1. 外部形態
觀察新鮮材料和國內外各大標本館藏臘葉標本之外部形態特徵、採集 地點及生育環境，記錄每份標本的外部形態特徵，包括葉、花、果等各部 形態，並拍照記錄。
2. 地理分布
野外採集標本時，記錄其地理位置、海拔高度等資料，觀察其生育地 生態環境，將各分類群出現之地理位置標示在地圖上，並將其所處的生態 環境資料加以統整。此外，為了補足採集資料之不足，亦參考各大標本館 之臘葉標本上的採集資訊。
3.分子研究方法 (1) DNA 萃取
主要以新鮮研究材料或矽膠乾燥樣本，部分來自各大標本館館藏標本材 料。
a. 取適量植物體葉片組織放入 2 ml tube 中，浸以液態氮後再置入均質 機震盪數次，將組織磨碎，以 VIOGENE 的 Plant Genomic DNA Extraction Miniprep System Kit 進行 DNA 萃取。
b. 於各樣本中分別加入 400μl PX1 Buffer，充分混合。
c. 將上述步驟之產物放入 65℃之乾浴槽內 10 分鐘，每隔 3-5 分鐘將樣 本取出搖晃均勻。
d. 將各樣本加入 130μl PX2 Buffer 充分混合後，放入冰浴至少 5 分鐘。
e. 將上述步驟的混合物移至過濾管(Shearing tube)中，再以轉速 13,000
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rpm 離心 2 分鐘，將混合物過濾至收集管中並換到新的離心管中 f. 將上述步驟的產物，加入 0.5 倍體積的 PX3 溶液與等體積的無水酒
精，緩慢均勻混合。
g. 取上述步驟的混合液 650μl，移至 Plant Genomic DNA Mini Column，
下置一收集管，以轉速 13,000 rpm 離心 1 分鐘，留下吸附 DNA 的 濾膜，將濾出至收集管的液體丟掉。
h. 取步驟 f 的剩餘產物至離心管中，重複步驟 g。
i. 加入 0.7 ml 的 Wash buffer，再以轉速 13,000 rpm 離心 1 分鐘，移除 離心管內的液體，重複此步驟一次。
j. 將離心管以轉速 13,000 rpm 離心 3 分鐘，移除殘留的液體。
k. 將 Plant Genomic DNA Mini Column 換至 1.5 ml tube，加入 100 μl(65℃)的二次水於濾膜上，以轉速 10,000 rpm 離心 1 分鐘，重複 此步驟一次，濾出液體即為萃取出的 DNA 溶液。
l. 將 DNA 保存於-20℃冰箱。
(2) 引子選擇
核 DNA 片段選用 ITS (Internal Transcribed Spacer)，葉綠體 DNA 片 段則選用的 matK、trnL-trnF(包含 trnL intron)基因間片段，引子序列及 出處見表 1- 4。
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表 1- 4、核 DNA 及葉綠體 DNA 引子序列資訊
primer sequences 5’-3’ References
ITS:
trnL intron fwd CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG Taberlet 1991
trnF rev ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG Taberlet 1991
Buffer(lml, Lot#KB12-PTM, Poster) 1.5μl dNTP(2.5mM/ml, Lot kco4-PTM, Poster) 0.8μl Tag(500 units, 5μ/μl, Lot# JH10-PTM, Poster) 0.15μl
Primer x 2 0.15μl
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DNA Analyzer (Applied Biosystems)定序完成。
(5) 資料整理
定序所得檔案利用 Sequencher 4.7 軟體進行人工判讀，部分資料由 National center of biotechnology information(NCBI)資料庫下載以供分析 (附錄一)；利用 Bioedit7.0.5 軟體(Hall, 1999)進行序列比對及多重序列排 序(multiple sequence alignment)並刪除前後不明確的資料，最後將序列存 成 fasta 檔案格式，以供後續分析使用。
4. 分子資料分析
(1) 鄰近連接分析(neighbor-joining analysis, NJ)
使用 MEGA 4 軟體(Kumar et al. 2007)以距離法(distance)進行近鄰 連接分析(Saitou & Nei, 1987)以建構樹形圖，利用連續性的鄰近搜尋演 化樹，以求取綜合演化樹中距離最短的樹，信賴程度(bootstrap)以 1000 次特徵重複取樣進行評估。
(2) 最大簡約分析(maximum parsimony analysis, MP)
使用 PAUP*軟體 4.0b10 (Swofford, 2002)以最大簡約法建構樹形 圖， 將空隙(gap)設定為第五特徵態，指定外群後，利用啟發式收尋 (heuristic searches)進行 1000 次重複的 random stepwise addition，所得 樹型圖的每個分枝的信賴程度以 5000 次特徵重複取樣進行評估。
(3) 遺傳變異分析
以 DnaSP 5.10.01 軟體(Rozas et al., 2003)將樣品歸群後，計算單套 型歧異度(haplotype diversity, h)、中性假說測詴(Tajima’s D test, Fu &
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Li’s test)。基於長 indel（2 個核苷酸以上）應視為一次演化事件，因此 將 2 個核苷酸以上的 indel 處理為一個變異點。DnaSP 軟體會將空隙(gap) 排除不列入計算，因此會導致空隙的訊息漏失。分析前將序列上的空 隙改成其他的核苷酸形式。
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