三、實驗結果

式，直接稀釋即可。從預測分析得知hTMPK 之等電點(Isoelectric point) 約為 8.73，

當pH 值為 7.0 時 hTMPK 淨電荷約為 3.30 (表 1)，因此預期在 Q column 純化時，

hTMPK 的蛋白並不會與管柱結合。而從陰離子管柱的層析圖譜中可以發現 (圖 9-1)，hTMPK 蛋白確實不會與陰離子管柱結合，並從 SDS-PAGE 的分析可以看到 (圖

9-2) ，從 A2 到 A8 流出的片段，在 20 kDa 和 30 kDa 之間有大量且高純度的 hTMPK

象。之後再將配置好的溶液，再做一次蛋白定量，以確保蛋白濃度坐落於15 到 20 體撈起，以Cryoprotectant 進行清洗後，去除殘餘在晶體及 loop 上的蛋白溶液，之 後再溶解於SD200 緩衝液中，以 SDS-PAGE 分析確認，然而我們也會同步將這些 晶體撈起並且利用X-ray 進行繞射實驗 (圖 19)，分析此晶體是否為蛋白之晶體。

並將這些確定為蛋白晶體的條件進行微調，以提升晶體的品質，使解析度提升。其

中含有 AMPPNP 與鎂離子之 hTMPK 樣品的結晶條件經微調後可得蛋白晶體(圖 除晶體中的AMPPNP，並以結構解析來確認其 AMPPNP 的結合狀態，然而經過了 1 天的 crystal soaking out 的實驗，發現晶體出現明顯裂痕，並且碎成兩個部分(圖 20)，我們之後將比較大的片段拿去做 X-ray 繞射實驗做進一步的分析，然而將數

從HKL2000 軟體將數據彙整後，找到(I) 、(II) 、(III)條件之晶格排列 (space group) 為

P4

2

2，與先前研究解出之晶格排列一致 (24)，然而(IV)條件的之晶體細小並且

續的結構解析，之後一方面利用微調的方式試圖找到更好的結晶條件，同時也利用 dUMP 則位於 P-loop、DR motif (D95 到 Y97)與 Lid region (F135 到 F151)所形成的 結合空間中，與先前研究所解出之結構大致相同(圖 23) (24)。

3-5 hTMPK、dUMP、AMPPNP 共結晶之結構解析

然而在與 dUMP 和 AMPPNP 的複合體結構中，相較於 hTMPK、dTMP 與 AMPPNP 之複合以結構，Lid region 有比較不穩定的情形，其電子密度比較不清楚，

但總體來說是差異不大的，然而我們卻意外在P-loop 的結構發現一個差別(圖 24)，

3-6 hTMPK、dTMP、AMPPNP 共結晶之結構解析

另一個值得注意的是，hTMPK 與 dTMP 之結構第一次被解出，發現在其 P-loop 的位置從原本 P-loop 的結構轉換成 1 號α-helix 的延伸，並將原本與 ATP 結合 的位置完全佔據(圖 27,28)，而 dTMP 的磷酸基團所旋轉的方向也與含 AMPPNP 之 結構不同，這個結構與先前研究之酵母菌TMPK 與 dTMP 之結構 (PDB code 1TMK) 進行疊合(superposition)相比發現 (圖 29)，在酵母菌 TMPK 結構中，P-loop 仍維持 原本loop 的結構，其 R15 利用 guanyl 基團的一端與 Lid region 上的 E154 形成離 子鍵，而D14 可與 Y102 以及 dTMP 核糖 C³上的hydroxy 基團形成氫鍵。 然而在 人類的結構中可以看到，其P-loop 上的 R16 一端以 guanyl 基團與 dTMP 之磷酸基 團形成離子鍵，並同時與Lid region 上的 E152 也形成離子鍵，而 D15 則是朝向與 dTMP 反方向的位置，並無明顯的交互作用，這些變化將整個 P-loop 扭轉向 dTMP 的方向，形成α-helix 的延伸。而與這次實驗所解出之 hTMPK、AMPPNP 與 dTMP 之結構分析可以發現 (圖 27)，當含有 AMMPNP 存在時 P-loop 主鏈上的 amide 基 團可以與AMPPNP 的 α 及 β 磷酸根交互作用，使 AMPPNP 可以與 P-loop 結合，

然而不含AMPPNP 存在時，其 P-loop 部分形成 1 號 α-helix 的延伸，這個延伸出 來的部分與 AMPPNP 之分子有重疊的情形，將整個結合位置佔據。在 Lid region 的差異上，AMPPNP 存在時，Lid region 可以有需多交互作用來穩定 loop 結構，其