一、 前言 (一) 文獻回顧
1. α -半乳糖苷酶
(1) α-半乳糖苷酶的發現與特性
α-半乳糖苷酶 (α-galactosidase，EC 3.2.1.22，α-GAL) 為一種外切
型糖苷水解酵素，可催化水解α-1, 6 半乳糖苷鍵的非還原末端產生半乳 (Melville 1954)。1928 年，Weidenhagen 發現蜜二糖酶可水解多種帶有 α-D-半乳糖基團的醣類，並將其改名為 α-galactosidase (Wolfrom et al. dulcis) (Helferich and Appel 1932)。植物中的耐酸性 α-GAL 會影響 種子的發芽與生長 (Keller 1996)，耐鹼性 α-GAL 則與葉子的發育 有關 (Chrost et al. 2007)。目前已知 α-GAL 的植物來源包含：豆科 植物種子、甜瓜果實、甜杏仁、椰子胚乳、向日葵種子、南瓜成熟
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(A)
(B)
(C)
圖一、α-半乳糖苷酶水解反應 (Anisha 2017)
Figure 1. Hydrolysis of (A) melibiose, (B) locust bean gum and (C) guar gum by α-galactosidase.
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圖二、α-半乳糖苷酶的基質 (Katrolia et al. 2014)
Figure 2. Substrates of α-galactosidases: (A) oligosaccharides, (B)
galactomanno-oligosaccharides, (C) galactomannan polysaccharides and (D) α-1,3-linked ᴅ-galactose from immunodominant B trisaccharide antigen in blood-group B conversion.
(A)
(B)
(C)
(D)
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葉、未成熟的甘蔗莖、花生、木瓜、葡萄、番茄、水稻與咖啡豆種 子 (Ahmed and Cook 1964; Carchon and DeBruyne 1975; Chinen et al. 1981; Dey 1984; Feurtado et al. 2001; Gao and Schaffer 1999; Itoh et al. 1986; Kandiah Balasubramaniam 1985; Kang and Lee 2001; Kim et al. 2003; Lazan et al. 2004; Lee et al. 2004)。咖啡豆是最早純化並 實際應用於工業生產的 α-GAL 來源，而從甜瓜果實中發現了對於 多 種 基 質 ( 特 別 是 水 蘇 糖 ) 皆 有 催 化 活 性 的 鹼 性 α-ᴅ-GAL 。 Bayraktar 與 Onal (2013) 成 功 透 過 三 相 分 離 法 (three-phase partitioning) 以 2.4 倍的純化倍率與 76.7% 的產率純化出源自西 瓜 (Citrullus vulgaris) 的 α-GAL (Bayraktar and Ö nal 2013)。
(b) 動物來源
動物來源包含脊椎與無脊椎動物，最早發現含有 α-GAL 的動 物為蝸牛 (Barnett 1971)，此外在綿羊的胰臟 (Bajwa and Sastry 1974)、
小鼠的胚胎 (Adler et al. 1977)，與倉鼠腎臟 (Chang 1978) 也陸續發 現 α-GAL 的存在。人體則存在於脾臟、肝臟、血液與胎盤等器官 中，但不存在於消化道中 (Bishop and Desnick 1981; Dean and Sweeley 1979)。動物來源的 α-GAL 可水解醣脂結構，人體若缺乏 α-GAL 或其活性不足時，會產生法布瑞氏症 (fabry disease) (Kint 1970)。
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(c) 微生物來源
微生物是良好的 α-GAL 來源，無論細菌、真菌、絲狀真菌或 酵母菌均有發現 α-GAL 的存在 (表一)。
α-GAL 的細菌來源包含 Geobacillus stearothermophlius (Ganter et al. 1988)、乳酸菌中的 Lactobacillus acidophilus (Altermann et al.
2005)、L. fermentum (Carrera-Silva et al. 2006)、雙岐桿菌中的 Bifidobacterium adolescentis (Leder et al. 1999) 和 Bif. breve (Zhao et al. 2008)、絲狀放線菌中的 Streptomyces erythrus (Post and Luebke 2005)、Strep. colicolor A3 (2) (Kondoh et al. 2005)、Saccharopolyspora erythraea (Post and Luebke 2005) 與 Strep. griseoloalbus (Anisha et al. 2008)。此外在乳酸菌 Carnobacterium piscicola (Coombs and Brenchley 2001)、極端嗜熱菌 Rhodothermus marinus (Blücher et al.
2000) 與海洋細菌 Pseudoalteromonas sp. (Bakunina et al. 1998) 中 也都發現了 α-GAL 的存在。存活於酸性火口湖中的好氣性古細菌 Sulfolobus solfataricus 亦分離出胞內熱穩定性 α-GAL，該酵素是第 一個從古細菌分離出來具熱穩定性的罕見 α-GAL (Brouns, S. J. J.
et al. 2006)。
α-GAL 的真菌來源包含 Trichoderma reesei (Margolles-Clark et al. 1996)、Aspergillus oryzae (Iwashita and Egami 1973)、A. fumigatus (Puchart et al. 1999)、Gibberella fujikuroi (Mulimani and Ramalingam 1995) 、 Mortierella vinacea (Shibuya et al. 1997) 、 Penicillium simplicissimum (Luonteri et al. 1998)、Humicula sp. (Kotwal et al.
1999) 、 Thermomyces lanuginosus (Puchart et al. 2001) 與 Neosartorya fischeri P1 (Wang et al. 2014)。目前已生產的 α-GAL 多 分離自 Aspergillus 與 Penicillium 屬菌株 (Anisha 2017)。
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表一、不同微生物來源之 α-galactosidase 生化特性 (Katrolia et al. 2014) Table 1. Biochemical properties of α-galactosidases from different microbial sources
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8 疊方式不同分成 15 個 clan。根據 Carbohydrate-Active Enzymes Database (CAZy) 線上數據庫資料顯示，α-GAL 主要分布於 GH 4、
GH 27、GH 36、GH 57、GH 97 與 GH 110 家族中 (Cantarel et al.
2009; Lombard et al. 2014)。多數真核生物與少數原核生物 (如：
Clostridium josui Aga27A 、 Pseudomonas fluorescens subsp.
cellulosa Aga27A 與 Streptomyces coelicolor) 分離出的 α-GAL 屬於 GH 27 家族，而屬於 GH 36 家族的來源則以細菌為主 (Bakunina et al. 2016; Merceron et al. 2012; Rigden 2002)。在目前已
發現的 α-GAL 中，僅少數物種分離出來的酵素隸屬於其他家族，
如 GH 4 家族的 Bacillus halodurans 的 α-GAL、GH 57 家族的 Pyrocossus furiosus 的 α-GAL (Anggraeni et al. 2008; van Lieshout et al. 2003)、GH 97 家族的 Bacteroides thetaiotaomicron 的 α-GAL (Okuyama et al. 2009) 與 GH 110 家 族 的 Streptomyces griseoplanus、Bacteroides fragilis 及 Bacteroides thetaiotaomicron 的 α-GAL (Liu et al. 2008) (表二) 。
(3) α-半乳糖苷酶的催化機制與立體結構特性
GH 的 催 化 反 應 主 要 透 過 retention ( 又 稱 雙 取 代 反 應 ， double-displacement) 或 inversion 兩種機制進行 (Zechel and Withers 2000)。α-GAL 基本上以 retention 的方式催化，但在 GH 110 家族中
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表二、各 GH 家族的 α-半乳糖苷酶特性 (Katrolia et al. 2014) Table 2. Some characteristic of α-galactosidase of all CAZy families
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10 的催化活性位，而源自 Lactobacillus acidophilus 與 Rumicoccus gnavus 的四聚體酵素之催化活性位則為較深窄的口袋型 (Fredslund et al. 2011)。
近期針對 GH 36 家族之 AgaA 與 AgaB 兩種熱穩定性 α-GAL 的立 體構型與定點突變研究中發現，兩酵素的熱穩定性與催化專一性差異是 由一個可影響活性位構型的胺基酸決定 (Merceron et al. 2012)。
11 道不適的徵狀 (Patil et al. 2009)。GRAS (generally recognized as safe) 微生物生產之 α-GAL 可藉由膳食補充品的形式促進消化，並減輕
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表三、市售 α-半乳糖苷酶產品之產品形式與來源 (Katrolia et al. 2014) Table 3. Commercially available α-galactosidase products and its source
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(e) 醫療
法布瑞氏症 (Fabry disease) 是一種 X 染色體上基因出現異常 產生的性聯遺傳疾病，患者細胞內的溶小體無法製造出正常具有活 性的 α-glactosidase A (α-GAL A)，使體內以 globotriaosylceramide GL-3 為主的 neutral glycosphingolipids 無法被正常代謝，蓄積於 人體多處細胞的溶小體與細胞質中，進而引發腎臟、心臟、皮膚、
15 (Brouns, S. J. et al. 2006; Fridjonsson et al. 1999)。
(c) 金屬離子、醣類與蛋白酶 (Anisha et al. 2009; Chen et al. 2008; El shafei et al. 1993)。目前推測
抑制活性的原因可能是同樣帶有α-半乳糖苷鍵的醣類，會彼此競爭
α-GAL 上的催化活性位，進而影響活性。此外半乳糖為催化反應 的最終產物，如同許多酵素一樣，α-GAL 也會受到 end-product inhibition 影響，然而 Strep. griseoloalbus 與 R. miehei 生產的
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α-GAL 可耐受濃度高達 100 mM 的半乳糖 (Anisha et al. 2009;
Katrolia et al. 2012)。
少數真菌來源的 α-GAL 具有蛋白酶 (包含 trypsin、pepsin、
subtilusin A 、 proteinase K 、 alkaline protease, collagenase 或 a-chymotrypsin) 抗性 (Katrolia et al. 2012)。
(d) 基質專一性 (Margolles-Clark et al. 1996; Shibuya et al. 1997)。受限於食品領域的應用，
源自於機會性病原真菌的 α-GAL，則會以 A. sojae 這類 GRAS 的菌株 進行表現 (Hashimoto et al. 1993)。相較於真菌，僅少數酵母菌發現並選 殖出 α-GAL (Murphy and Power 2002)。
許多細菌來源之 α-GAL 已利用 E. coli 進行異源表現，基因來源 包含具有食品應用潛力的乳酸菌 (Carrera-Silva et al. 2006; Silvestroni et al. 2002)、可生產熱穩定性酵素或生長需求較高的嗜熱菌 (King et al.
1998; Pessela et al. 2007) 以及嗜極高溫菌或古細菌 (Brouns, S. J. et al.
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2006) 等。
(7) Anoxybacillus spp. 的 α-GAL
最早公開發表的 Anoxybacillus flavithermus 發現於紐西蘭的溫泉 中，起初命名為 Bacillus flavothermus，為生長溫度介於 30-70°Ϲ，可 產生黃色色素的兼性厭氧菌 (Heinen et al. 1982)。Pikuta 等學者於 2000 年時，依據菌株之 16S rRNA 序列與 DNA-DNA hybridization 的 結果提出 Anoxybacillus 為 Bacillaceae 科中的一個屬。Bacillaceae 科 的菌種屬於革蘭氏陽性菌，因富含具實用價值的蛋白與酵素，而成為 重要的工業微生物來源 (表四) (Goh et al. 2013)。
施 (2015) 從臺灣紅葉溫泉中分離出一株具有 α-GAL 活性的新種 嗜熱性溫泉菌 Anoxybacillus flavithermu HY-TTH-D23，並利用 E. coli 成功表現出首個從 Anoxybacillus spp. 選殖出的 α-GAL (rAFGAL)，經 初步測試後發現，rAFGAL 不僅能耐受高達 65°Ϲ 的高溫，在 55°Ϲ 環 境中還具有活化的現象，此外 rAFGAL 還具有相當大的 pH 值耐受範 圍 (pH 5-10) 對於多數金屬離子 (Ca2+、Fe2+、K+、Mg2+、Mn2+、Na+、 Ni2+ 與 Zn2+) 與化學試劑 (Tween 80、Triton X-100、DTT、EDTA 與 PMSF) 皆具有良好的耐受性。
雖然 rAFGAL 是具有商業潛力的重要酵素，但是目前尚未針對產 率與生化相關特性有更進一步的研究，若能獲得更多與生產及特性有 關的資訊，將有助於 rAFGAL 實際的生產應用。
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表四、Anoxybacillus 酵素的生化特性 (Goh et al. 2013)
Table 4. Summary of biochemical properties of enzymes from various Anoxybacillus species
19 在幾個小時內達對數生長期 (Bentley et al. 1990; Sezonov et al. 2007)。
E. coli 表現系統主要缺陷為缺乏轉譯後修飾能力與蛋白外泌系統，且不 具有雙硫鍵修正機制，因而不利於許多胞外與結構複雜的真核生物蛋白 生產， 容 易 使蛋白 摺疊錯誤 產生不可溶且不具活性的 蛋白 包涵體 (inclusion body, IB) (Schumann and Ferreira 2004)。
常用的 E. coli 包含 BL21 品系與 K-12 品系 (Han 2016) (圖三)。