(Englander and Mayne 2014; Jungbauer and Kaar 2007)。
(1) 常用的 IB 復性技術
尿素或胍鹽酸 (guanidine hydrochloride) 合併添加 SDS、N-cetyl trimethyl ammonium chloride 或 sarkosyl (sodium N-lauroyl sarcosine) 等界面活性劑進行 IB 回溶。這些試劑的主要作用是破壞蛋白間的 氫鍵、雙硫鍵與疏水性作用力，使絮聚的蛋白分離變性成一級結構。
隨後逐步降低試劑濃度，使變性後的 IB 自然摺疊出正確的構形。
此外可透過添加金屬離子螯合劑 (如 EDTA)、還原劑 (如
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圖六、蛋白正確摺疊、錯誤摺疊與絮聚的關係示意圖 (Vallejo and Rinas 2004) Figure 6. Simplified model of correct folding versus misfolding and aggregation. The
correct protein folding pathway (1) often competes with misfolding (2) and aggregation (3). Aggregation occurs among intermediates with exposed hydrophobic patches, which are buried in the correctly folded protein (dark lines, hydrophilic solvent-exposed parts of the protein; gray lines:
hydrophobic patches).
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圖七、提升包涵體活性蛋白回收率的純化策略 (Clark 2001)
Figure 7. Purification strategy for improved recovery of bioactive protein from inclusion bodies.
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β-mercaptoethanol 或 dithiothreitol) 以及半胱胺酸，控制氧化還 原電位，避免形成錯誤的雙硫鍵 (Clark 2001; Eiberle and Jungbauer pulse renaturation 與 fed-batch dilution 等方法為目前工業上常使用 的復性方式 (Eiberle and Jungbauer 2010; Yamaguchi and Miyazaki 2014)。
其他復性技術還有利用壓力反應槽搭配低濃度變性劑，在 1-3 kbar 高靜液壓力的環境下復性的高壓復性法、利用改變溶液 pH 值 (pH 8-12)，影響 IB 溶解度以協助復性的鹼性 pH 復性法，與利用 chaperones 進行體外復性等方式 (Jungbauer and Kaar 2007)。在眾多 選擇當中，柱上復性技術 (on-column refolding) 是目前最常使用的 2009; Janson 2012; Zhai et al. 2016)。
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圖八、柱上復性原理 (Janson 2012)
Figure 8. Principle of protein refolding by adsorption chromatography
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表十三、利用柱上復性生產蛋白之應用 (Janson 2012) Table 13. Chromatographic refolding applications
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(2) 復性產物分析
重組蛋白的復性除了須考量產物純度與活性外，更重要的是產物結 構的正確性。一般藉由圓二色光譜 (circular dichroism spectroscopy, CD 光譜) 來分析蛋白中不同二級結構含量比例，驗證復性產物與天然蛋白 的相似度。亦可透過 RPC (逆相層析) 檢驗產物中的雙硫鍵是否正確形 成，或透過 SEC (凝膠過濾層析) 搭配 on-line stray light detection 來更 進一步確定產物中是否含有 IB 的存在。隨著不同演算方式的開發，
CD 光譜數據的分析也得到更進一步的突破，目前有相當多的演算法可 應用於 CD 光譜的數據分析 (Greenfield 2006; Jungbauer and Kaar 2007) (表十四)。
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表十四、代表性蛋白質與多肽之不同二級結構估算方法比較 (Greenfield 2006)
Table 14. Comparison of various methods to estimate the secondary structure of representative proteins and polypeptides
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(二) 研究動機、目的與研究架構
α-半乳糖苷酶具有食品、製糖、飼料、造紙與醫藥等應用價值。施等 (2015) 雖已成功利用 pET 載體系統於 E. coli BL21 (DE3) 表現重組 A.
flavithermus HY-TTH-D23 熱穩定 α-半乳糖苷酶 (rAFGAL)。但若要實際生 產應用 rAFGAL-GFP，則需建立最適化的生產純化流程，並對其特性有更
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圖九、研究架構
Figure 9. Framework of this study
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ML203, Mettler-Toledo Co., Greifensee, Switzerland (2) 酸鹼測定儀 (pH meter)
pH5000 pH / mV / Temp. Meter, Clean, Taipei, Taiwan (3) 溫度計 (Precision thermometer)
TM-907A, Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Taipei, Taiwan (4) 恆溫振盪培養箱 (Orbital shaking incubator)
LUS-150R, Lian shen Enterprise Co. Ltd., Taichung, Taiwan (5) 高溫生長箱 (High-Temp incubator)
PK-50OD, Yihder Co. Ltd., Taipei, Taiwan (6) 高壓蒸氣滅菌釜 (Autoclave)
TM-328, L.M.I. Co. Ltd., Taipei, Taiwan (7) 超高速離心機 (Microcentrifuge)
Z326K, HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany (8) 無菌操作台 (Laminar flow)
JW-5N, Lian shen Enterprise Co. Ltd., Taichung, Taiwan (9) 加熱板 (Hotplate stirrer)
HTS-1003, LMS Co. Ltd., Tokyo, Japan
(10) 酵素免疫分析測讀儀 (ELISA reader Multiskan Spectrum)
MultiskanTM GO, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA (11) 相位差顯微鏡 (Phase Contrast Microscope)
DME-2500, Leica Mikrosystem Vertrieb GmbH, Wetzlar, Germany (12) 恆溫水浴槽
BL-710D-20, Yihder Co. Ltd., Taipei, Taiwan (13) 恆溫乾浴器
MP02N, Major Science, Saratoga, CA, USA (14) 超音波破碎機 (Sonicator)
XL2020, Misonix Inc., Farmingdale, NY, USA