MTT 分析

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)為一種水溶性的 tetrazolium salt，當其溶解在不含酚紅 ( phenol red )的培養基或是鹽溶液時呈淡黃色，可藉由活細胞之 粒線體作用，將其tetrazolium ring 打開轉變為非水溶解性藍紫色 的formazan (1-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-3,5-diphenylformazan

)。由於 formazan 產量與存活細胞數量的多寡有密切相關。因 此可利用此比色法來分析細胞的存活率及增生的情形。

依照廠商說明書進行，在96 孔盤中每孔加入 100 µl 細胞培 養液，並於培養時間結束時加入10 µl/well MTT/PBS 混合液，混 合後在37℃培養 4 小時，再加入 100 µl isopropanol，於波長 570nm 下測其吸光值，並以 630nm 之吸光值為 reference。

(四)、iNOS 活化及定量分析 1.蛋白質濃度測定(Bio-Rad)

使用Bio-Rad 蛋白質分析 kit，依據廠商說明書，取 10 µl 樣 品或標準品加入1：4 稀釋之分析藥劑 200 µl，混合反應 5 分鐘 後，測波長595 nm 下的吸光值。以濃度為 0、0.125、0.25、

0.375、0.5 mg/ml 的 BSA 標準品畫出標準曲線經由內插法求知 樣品濃度。

2. NO₂/NO₃分析

因為細胞產生之 NO 會很快的轉為較穩定的 NO₂+ NO₃形 式，因此我們測量 NO₂/NO₃的含量來代表樣品中 NO 的濃度。

依據廠商說明書，取 78 µl 樣品上清液加入 96 孔盤中，再添 加39 µl 的 NADPH 溶液，3 µl Nitrate Retase 溶液於室溫下靜置 30 分鐘，利用 ELISA 讀取 540 nm 波長下的吸光值(A₁)，再添加 39 µl Sulfanilamide 溶液和 39 µl N-(1-naphthyl)-ethyl

enediamine 溶液呈色，避光混合 10 分鐘，在相同波長下讀取吸 光值(A₂)。濃度計算如下：

UA sample＝(A₁－A₂)_sample－(A₁－A₂)_blank

利用NaNO₂及KNO₃製作標準品所得曲線比對，可得知樣品濃 度。

3. 一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)活性分析

原理：因為 Arginine 經由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的作用形成 citrulline 和 NO，因此可以測 citrulline

或NO 的產量表示 NOS 的活性。Citrulline 測定時，為了提高精 確度，會以放射線[¹⁴C]- 或[³H]- L-arginine 利用陽離子交換樹脂

結合未反應之arginine，並置換出[¹⁴C]- 或[³H]- citrulline 定量；

NO 測定則是直接測定由 arginine 產生的 NO 濃度。這兩種方法

皆有學者利用，本實驗比較citrulline 或 NO 的產量來測定 NOS 的活性。

(1) iNOS 粗萃物製備

細胞培養在 5 cm dish 中約八分滿時，加入 cytokines 或大 蒜成分再培養18 hr 後，以 Trypsin-EDTA 將細胞洗下離心。加 入100 µl 萃取 buffer (含 0.32M Sucrose, 20mM Hepes,0.5 mM EDTA, 1mM dithiothroitol, 10µg/ml pepstatin, 10µg/ml

leupeptin,1mM PMSF)，均質後，在 4℃下以 10000 g 離心 5 分 鐘，取上清液分析。

(2) 陽離子交換樹脂製備方式

取100 g DOWEX 50W 以水洗至上清液澄清後，以 1 L HCl

(3M) 攪拌清洗 30 分鐘，在靜置 30 分鐘後倒掉上清液。接著以 大量二次水清洗兩次至上清液呈中性。以1 L NaOH (2M) 攪拌 清洗30 分鐘，在靜置 30 分鐘後倒掉上清液。接著以大量二次水 清洗兩次至上清液呈中性。重複以HCl 清洗後，加入 NaOH，接 著以Buchner 抽吸過濾瀝乾樹脂後，以二次水清洗至上清液呈中 性。混合後取少量樹脂水加入指示劑，使其呈綠色為止。水分抽 乾後刮下樹脂餅，加入等倍的水，放入冰箱冷藏備用。

(3) iNOS 活性分析

取10 µl sample，加入 90 µl assay buffer ( 20 mM Hepes,100 µM NADPH,100 µM NaBH4,10 µM arginine,1 µCi/ml [¹⁴C]- L-arginine)，在 37℃的乾浴槽中培養 0, 10, 45 分

鐘後，加入25 µl 25% PCA 終止反應，並以 TEA (0.5M)/KOH (2M) 中和成中性(PH 7)。再以 8000 rpm 離心 2 分鐘取上清液，-20

℃保存，做放射性及NO₂/NO₃分析。

(4) [¹⁴C]- citrullin 分離及定量

將含有[¹⁴C]-arginine 的上清液 130 µl 加入填充 1.5 ml 陽離 子交換樹脂Dowex AG50WX-8 (Na⁺ form)的管住中，以 4 ml wash buffer (1 mM citrulline)沖出，混合均勻後取出 1 ml 後加入

3 ml 的閃爍計數液均勻混合，利用閃爍偵測器偵測 5 分鐘，放射

量以cpm 表示。

(5) NO 分析

將經由iNOS 活性分析後之樣品依照 NO₂/NO₃分析法分析。

4. iNOS 蛋白質定量分析