取物和各區分之總多酚含量。
Total phenolic content: 8 l Folin-Ciocalteu 試劑與 20 l 樣品反應混合 10 分鐘，再加入 2% Na2CO3 溶液反應 10 分鐘，隨後以 ELISA reader 偵測 A620，結果以 g GAE (gallic acid)/mg dw 表示。
表二、小果油茶乙醇粗萃取物和各區分之 DPPH 自由基清除能力。
DPPH scavenging: 以 990 l 新鮮配製 0.1 mM DPPH 甲醇溶液，加入 10
l 樣品，另以 α-Tocopherol (vitamin E) 來作為評估的對照組。混合後，於 水浴 37oC 反應 30 分鐘，測定 A517。
2. 種殼及茶粕甲醇區分抗發炎能力測定
因果殼的甲醇區分 (FM) 經多次測試，發現其結果不穩定，細胞毒性高 (數 據未顯示)，故僅取種殼及茶粕的甲醇區分 SM 及 PM 進行測試。此實驗利用 革蘭氏陰性菌的莢膜成分酯多醣 (LPS) 來刺激小鼠巨噬細胞 RAW264.7。細胞 預先處理 SM 及 PM 反應 30 分鐘，結果如圖四顯示，單獨加入 LPS (100 ng/ml) 反應 18 小時後， NO 產量相對於未受刺激的細胞增加了約 8 倍；若 加入 PMB (10 g/ml) 共同處理，可以有效抑制 LPS 誘導之 NO 的產量。共同 處理 SM 及 FM 的效果雖然較 PMB 弱，但是在 0.1 mg/ml 時可以顯著抑制 NO 產生。
接著以 MTT 分析細胞存活率，圖五顯示 LPS (100 ng/ml) 處理 RAW264.7 細胞產生~20% 的細胞毒性，PMB 共同處理則可完全回復細胞存活率。添加 0.05 和 0.1 mg/ml 的種殼甲醇區分 (SM) 也可以顯著回復細胞存活率，但是茶 粕的甲醇區分 (PM) 則無明顯影響。
veh v PMB 0.05 0.10
N itr ite concen tr ati on ( M )
0 5 10 15 20 25
SM PM
concentration (mg/mL) + LPS (100 ng/mL)
## ##
##
**
圖四、小果油茶種殼與茶粕甲醇區分對 RAW264.7 受 LPS 刺激下之 NO 產量的影響。RAW264.7 細胞以 polymyxine B (PMB, 10 g/ml) 或 0.05, 0.1 mg/ml 的種殼甲醇區分 (SM)、茶粕甲醇區分 (PM) 處理 30 min 後，再與 LPS 共同培養 18 小時。**, p<0.01 表示與未加 LPS 的 vehicle 組相比，
具顯著性差異。##, p<0.01 表示與加 LPS 的 vehicle 組相比，具顯著性差 異。
圖五、小果油茶種殼與茶粕甲醇區分對 RAW264.7 受 LPS 刺激下之存活 率的影響。RAW264.7 細胞以 polymyxin B (PMB, 10 g/ml) 或 0.05, 0.1 mg/ml 的種殼甲醇區分 (SM)、茶粕甲醇區分 (PM) 處理 30 min 後，再與 LPS 共同培養 18 小時。本實驗使用 MTT assay。*, p<0.05 表示與未加 LPS 的 vehicle 組相比，具顯著性差異。#, p<0.05 表示與加 LPS 的 vehicle
3. 種殼及茶粕甲醇區分對細胞受 LPS 誘導之 iNOS 表現量影響
西方墨點法可檢視 SM 及 PM 是否透過抑制 iNOS 蛋白表現使 NO 產 量降低。結果如圖六 (左) 所示，未加 LPS 的對照組 iNOS 蛋白幾乎無表現，
而加入 LPS 使 iNOS 蛋白表現大幅提升，且可藉由加入 PMB 顯著性抑制。
在實驗組，SM 不僅對 iNOS 蛋白有顯著性抑制，也具濃度依賴性；相較之下，
PM 對 iNOS 蛋白表現具些微濃度依賴性，但整體抑制效果較不明顯。對照組
-tubulin 的表現量也無太大差異性，顯示 SM 確實可藉由抑制 iNOS 蛋白表 現，達到降低 NO 產量的效果。
RT-Q-PCR 結果顯示如圖六 (右)，相較於 vehicle 組，加入 LPS 使 iNOS 的 mRNA 表現量提升約 14.5 倍，而在加了 PMB 後又被明顯抑制。在樣品部 分，可以發現 SM 能顯著性抑制 iNOS 之 mRNA 的表現，並且具有濃度依賴 性。然而；PM 相較之下抑制作用較微弱，僅在 0.1 mg/ml 時，有抑制效果。
圖六、小果油茶種殼與茶粕甲醇區分對 RAW264.7 受 LPS 刺激下之 iNOS 表現的影響。(左) RAW264.7 細胞以 polymyxin B (PMB, 10 g/ml) 或 0.05, 0.1 mg/ml 的種殼甲醇區分 (SM)、茶粕甲醇區分 (PM) 處理 30 min 後，
再與 LPS 共同培養 16 小時，隨後進行總蛋白抽取並以西方墨點法測定 iNOS 蛋白表現量。(右) RAW264.7 細胞以前述西方墨點法同樣條件培養 12 小時，隨後進行總 RNA 抽取並以 RT-Q-PCR 測定 iNOS 的 mRNA 表 現量。**, p<0.01 表示與未加 LPS 的 vehicle 組相比，具顯著性差異。#, p<0.05 表示與加 LPS 的 vehicle 組相比，具顯著性差異。##, p<0.01 表示 與加 LPS 的 vehicle 組相比，具顯著性差異。
4. 種殼及茶粕甲醇區分抑制細胞激素 (IL-6) 分泌能力測定
IL-6 與發炎有關，是一主要的促發炎細胞激素，由單核球及巨噬細胞所分 泌。此實驗結果如圖七顯示，細胞以 LPS 誘導 18 小時後，IL-6 分泌明顯增加 約 10 倍，而加入 PMB 又幾乎被完全抑制。SM (0.05, 0.1 mg/ml) 及 PM (0.1 mg/ml) 皆有抑制細胞激素 IL-6 分泌的效果，且具有濃度依賴性，其中又以 SM 之效果最為明顯。
圖七、小果油茶種殼與茶粕甲醇區分對 RAW264.7 受 LPS 刺激下之細胞 激素 (IL-6) 產量的影響。RAW264.7 細胞以 polymyxin B (PMB, 10 g/ml) 或 0.05, 0.1 mg/ml 的種殼甲醇區分 (SM)、茶粕甲醇區分 (PM) 處理 30 min 後，再與 LPS 共同培養 18 小時，隨後吸取上層液以 OptEIATM Set Mouse IL-6 套組分析細胞激素 IL-6 之濃度。**, p<0.01 表示與未加 LPS 的 vehicle 組相比，具顯著性差異。##, p<0.01 表示與加 LPS 的 vehicle 組 相比，具顯著性差異。
六、討論
很多研究指出多酚類是天然化學成分，普遍存在於植物內並扮演重要角色，
具有抗氧化、抗發炎、抗衰老及抗病菌等功能(Lim and AG Koffas 2010; Bravo 1998)。在抗氧化活性分析中，本研究先利用 Folin-Ciocalteu 試劑進行小果油茶 廢棄物乙醇粗萃物的總多酚含量測定，發現甲醇區分的總多酚含量最豐富，且其
發炎反應是一種當人體遭受到外物入侵所引起的防禦性反應，包括一連串訊 息傳遞，誘導型一氧化氮合成酶 (iNOS) 的活化即為其中一部分。然而，LPS 誘 導巨噬細胞所釋放出之 NO 又可藉由抑制 iNOS 表現而降低產量，進而緩和發 炎反應。在此次實驗中，我取 LPS 誘導細胞發炎，並且以 polymyxin B (PMB) 為 對照組，亞硝酸鹽濃度測定的結果，可以發現 SM 及 PM 在 0.05 mg/ml 時有 輕微抑制效果；在 0.1 mg/ml 具顯著性抑制，顯現兩者皆具濃度依賴性且皆能 抑制 LPS 所引起之細胞毒性。在西方墨點法及 RT-Q-PCR 結果中，更進一步 顯示 SM 能夠明顯抑制 iNOS 蛋白及 mRNA 表現量，說明 SM 是藉由抑制 iNOS 的表現而降低 LPS 所誘導之 NO 產量。相較之下，PM 於 0.1 mg/ml 時，雖有輕微抑制 iNOS 的 mRNA 表現量，但在蛋白表現量卻無抑制效果，
顯示其抑制作用可能發生於 iNOS 之酵素活性，而非基因表現。
細胞激素 IL-6 是一種促發炎的細胞激素，在發炎反應中扮演重要角色，不 僅參與感染區域血流變化，防止病菌擴散，也能經由刺激巨噬細胞活化導致發炎 反應，因此調節 IL-6 保持適量的分泌是很重要的，過多或不足都可能導致疾 病，例如敗血症及自體免疫疾病等(Tracey and Cerami 1993)。本研究發現 SM 及 PM 皆能抑制 RAW264.7 在 LPS 刺激下所誘導之 IL-6 分泌能力，並具有濃度 依賴性，其中又以 SM 效果最為顯著，具有抗發炎之潛力。
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