化學試藥與儀器設備
Rat Interleukin-1β ELISA kit：購自美國 Biosource 公司。
Rat Interleukin-6 ELISA kit：購自美國 Biosource 公司。
Rat Interleukin-10 ELISA kit：購自美國 Biosource 公司。
Rat Interferon-γ ELISA kit：購自美國 Biosource 公司。
Rat TNF- α ELISA kit：購自美國 Biosource 公司。
玻璃均質棒：美國 KONTES 公司，885450-0021。
實驗動物
由財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心購進 4-5 週 齡，體重約150 g 重，雄性 Wistar 大白鼠。動物飼養條件為自動 光照控制(12 小時白晝，12 小時黑夜)，自動空氣調節(換氣率每小
時12 次)，室溫控制於 25 ℃，相對溼度為 55 ﹪，動物給予自來 水及標準大鼠飼料，自由進食及飲水。
實驗方法
(一)、動物處理及大蒜成分灌食劑量
將大鼠分為 6 組，在大鼠體重約 170 g 時開始予以兩週隔日 胃灌載劑玉米油 (2 ml/kg BW)、大蒜精油 (50、200 mg/kg BW)、
DAS (0.5 mmole/kg BW)、DADS (0.5 mmole/kg BW)、DATS (0.5 mmole/kg BW)，共灌食 8 次直至犧牲前一日，於犧牲前 18 小時 注射內毒素後禁食。
(二)、DAS、DADS、DATS 灌食濃度配製
DAS 分子量 114.2，濃度 97%。250 mM DAS stock：秤取 29.44mg，以玉米油定量至 1 毫升。DADS 分子量 146.8，濃度 80%。250mM DADS stock：秤取 45.88 mg，以玉米油定量至 1 毫升。DATS 分子量 178，濃度 100%。250 mM DATS stock：秤
取44.5 mg，以玉米油定量至 1 毫升。
0.5mM DAS、DADS、DATS：從各 stock 取 200µl,以玉米油 定量至100 毫升。
(三)、誘發及樣品收集
利用腹腔注射單一、非致死來自Salmonella tryphimurium 之 內毒素劑量誘發系統性發炎反應。將5 mg/ml/kg body weight 內 毒素溶於生理食鹽水由腹腔注射，控制組則以等量生理食鹽水注 射 (江, 2001)。
1. 血液樣品
在大鼠誘發前(0 hr)，及 1、2、3 hr 由尾靜脈收集血液，並以 heparin 抗凝血。且在誘發後 18 hr 以 CO2窒息大鼠犧牲，剪開腹 部由下腔靜脈抽取血液至含heparin 的採血管，所有血液樣品在取 得後立即置於冰上，於4 ℃以 550 g 離心 8 分鐘，將血球分離取 其上清液存於-20℃，備用於 cytokine ( IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10 )分析。
(1) IL-1β 濃度測量：
依據廠商說明書製備標準品作標準曲線。加入 100 µl 標準稀 釋液(standard diluent buffer)至標準品濃度為 0 pg/ml 孔後，取 100µl 標準品，或 50 µl 血漿樣品加 50 µl 標準稀釋液/孔，加入 96
孔盤中，蓋上孔盤蓋子，室溫下培養3 小時。吸除孔盤中的液體 後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外 加入100 µl biotin conjugated anti-IL-1β 溶液，蓋上孔盤蓋子，室 溫下培養1 小時。吸除孔盤中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗 4 次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外加入 100 µl
streptavidin-HRP working 溶液，室溫下培養 30 分鐘。吸除孔盤 中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，每孔加
入100 µl stabilized chromogen ，室溫下避光培養 30 分鐘，最後 加入100 µl 終止溶液終止反應，使用 ELISA reader 測定波長 450 nm 之吸光值。依標準品濃度及吸光值作出標準曲線，可依標準曲
線得知樣品濃度；測定吸光值時間在加入終止溶液後2 小時之內 完成。
(2) IL-6 濃度測量：
依據廠商說明書製備標準品作標準曲線。加入 100 µl 標準稀 釋液(standard diluent buffer)至標準品濃度為 0 pg/ml 孔後，取 100µl 標準品，或 50 µl 血漿樣品加 50 µl 標準稀釋液/孔，加入 96 孔盤中，蓋上孔盤蓋子，37℃下培養 2 小時。吸除孔盤中的液體 後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外 加入100 µl biotin conjugated anti-IL-6 溶液，蓋上孔盤蓋子，室 溫下培養1 小時。吸除孔盤中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗 4 次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外加入 100 µl
streptavidin-HRP working 溶液，室溫下培養 30 分鐘。吸除孔盤 中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，每孔加 入100 µl stabilized chromogen ，室溫下避光培養 30 分鐘，最後 加入100 µl 終止溶液終止反應，使用 ELISA reader 測定波長 450
線得知樣品濃度；測定吸光值時間在加入終止溶液後2 小時之內 完成。
(3) IL-10 濃度測量：
依據廠商說明書製備標準品作標準曲線。加入 100 µl 標準稀 釋液(standard diluent buffer)至標準品濃度為 0 pg/ml 孔後，取 100µl 標準品，或 50 µl 血漿樣品加 50 µl 標準稀釋液/孔，加入 96
孔盤中。除了blank 孔外加入 50 µl biotin conjugated anti-IL-10 溶液，蓋上孔盤蓋子，室溫下培養2 小時。吸除孔盤中的液體後，
使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外加入 100 µl streptavidin-HRP working 溶液，室溫下培養 30 分鐘。吸
除孔盤中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，
每孔加入100 µl stabilized chromogen ，室溫下避光培養 30 分 鐘，最後加入100 µl 終止溶液終止反應，使用 ELISA reader 測定 波長450 nm 之吸光值。依標準品濃度及吸光值作出標準曲線，可 依標準曲線得知樣品濃度；測定吸光值時間在加入終止溶液後2 小時之內完成。
(4) TNF-α 濃度測量：
依據廠商說明書製備標準品作標準曲線。加入50 µl 標準稀釋
液(standard diluent buffer)至標準品濃度為 0 pg/ml 孔後，取 50µl
標準品或50 µl 血漿樣品，加入 96 孔盤中，除了 blank 孔外加入 50 µl biotin conjugated anti- TNF-α 溶液，蓋上孔盤蓋子，室溫下
培養1.5 小時。吸除孔盤中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗 4 次 (400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外加入 100 µl streptavidin-HRP working 溶液，室溫下培養 45 分鐘。吸除孔盤中的液體後，使用 沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，每孔加入 100 µl stabilized chromogen ，室溫下避光培養 30 分鐘，最後加入 100 µl 終止溶
液終止反應，使用 ELISA reader 測定波長 450 nm 之吸光值。依 標準品濃度及吸光值作出標準曲線，可依標準曲線得知樣品濃 度；測定吸光值時間在加入終止溶液後2 小時之內完成。
(5) IFN-γ 濃度測量：
依據廠商說明書製備標準品作標準曲線。加入 100 µl 標準稀 釋液(standard diluent buffer)至標準品濃度為 0 pg/ml 孔後，取 100µl 標準品，或 50 µl 血漿樣品加 50 µl 標準稀釋液/孔，加入 96 孔盤中，蓋上孔盤蓋子，37℃下培養 2 小時。吸除孔盤中的液體 後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外 加入100 µl biotin conjugated anti-IFN-γ 溶液，蓋上孔盤蓋子，37
次(400 µl/孔)並吸乾，除了 blank 孔外加入 100 µl
streptavidin-HRP working 溶液，37℃下反應 45 分鐘。吸除孔盤 中的液體後，使用沖洗緩衝液沖洗4 次(400 µl/孔)並吸乾，每孔加 入100 µl stabilized chromogen ，室溫下避光培養 20 分鐘，最後 加入100 µl 終止溶液終止反應，使用 ELISA reader 測定波長 450 nm 之吸光值。依標準品濃度及吸光值作出標準曲線，可依標準曲
線得知樣品濃度；測定吸光值時間在加入終止溶液後2 小時之內 完成。
2. 迴腸樣品製備
大鼠在誘發18 hr 後犧牲時取出迴腸，以含 1mM PMSF 的 PBS 沖洗，並移除腸腔內之碎屑及內容物。由迴盲辦往上 20 公分
腸道取下縱剖，去除黏液，刮下腸黏膜並稱重，將腸黏膜以2：1：
1 分成三等份，並秤重。分別用於進行 iNOS 活性、iNOS western 及腸道NO2/NO3分析。
(1) iNOS 活性分析
將迴腸黏膜加入iNOS Extraction buffer = 1：2(w/v)，以玻璃 均質棒均質後，4℃、10,000g 離心 5 min，取上清液做 iNOS 活 性分析。分析方法如同細胞實驗iNOS 活性分析。
(2) iNOS western blotting
將迴腸黏膜western lysis buffer = 1：2(w/v)，以玻璃均質棒 均質後，4℃、10,500rpm 離心 30 min，取上清液存於-70℃，備
用於iNOS western blotting。分析方法如同細胞實驗 iNOS western blotting 方法。
(3)腸道黏膜 NO2/NO3分析
將迴腸黏膜加入50 mM 磷酸鉀緩衝溶液(pH 7.0) = 1：
4(w/v)，以玻璃均質棒均質後，4℃、10,000 g 離心 15 分鐘，取 上清液存於-20℃，備用於 NO2/NO3分析。分析方法如同細胞實驗 NO2/NO3分析方法。
3.蛋白質濃度測定(Bio-Rad)
依據廠商說明書，取 10 µl 樣品或標準品加入 1：4 稀釋之分 析藥劑 200 µl，混合反應 5 分鐘後，測波長 595 nm 下的吸光值。
以濃度為 0、0.125、0.25、0.375、0.5 mg/ml 的 BSA 標準品畫 出標準曲線經由內插法求知樣品濃度。