蛋白質標準品檢量線製作：
以 Bradford 方法(128)，以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin; BSA) 為蛋白 質標準品，精確稱量 50 mg，用二次水 1 mL 溶解後，稀釋成一系列濃度( 7 µg/µL、6.5 µg/µL、5.5 µg/µL、5 µg/µL、3.5 µg/µL )，取 5
µ
L 的蛋白質樣品與 250µ
L 的 Bradford 染劑(稀釋 5 倍)，混勻 5 分鐘後，放入分光光度計 590 nm 測 定其吸光值平均值，依並 OD value (Y) 對蛋白濃度 µg/mL (X)，求出趨勢線方 程式 y=0.1246X+1.2263 R2=0.9933。樣品蛋白質定量：
取 5
µ
L 的蛋白質樣品與 250µ
L 的 Bradford 染劑(稀釋 5 倍)，混勻 5 分鐘 後，放入分光光度計 590 nm 測定其吸光值平均值，蛋白樣品 OD value 用 RIPAlysis buffer 稀釋到檢量線範圍內，利用檢量線公式則可求得實際蛋白質樣品濃 度。
(三) 變性電泳 ( SDS-PAGE )
配置 1.5 mm 厚度的 10 % discontinuous acrylamide gel，gel 分上下兩層，依 照下面表格依序配製下層膠和上層膠：
下層膠 (10% Separation gel)
上層膠 (5% Stacking gel) 組 成
4 片量 4 片量
二次水 14.4 mL 4.7 mL
1.5 M Tris ( pH8.8 ) 7.5 mL -
1.0M Tris ( pH6.8 ) - 2.5 mL
10% SDS 300 µL 60 µL
40% acrylamide/Bis (29:1) 7.5 mL 1.22 mL 10% ammonium persulfate (APS) 300 µL 60 µL
TEMED 10 µL 6 µL
下層膠注入鑄膠玻璃後，加滿二次水去除氣泡並壓平下層膠之上緣，靜置 30 分 鐘待膠體凝固。隨後，將上層膠注入後小心地插入樣品槽梳子(comb)到未凝固 的膠體中，避免氣泡出現於樣品槽(wells)下緣。等待約 30 分鐘上層膠凝固後拔 出樣品槽梳子，並以二次水小心沖洗樣品槽內避免雜質殘留。將鑄好的膠體放 入電泳槽中，加入 running buffer ( Tris 30 g、glycine 14.4 g、SDS 10 g 加二次水 至 1 liter)。鑄好的膠體先以 100 v、300 mAmp 為條件預跑 15 分鐘。sample 加 入 4X protein loading dye（8 % SDS，0.01 % bromophenol blue，40 % glycerol，
250 mM Tris pH 6.8，5 % 2-mercaptoethanol）於蛋白質樣品中，置於 95 oC 乾浴 中變性（denature）10 分鐘，冰浴冷卻後快速離心，每個 sample 取蛋白總量為 30
µ
g，將各樣品及 5µ
L 標準分子量的 multimarker 分別注入膠體的孔槽（ well）中，以 40 voltage 跑 30 分鐘，再以 80 voltage 跑 100 分鐘。
(四) 西方墨點法 (Western Blotting)
轉印步驟：將轉印夾打開後黑色面朝下放，取出一片海綿墊片浸泡轉印緩衝液 transfer buffer ( Tris 3.3 g、glycine 14.4 g 先加二次水到 800 mL，待 Tris 及 glycine 完全溶解後再加入 200 mL 的 100% 甲醇即可)。後放於其上面，並依序在海綿 片上放上 3M 濾紙、SDS-PAGE gel、PVDF 轉印膜 (先用 100 %甲醇濕潤 15 秒、
再放於 transfer buffer 中浸泡 1 分鐘以上)、3M 濾紙，最後再放上一片海棉墊片 後夾上轉印夾(夾層中間不可有氣泡)，形成類似三明治夾層的構造。
海綿墊片 3M paper
PVDF SDS-PAGE Gel
3M paper 海綿墊片
將轉印夾放入電泳槽中後放入冰盒並加滿轉印緩衝液。於轉印槽外圍放入足夠 的冰塊，使整個系統保持低溫狀態。以 100 voltage、400 m Amp、1.5 小時為條 件，進行蛋白質轉印步驟。轉印完成後取出轉印膜裁去多餘部分，轉印膜後以 0.05 % tween/1X PBS 清洗 10 分鐘共 3 次。緊接將轉印膜以 5 % 脫脂奶粉(溶於 0.05 % tween/1X PBS 中)進行 blocking 步驟，以室溫 1 小時為條件進行。取出轉 印膜後於小盒中以 0.05 % tween/1X PBS 清洗 10 分鐘共 3 次。倒掉清洗液，加 入 8 mL 的一級抗體(溶於含 5 %脫脂奶粉的 0.05 % tween/1X PBS 中)，4 ℃隔夜 進行搖盪。隔天取出，回收一級抗體，以 0.05 % tween/1X PBS 清洗轉印膜 10 分鐘共 3 次。加入 8 mL 的 10000 倍 goat anti IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody 二級抗體 (溶於含 5 %脫脂奶粉的 0.05 % tween/1X PBS 中)，於室溫下搖盪進行 1 小時，最後取出轉印膜後以 0.05 % tween/1X PBS 清
紅、正極(＋)
黑、負極(-)
洗清洗 10 分鐘共 3 次。
(五)壓片步驟：(暗室中進行)
將轉印膜浸泡於 ECL 試劑之混合液(每瓶各取 1.5 mL 等比例混合)中 1 分鐘 反應。以兩張投影片黏貼固定於 cassette 內，轉印膜並正面朝上放置於壓片卡匣 (cassette)兩張投影片中間，以 Hyperfilm 軟片置於上層投影片上，對準轉印膜進 行壓片，感光時間依轉印膜上螢光亮度決定時間長短，約 5 秒至 1 小時不等。
感光完成後放入顯影劑進行顯影步驟(時間依實際觀察決定)，再以清水沖洗 30 秒後放入定影劑中，過 30 秒後再以清水沖洗 30 秒。
十一. 統計分析
實驗結果以平均值±標準差（mean ± SD）表示，使用 Student’s t-test 來決定 實驗組與對照組之差異。＊表示 p＜0.05，＊＊表示 p＜0.01，表示統計上具顯 著差異。