Colo 205 細胞培養於 RPMI-1640 培養基中（含 10% fetal bovine serum、100 units/mL penicillin、100 µg/mL streptomycin、2 mM L-glutamine），置於 37 ℃、
5% CO2的培養箱中培養，並控制細胞的數目，使其細胞密度維持在 2-5×105 cells/mL。
二. 血球計數器評估存活細胞數
計數 Colo 205 細胞，接種於 12 well 培養盤中，每 well 含培養液總體積 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時分別為 2mL，72 小時為 3mL，每 well 細胞總 數為 1.5×105 cells，培養 24 小時使貼壁後，分別給不同濃度藥物，加等藥物體 積的 DMSO 為 control 組，分別持續和藥物培養 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時、72 小時後，收集全部細胞，trypsin 使細胞游離瓶底，1X PBS 清洗 2 次 後，加入 500 µL 的等量 1X PBS，每個給藥濃度取 50 mL 細胞懸浮液與 50 mL trypan blue ( 0.4% w/v trypan blue)等體積混合均勻於 1.5 mL 小離心管中(每個濃 度取 3 次)。取少許混合液﹙約 10 mL﹚自血球計數盤 chamber 上方凹槽加入，
蓋上蓋玻片，於 100 倍倒立顯微鏡下觀察。計數四個大方格之細胞總數，再除 4，乘以稀釋倍數，最後乘以 104，即為每 mL 中細胞懸浮液之細胞數。
三. 利用流式細胞計數儀計數存活的細胞數
計數 Colo 205 細胞，接種於 12 well 培養盤中，每 well 含培養液總體積 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時為 2 mL，72 小時為 3 mL，每 well 細胞總數 為 1.5×105 cells，於 37 ℃、5% CO2的培養箱（incubator）進行培養 24 小時，
使貼壁後，分別給不同濃度藥物，加等藥物體積的 DMSO 為 control 組，分別 持續和藥物培養 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時、72 小時後，收集全部細
胞，加 2 drops trypsin 使細胞游離瓶底，離心 1500 轉 5 分鐘，1X PBS 清洗 2 次後，再離心 1500 轉 5 分鐘，倒掉上清液，加 400 µL propidium iodine( 0.004 mg/mL PBS )上流式細胞計數儀，計算存活細胞數，流式細胞計數儀條件為固定 低流速（35 µL/min），抓取 20 秒(escape time)，計錄 R2 events 當作相對的存活 細胞數，不同濃度之間比較差異。計錄 R2 gated percentage 當作細胞存活率指 標，不同濃度之間比較差異。並且以 0 時間(給藥同時收細胞上流式細胞計數儀 計數存活率)的存活細胞數目為初始給藥點細胞基準線，如果給藥後細胞存活數 目低於初始給藥點細胞基準線，表示藥物對於細胞具有毒殺作用，若給藥後細 胞存活數目介於控制組的細胞數，表示藥物具有抑制細胞增殖作用。
四. 利用流式細胞計數儀評估細胞週期及 sub-G
1的影響
計數 Colo 205 細胞，接種於 12 well 培養盤中，每 well 含培養液總體積 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時為 2 mL，72 小時為 3 mL，每 well 細胞總數 為 1.5×105 cells，於 37 ℃、5% CO2的培養箱（incubator）進行培養 24 小時，
使貼壁後，分別給不同濃度藥物，加等藥物體積的 DMSO 為 control 組，分別 持續和藥物培養 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時、72 小時後，收集全部細 胞，加 2 drops trypsin 使細胞游離瓶底，離心 1500 轉 5 分鐘，1X PBS 清洗 2 次後，再離心 1500 轉 5 分鐘，倒掉上清液，將細胞完全打散後，置於震盪器上 以 shake 3 速度震盪，4 ℃的 70% 乙醇一滴一滴緩慢滴入，進行細胞固定，固 定後置於-20 ℃冰箱隔夜存放。隔天，將樣品取出後離心 1500 轉 5 分鐘，以除 去乙醇，將細胞完全打散，加入 2 mL 的 1X PBS ( 1X phosphate buffer saline (PBS)：NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.2 g 加二次水到總體 積 1000 mL。pH=7.4 ) 緩衝液清洗 1 次後將細胞完全打散。最後在每個試管中 加入 300
µ
L 的 PI stain 染劑( 0.002 % propidium iodide 5 mL，5 % triton 5 mL，2 mg/mL RNase A 1.25 mL，1X PBS 13.75 mL )其量可視細胞數目增減，避光反應 30 分鐘。最後以流式細胞計數儀進行樣品分析，一秒細胞數不超過 300 顆細胞，每個數據收集 12000 顆細胞，數據以 Modfit LT軟體進行處理分析。記錄 G1， S，G2/M phase，sub-G1比率。
五. 利用倒立式位像差顯微鏡評估細胞形態
計數 Colo 205 細胞，接種於 12 well 培養盤中，每 well 含培養液總體積 2 mL，每 well 細胞總數為 1.5×105 cells，於 37 ℃、5 % CO2的培養箱（ incubator）
進行培養 24 小時，使貼壁後，分別給不同濃度藥物，加等藥物體積的 DMSO 為 control 組，分別持續和藥物培養 6 小時、12 小時、24 小時後於 200 倍倒立 式位像差顯微鏡下照相。
六. DNA 的萃取（DNA extraction）
計數 Colo 205 細胞，接種於 6 well 培養盤中，每 well 含培養液總體積 6 小時、12 小時、24 小時、48 小時為 3 mL，每 well 細胞總數為 2×106 cells，於 37℃、5% CO2的培養箱（incubator）進行培養 24 小時，使貼壁後，分別給不 同濃度藥物，加等藥物體積的 DMSO 為 control 組，分別持續和藥物培養 6 小 時、12 小時、24 小時、48 小時後，無菌吸管吸出培養盤中細胞懸浮液至 15 mL 離心管收集全部細胞，無菌的 1X PBS 清洗 1 次後，加 3 滴 trypsin 使細胞游 離瓶底，離心 1500 轉 5 分鐘，1X PBS 清洗 2 次後，再離心 1500 轉 5 分鐘，
倒掉上清液，將細胞完全打散後，加 1X PBS 使細胞懸浮液為 200 µL，加 20 µL QIGEN Protease (or proteinase K) 到離心管底部，加 200 µL buffer AL 到 sample 內，混合均勻震盪 15 秒，置於 56 ℃ 水浴鍋 10 分鐘，離心 1500 轉 5 分鐘，
加 200 µL absolute ethanol (無水) 震盪 15 秒，然後離心 1500 轉 10 秒，取混 合液 600 µL 進入 the QIAamp spin column 內，於 10000 轉離心 1 分鐘，更 換乾淨的 2 mL collection tube，加 500 µl buffer AW1 solution，於 10000 轉離心 1 分鐘，更換乾淨的 2 mL collection tube，加 500 µl Buffer AW 2，於 13000 轉離 心 3 分鐘(離心到乾)，更換 QIAamp spin column 成新的 2 mL collection tube，
於 13000 轉離心 1 分鐘，更換 QIAamp spin column 成新的 2 mL 無菌的 collection tube，加 50 µL buffer AE 置於室溫 1 分鐘，10000 轉離心 1 分鐘，收 集濾液即為 DNA。
七. Total RNA 分離抽取 ( Isolation of total RNA )
計數 Colo 205 細胞，接種於 6 well 培養盤中，每 well 含培養液總體積 4 小時、8 小時、12 小時、24 小時為 3 mL，每 well 細胞總數為 2×106 cells，於 37 ℃、5% CO2的培養箱（incubator）進行培養 24 小時，使貼壁後，分別給不 同濃度藥物，加等體積藥物的 DMSO 為 control 組，分別持續和藥物培養 4 小 時、8 小時、12 小時、24 小時後，無菌吸管吸出培養盤中細胞懸浮液至 15 mL 離心管收集全部細胞，滅菌 PBS 清洗 1 次後，加 3 drops trypsin 使細胞游離瓶 底，離心 1500 轉 5 分鐘，滅菌 PBS 清洗 2 次後，再離心 1500 轉 5 分鐘，倒掉 上清液，不打散細胞，用 pipet 吸掉多餘的 PBS，吸乾後打散細胞，加 600 µL buffer RLT 上下混合均勻呈澄清黏稠均質狀態 (每 1 mL buffer RLT 預先加 10 µL 2-mecaptoethanol )，加 600 µL 70% ethanol 固定，使用 pipet 混合均勻，total 700 µL 吸到 RNeazy mini QIAshredder column，然後離心 13000 轉 15 秒，倒掉收集 管濾液，剩餘 600 µL 再吸到 RNeazy mini QIAshredder column，離心 13000 轉 15 秒，倒掉收集管濾液，加 700 µL Buffer RW1，離心 13000 轉 15 秒，倒掉 下層濾液，加 500 µL buffer RPE，離心 13000 轉 15 秒，倒掉下層濾液，加 500 µL buffer RPE，離心 13000 轉 2 分鐘，上層濾膜管柱移到另一新 1.5 mL 離心管，
加 40 µL RNase-free water，靜置 1 分鐘，離心 13000 轉 1 分鐘，得到 total RNA 40 µL。
取已滅菌 1.5 mL eppendorff tube，先取 198 µL DEPC-H2O，再取 2 µL sample，上下輕柔混合均勻，置冰上，於 285 nm 測 OD value。OD value=1 相當 RNA=40 ng/µL，sample RNA 濃度＝O.D. value × 100（ 稀釋 100 倍 ） × 40 ng/µL，每個 sample 取 3000 ng RNA 量做
Reverse Transcription
。八. First-strand cDNA synthesis (Reverse Transcription)
取 0.5 mL sterilized-eppendorf tube 置於冰上，加入適量滅菌過的二次水，
二次水量由 10-(3000/RNA 濃度) µL，sample RNA 量 (µL)= 3000/RNA 濃度，加 dNTP mix 1 µL、oligo dT 1 µL，輕揉的上下混合完全，置於 PCR 機器 well 上，
加熱 65℃ 5mins，取出離心 2000 rpm×4 秒，加入 5× first-strand buffer 4 µL、0.1 M DDT 2 µL、RNAase out recombinant ribonuclease inhibitor（可用二次水代替）
1 µL，輕柔混合，total 19 µL 加熱 42℃ 2mins，加入 superscript Ⅱ transferase 1 µL，加熱 42℃ 50 mins 接著加熱 70℃ 15 mins，得 cDNA first strand 4℃冰箱保 存。
九. Polymerase Chain Reaction (PCR)
取滅菌過的 0.5 mL eppendorf tube 置於冰上，加已滅菌的二次水 38.1 µL、10×
PCR buffer 5 µL、50 mM MgCl2 1.5 µL、10 mM dNTP mixture 1 µL、10 mM amplifica- tion primer 3’end 1 µL、10 mM amplification primer 5’end 1µL，加 2 µL cDNA sample，
輕柔均勻混合，離心 2000 轉 1 分鐘，加 Tag DNA polymerase 0.4 µL(加 Tag polymerase 時直接加到底部，不必混合)，總量 50 µL 離心 2000 轉 15 秒，跑 PCR。PCR 條 件為為預熱 95℃ 5 分鐘， denaturation 溫度 95℃ 1 分鐘， annealing 溫度 55℃ 1 分 鐘， extension 溫度 72℃ 1 分鐘 35-40 cycles，最後以 72℃ 10 分鐘退火。
Agarose Gel Electrophoresis
取 25 µL PCR 產物，加入 5 µL 的6X loading buffer 混合均勻，總量30 µL 注入 2 % agarose gel (溶於0.5X TBE buffer PH=7.4) 電壓設定50 voltage跑60分 鐘，取出 agarose 以 5 µg/mL ethidium bromide 染色 30 分鐘。