參考國內各大標本館之採集記錄及相關文獻，針對傅氏唐松草複合群每 個族群進行採樣，每個族群取 5-10 個樣本，將取得的樣本以矽膠乾燥以作為 DNA 萃取之用。族群採集地點之地理資訊記錄於表 2-2、圖 2-1。
表 2- 2、傅氏唐松草複合群採集地點之地理資訊
分類群 地點 代號 經緯度 海拔(m) 個體數
大花傅氏唐松草
T. urbaini var. majus
研海林道 YH 121°30'40."E 24°09'59"N 1175 4
傅氏唐松草 花蓮銅門 TM 121°27'47"E 23°58'57"N 200-300 7 T. urbaini var. urbaini 南橫關山 KS 120°55'44"E 23°14'41"N 3000 7 紅石林道 HS 121°08'01"E 23°04'13"N 1200 9 塔塔加鞍部 TT 120°57'21"E 23°28'34"N 2600 10 玉山圓峰 YF 120°54'36"E 23°27'42"N 3600 6 瑞芳 RF 121°49'29"E 25°05'25"N 400-500 7 大屯山系 DT 121°30'00"E 25°09'00"N 600-700 10 雪山黑森林 SS 121°14'57"E 24°23'28"N 3400-3500 5 中橫合歡 HW 121°16'18"E 24°08'24"N 3200 5 大霸尖山 DB 121°12'10"E 24°28'22"N 2600-3000 2 能高越嶺西段 NK 121°14'06"E 24°02'50"N 2400-2600 8 石碇 SD 121°37'28"E 24°57'49"N 500 9 南湖唐松草 南湖大山圈谷 rNH 121°25'56"E 24°22'08"N 3200 7 T. rubescens 大霸尖山 rDB 121°15'32"E 24°27'33"N 3000-3200 3
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圖 2- 1、傅氏唐松草複合群之採集地點
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二、研究方法
1. 分子研究方法 (1) DNA 萃取
主要以新鮮研究材料或矽膠乾燥樣本，部分來自各大標本館館藏 標本材料，以 VIOGENE 的 Plant Genomic DNA Extraction Miniprep System Kit 進行 DNA 萃取
a. 取適量植物體葉片組織放入 2 ml tube 中，浸以液態氮後再置入均質 機震盪數次，將組織磨碎。
b. 於各樣本中分別加入 400μl PX1 Buffer，充分混合。
c. 將上述步驟之產物放入 65℃之乾浴槽內 10 分鐘，每隔 3-5 分鐘將樣 本取出搖晃均勻。
d. 將各樣本加入 130μl PX2 Buffer 充分混合後，放入冰浴至少 5 分鐘。
e. 將上述步驟的混合物移至過濾管(Shearing tube)中，再以轉速 13,000 rpm 離心 2 分鐘，將混合物過濾至收集管中並換到新的離心管中 f. 將上述步驟的產物，加入 0.5 倍體積的 PX3 溶液與等體積的無水酒
精，緩慢均勻混合。
g. 取上述步驟的混合液 650μl，移至 Plant Genomic DNA Mini Column，
下置一收集管，以轉速 13,000 rpm 離心 1 分鐘，留下吸附 DNA 的 濾膜，將濾出至收集管的液體丟掉。
h. 取步驟 f 的剩餘產物至離心管中，重複步驟 g。
i. 加入 0.7 ml 的 Wash buffer，再以轉速 13,000 rpm 離心 1 分鐘，移除 離心管內的液體，重複此步驟一次。
j. 將離心管以轉速 13,000 rpm 離心 3 分鐘，移除殘留的液體。
k. 將 Plant Genomic DNA Mini Column 換至 1.5 ml tube，加入 100 μl(65℃)的二次水於濾膜上，以轉速 10,000 rpm 離心 1 分鐘，重複
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此步驟一次，濾出液體即為萃取出的 DNA 溶液。
l. 將 DNA 保存於-20℃冰箱。
(2) 引子選擇
核 DNA 片段選用 ITS (Internal Transcribed Spacer)，引子為 Moller &
Cronk (1997)設計之引子，此對引子已確認在許多類群皆可成功擴增單 一片段。
葉綠體 DNA 片段則選用的 matK 片段、 trnL-trnF 基因間片段(包 含 trnL intron)、trnQ-rps16 基因間片段(引子序列及出處見表 2- 3)。
表 2- 3、核 DNA 及葉綠體 DNA 引子序列資訊
primer sequences 5’-3’ References
ITS:
ITS-5P GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G Möller&Cronk 1997
ITS-8P CAC GCT TCT CCA GAC TAC A Möller&Cronk 1997
matK:
matK:AR2 CTT TCA GGA RTA CAT TTA TGC Wang et al 2007
matK:8R2 ACG WGC CAA AGT TCT AGC AC Wang et al 2007
trnQ-rps16
trnQ(UUG) GCG TGG CCA AGY GGT AAG GC Shaw et al 2007
rps16 x1 GTT GCT TTY TAC CCA CAT CGT TT Shaw et al 2007 trnL-F:
trnL intron fwd CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG Taberlet 1991
trnF rev ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG Taberlet 1991
(3) PCR 反應詴藥與濃度
每個 PCR 反應詴劑體積為 15μl，各詴藥之濃度、所需體積及最 終反應之詴劑濃度如表 2- 4。
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表 2- 4、PCR 反應詴藥與濃度
藥品 體積
ddH2O 11.25μl
Buffer(lml, Lot#KB12-PTM, Poster) 1.5μl dNTP(2.5mM/ml, Lot kco4-PTM, Poster) 0.8μl Tag(500 units, 5μ/μl, Lot# JH10-PTM, Poster) 0.15μl
Primer x 2 0.15μl
DNA 1μl
(4) 聚合媒連鎖反應(PCR: Polymerase Chain Reaction)條件
先以 94℃處理六分鐘，使雙股 DNA 變性。再以 94℃一分鐘、50℃
黏合溫度 50 秒、72℃延長溫度兩分種，進行 35 次的擴增循環。最後 保持 72℃處理 7 分鐘。反應溫度降至室溫(25℃)保存。
(5) 結果檢測
以 1xTBE Buffer 所配製的 1% agarose gel(含 0.25μg/ml 之 EtBr 染 劑)在 120 mA 條件下，加入長度參考標記，進行電泳 10-15 分鐘，然 後置於紫外燈下觀察記錄產物長度及是否為單一條帶。以 ABI 3730
XL DNA Analyzer (Applied Biosystems)定序完成。
(6) 序列整理與分析
PCR 後所擴增的 DNA 產物送至廠商進行定序作業，所得檔案利用 Sequencer 4.7 軟體進行人工判讀，部分資料 由 National center of biotechnology information(NCBI)資料庫下載以供分析(附錄一)；利用 Bioedit 7.0.5 軟體(Hall, 1999)進行序列比對及多重序列排序(multiple sequence alignment)並刪除前後不清楚的資料，最後將序列存成 fasta 檔案格式，以供後續分析使用。
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2. 複合群遺傳結構分析 (1) 遺傳變異分析
以 DnaSP5.10.01 軟體(Rozas et al., 2003)將樣品歸群後，計算核苷 酸歧異度(nucleotide diversity,π)、單套型歧異度(haplotype diversity, h)、
中性假說測詴(Tajima’s D test, Fu & Li’s test)。基於長 indel(2 個核苷酸 以上)應視為一次演化事件，因此將 2 個核苷酸以上的 indel 處理為一 個核苷酸的變異。DnaSP 軟體會將空隙(gap)排除不列入計算，因此會 導致空隙的訊息漏失。分析前可將序列上的空隙改成其他的核苷酸形 式。
藉由π值與h值大小的比較組合，可以用來解釋物種或族群在歷史 上經歷的過程(Grant & Bowen, 1998)：
1 .族群具有低的h與低的π：顯示族群近期經歷了長期或嚴重瓶頸效應 (bottleneck)或創始者效應(founder effect)，族群由少數個體成長而來，
經歷的時間太短無法累積變異，大部分族群都具有相同基因型。
2. 族群具有高的 h 與高的 π：顯示此族群數量大且長期處於穩定的成長，
或是由兩個具有高程度分化族群在次接觸後譜系混雜所造成。
3. 族群具有低的h與高的π：兩個獨立分化之族群經由遷移而成為同一族 群或是發生在有效族群數量大且穩定之族群，歷經嚴重瓶頸效應後所 產生之現象(Bermingham & Avise, 1986; Planes & Doherty, 1997)。
4. 族群具有高的h與低的π：早期曾發生瓶頸效應，長期處於低度有效族 群量，族群快速擴張後，經歷的時間足以恢復基因型的多樣性，卻不 足以累積大量的序列變異(Rogers & Harpending, 1992; Avise, 1994)。
(2) 最小關聯網狀圖(Minimum spanning network, MSN)
利用 TCS1.21 軟體(Clement et al., 2000)建構各單套型之最小關聯 網狀圖。
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(3) 中性假說(Neutral theory)檢測
中性假說的理論基礎為族群中的遺傳變異大部分是受隨機的遺傳 漂變所影響，而非受到天擇影響，因此核苷酸變異只受突變速率的影 響，演化較快的基因具有較多的遺傳變異(Kimura, 1983)。利用 DnaSP
軟體計算π 值與 θ 值是否有顯著差異，兩者的主要差異在於 θ 值只計
算核苷酸變異位置的數目，π 值除了數目還需考慮變異出現的頻率，
因此θ 值容易受到稀少變異的影響，因此透過 π 值與 θ 值差異的分析
可以檢驗序列是否受到天擇作用或族群大小變動的影響(Tajima, 1989;
Fu & Li, 1993)。
(4) 遺傳分化指數(Fst)及基因流傳指數(Nm)
使用DnaSP5.10.01軟體(Rozas et al., 2003)計算兩兩族群間的族群分 化指數(Fst)(Hudson et al., 1992)。
Fst= 1 Hw / Hb (Hudson et al, 1992)
Hw 及 Hb 分別為族群內及族群間兩兩序列的平均核苷酸差異，利用此 Fst 值代表族群間分化的程度(Wright, 1965)。當族群內或族群間核苷酸 無差異時(Hw=0 或 Hb=0)，Fst 值為 1；反之，若族群間核苷酸差異 與族群內相同，Fst 值為 0。
利用得到之 Fst 值代入公式得到 Nm 值。
Nm = (1/ Fst-1) / 2
當 Nm 值大於 1 時代表基因流傳順暢，足以抵銷族群間因為天擇及基 因漂變(genetic drift)所導致的族群分化(Slatkin, 1987)。
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(5) 距離隔離分化(Isolation by distance, IBD)
使用 Isolation by distance Web Service Version 3.16
(http://ibdws.sdsu.edu/~ibdws/distances.html) (Jensen et al., 2005)測詴傅 氏唐松草複合群之遺傳距離與地理距離是否具相關性，地理距離利用 Google earth 軟體以幾何距離法計算，遺傳距離以 Fst
表示，檢測兩兩族群之間的遺傳距離與地理距離的相關性。測詴族群 間的分化是否符合距離隔離分化之模型。
(6) 族群變異分布分析 (Mismatch distribution):
利用 DnaSP 5.10.01 軟體計算族群內兩兩個體間核苷酸序列差異 (pairwise differencee) 在統計上分布的情形，根據核苷酸差異的分布模 式來推估族群過去的演化歷程。若出現單峰分布，顯示族群曾出現快 速擴張；反之，若為多峰分布，則表示族群處於穩定狀態 (Rogers &
Harpending, 1992) 。
(7) 巢狀支序分析(Nested clade phylogeographic analysis, NCPA)
以 GeoDis v2.6 軟體(Posada et al., 2000)計算 Dc (clade distance)與 Dn (nested clade distance) (Templeton et al., 1995)，分別對分支在地理上 的分布情形，及同樣層級的分支間是否有明顯的地理關連兩方面做顯 著性統計。
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