使用物理性的破菌方式 (Harrison 1991; Hopkins 1991)。
物理性方法包含顆粒研磨、高壓均質與超音波處理等。顆粒研磨是
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破裂時所產生的剪切力破壞細胞壁，同時使細胞中的核酸斷裂，減少均 質液的黏性。超音波破菌效率高，但功率轉換效率較差，且不利於放大 操作規模，較適合實驗室使用 (Carta and Jungbauer 2010; Middelberg 1995)。
細胞破碎方式的選用除成本的考量外，還需考慮整體操作規模與後 續純化方式而定 (有關於細胞破碎的原則如圖四所示)，亦可結合非機械 與機械兩種破碎方法來增加效率，通常先以非物理性方法 (如：改變 pH 值或使用溶菌酶) 增加細胞通透性再以物理方法破碎細胞，縮短處理時間 (De Mey et al. 2008)。
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圖四、細胞破碎方法與原則 (Janson 2012) Figure 4. Principles and methods for cell breakage.
33 大小分離蛋白的凝膠過濾層析 (size exclusion chromatography, SEC)、
透 過 電 荷 的 改 變 進 行 蛋 白 分 離 的 離 子 交 換 層 析 (ion exchange chromatography, IEC)、利用分子表面疏水性作用力的疏水性作用層 析 (hydrophobic interaction chromatography, HIC) 及 逆 相 層 析 (reverse chromatography, RPC)、利用生物專一性作用力 (biospecific chromatography, BIC) 或金屬離子專一性螯合 (metal chelate, MIC 又稱 immobilized metalion affinity chromatography, IMAC) 的親和性 層 析 (affinity chromatography) 等 ( 表 九 ) (Carta and Jungbauer
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表九、依固定相及移動相成份所進行液相層析分類 (Carta and Jungbauer 2010) Table 9. Branches of chromatography defined by the nature of the stationary phase
ligate and mobile phase composition
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後再透過改變 pH 值或提高特定化合物濃度的方式破壞專 一性作用力而流洗出目標蛋白。常見的專一性作用組合包含抗體 與抗體、酵素與基質、酵素與抑制因子、賀爾蒙與受體等 (Burgess and Deutscher 2009)。
ii. 固定化金屬離子親和性層析
固定化金屬離子親和性層析 (immobilized metalion affinity chromatography, IMAC) 的概念最早由 Porath 等人 (1975) 提 出，是以過渡金屬離子 (如 Zn2+、Cu2+、Ni2+ 與 Co2+) 對於特 定胺基酸 (cysteine、histidine 與 tryptophan) 在水溶液中的親和 力為基礎所發展出來的技術。相較於其他液相層析方式 (表十)，
IMAC 法除了具有便捷、專一性高與成本低廉等優勢外，工業 上亦開始 IMAC 法來生產蛋白 (表十一)，其生產規模可從毫升 線性放大到公升層次 (Randy, 2012)。
NTA (nitrilotriacetic acid) 為一有機金屬螯合劑，可與 Cu2+、 Mg2+ 與 Ni2+ 等二價金屬離子螯合。螯合 Ni2+ 離子的 NTA 可 專一性吸附帶有 His 基團的分子，利用此結構進行 6X-His 標 籤 (His-tag) 蛋白的純化 (圖五)，可單步大幅提高蛋白的純度 (從 < 1% 純化至 > 98%) (Janknecht et al., 1991)。隨著 IMAC 廣泛應用，以 NTA 做為配體運結合親和性層析法來純化蛋白的 方式，已大量運用於重組蛋白生產中 (表十二)。
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表十、IMAC、免疫親和層析、離子交換層析 (IEC) 與疏水性作用層析的比較 (Cheung et al. 2012)
Table 10. Comparison between IMAC, immunoaffinity chromatography, ion-exchange chromatography (IEC), and hydrophobic interaction chromatography (HIC)
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表十一、利用固定化金屬離子親和性層析純化的蛋白 (Janson 2012)
Table 11. Purification of proteins by immobilized metalion affinity chromatography
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圖五、固定化金屬離子親和性作用模式 (Burgess and Deutscher 2009)
Figure 5. Model of the interaction between residues in the His-tag and the metal ion In A. tri- (IDA), B. tetra- (NTA), and C. pentadentate immobilized metalion affinity chromatography ligands (TED)
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表十二、市售固定化金屬離子親和性層析相關商品 (Janson 2012)
Table 12. Commercially available chromatographic supports for immobilized metalion affinity chromatography