五、圖 - 人類胸腺嘧啶核酸激酶與抑制物YMU1之複合體結構解析

(Reichard 1988)

圖 1：dNTP pool 的新合成路徑(de novo pathway)

從圖片中可以看到關於 dNTP pool 新合成路徑的酵素，其中 dTTP 合成的前驅物dUMP 需要經過 dCMP deaminase 以及 dUTPase 來催化，dUMP 再經由 TS 催化成dTMP，之後由 hTMPK 催化為 dTDP，最後由(d)NDP kinase 催化成 dTTP，以供給DNA 的合成。

(Rampazzo, Ferraro et al. 2004)

圖 2：dTTP 之合成路徑

從圖中可以看到細胞中 dTTP 的合成，經由 TS 的 de novo pathway 以及 TK1 的 salvage pathway 合成的 dTMP 都必須經由 TMPK 的磷酸化，最後才能生合成 dTTP。

TS

TMPK

dNDP kinase

圖 3：不同物種 TMPK 之序列分析

從序列分析比較人類、小鼠及酵母菌之 hTMPK，其催化相關的三個 loop 序列中可以發現P-loop 與 DR motif 有較高的保留性，而 LID region 保留性較低，根據物種由不同胺基酸組成。

圖 4-1：Doxorubicin 之結構

Doxorubicin 又稱為 Adriamycin，為 topoisomerase II 之抑制物，目前被廣泛用於癌症的治療上，但其副作用可能會造成噁心嘔吐及不可逆之心肌損傷，因此癌症病人終其一生能所使用的劑量有限。

圖 4-2：hTMPK 抑制劑 YMU1 之結構

YMU1 為 hTMPK 之專一性抑制物，經實驗證實無顯著細胞毒性，並且能增加 癌細胞對於doxorubicin 的敏感度。

(Hu, Yeh et al. 2012)

圖 5：hTMPK 與 YMU1 結合之模擬結構

結構模擬的結果指出，原本與 ATP 結合的 P-loop 亦可能參與 YMU1 與 hTMPK 的交互作用，因此推論YMU1 可能會影響到 D15 與 Mg²⁺在催化上作用，達到抑制 hTMPK 的效果。

圖 6：結晶條件之微調

從初步掃描到的結晶條件中，些微調整其沉澱劑濃度、pH 值或是鹽離子濃度，

沉澱劑每次調整約上下2 %左右，而 pH 值約上下調整 0.2 左右，鹽濃度則看條件而定，找到適合長晶體的條件後，可以改變其中心點位置，進行進一步的微調，直到可以得到品質夠好且大量的晶體提供接續的實驗使用。

圖 7：利用 crystal soaking 製備 hTMPK 與 YMU1 複合體晶體之方法

我們可以利用crystal soaking 的方法來解決使用共結晶無法得到之 hTMPK 與 YMU1 之晶體，利用擴散的原理，在不劇烈改變晶格排列的前提下，維持晶體的完整，將目標分子擴散進晶體的方式取得，在我們的實驗中，在取得 AMPPNP 與 dTMP 之晶體後，先將晶體浸泡在不含 AMPPNP 及 1 mM EDTA 的 cryoprotectant 中，將Mn²⁺及AMPPNP 給擴散出來，再放入含有 YMU1 及 Mn²⁺之cryoprotectant 使YMU1 能夠擴散進蛋白中，再將此晶體保存於液態氮中，做進一步的 X-ray 繞射實驗。

圖 8：GST-hTMPK 融合蛋白之小量表現

根據 SDS-PAGE 的分析，M 代表 marker、C 為 control、4.5 至 9.5 表示誘導的時間，可以發現在4.5 到 6.5 小時 GST-hTMPK 的蛋白表現量最多，從 7.5 小時後慢慢被降解，因此之後大量表現就以誘導4.5 小時後收菌。

M C 4.5 5.5 6.5 7.5 9.5

97 kDa

66 kDa

45 kDa

30 kDa

20 kDa

14.4 kDa

GST-hTMPK 約 50 kDa

圖 9-1

Q column 20120726 TMPK002:10_UV1_280nm Q column 20120726 TMPK002:10_Conc Q column 20120726 TMPK002:10_Fractions

圖 10-1

SD200 TMPK 20120726:10_UV1_280nm SD200 TMPK 20120726:10_Fractions

60.0 80.0 100.0 120.0 ml

123 4 56 7 8 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 Waste

圖 11：hTMPK 之穩定性

從圖中可以發現，當 hTMPK 以 2 mg / ml 保存在 4 度下保存 26 天後，再將蛋白濃縮通過分子篩膠體管柱，可以發現 hTMPK 依舊保持 monomer 的形式，並無沉澱之情形，這說明在目前的條件中hTMPK 是可以穩定存在一段時間的。

SD200 hTMPK 20120821(after 26 days)001:10_UV1_280nm SD200 hTMPK 20120821(after 26 days)001:10_Fractions

0 500 1000 1500 2000 mAU

40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 ml

5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627 Waste

圖 12-1 Membfec 24 圖 12-5 Index 81

圖 12-2 Index 89 圖 12-6 Index 68

圖 12-3 CSI 6 圖 12-7 PEG / Ion2 H12

圖 12-4 Salt Rx E7 圖 12-8 Salt Rx C6

圖 12：hTMPK 與 YMU1 及 dTMP 條件下結晶出之晶體

這些晶體經過測試，大部分為鹽的晶體，只有圖 13-3 及圖 13-4，經過 X-ray 繞射實驗發現沒有繞射點，不確定是否為蛋白晶體。

圖 13-1 3D structure E6 圖 13-5 Index F8

圖 13-2 Index D10

圖 13-6 Index F9

圖 13-3 PEG / Ion1 H6

圖 13-7 Index G1

圖 13-4 Index F7 圖 13-8 Index H1

圖 13-9 Index G3 圖 13-13 Index H8

圖 13-10 Index G6 圖 13-14 Index H10

圖 13-11 Index G7 圖 13-15 Wizard1 B9

圖 13-12 Index H2 圖 13-16 PEGRx2 H7

圖 13-17 PEGRx2 G3 圖 13-19 PEGRx1 C11

圖 13-18 PEGRx2 F7 圖 13-20 PEG / Ion2 B2

圖 13：hTMPK、AMPPNP、dTMP 與 MnCl2之條件所結晶出之蛋白晶體

hTMPK 與 AMPPNP 以及 dTMP 的晶體非常容易取得，這邊只放上 20 張晶體照片以及其條件，事實上，我們掃到的條件還有更多，並沒有放上來，但是這些條件已足夠我們做接下來結構分析以及crystal soaking 的實驗，而在條件中沒有使用 MgCl2而使用 MnCl2的原因是 Mg²⁺較容易與磷酸根產生鹽類的晶體，為避免影響晶體形成以及誤判，所以使用MnCl2。

圖 14-1 PEG / Ion2 D12 圖 14-3 PEG Rx2 H8

圖 14-2 PEG Rx1 D2

圖 14：hTMPK 與 dTMP 之條件所結晶出之蛋白晶體

經過結晶條件的篩選，我們成功的取得了 hTMPK 與 dTMP 之晶體，然而這些 晶體必須經過一個月以上的時間才形成，並且目前仍很難出微調出這些晶體，目前只用掃晶體的kit 重複出圖 15-1 之條件，這些晶體適合用來直接做 YMU1 的 crystal soaking 實驗，並且可以多加了解 hTMPK 的催化機制，目前成功將圖 15-3 之晶體以X-ray 繞射實驗進行數據收集並解出結構，其解析度為 1.96 Å。

圖 15-1 Index 46 ( 1 / 2X ) 圖 15-2 Index 46 ( 1 / 3X )

圖 15：hTMPK、AMPPNP、dUMP 與 MgCl2之條件所結晶出之蛋白晶體

我們成功找到了一個能結晶出 hTMPK 與 AMPPNP 以及 dUMP 晶體的條件，

雖然已經有更適合的晶體可以用來做crystal soaking 的實驗，然而 hTMPK 與 dUMP 的晶體結構仍未被人解出，此晶體之結構有助於解釋 hTMPK 對 dUMP 及 dTMP 之受質選擇性。

圖 16-1 Index 92 ( 1 / 2X ) 圖 16-2 Index 92 ( 1 / 3X )

圖 16：hTMPK、AMPPNP 與 MgCl2之條件所結晶出之蛋白晶體

為了解釋 hTMPK 是否有對受質結合的先後順序，因此與 AMPPNP 之晶體結可以配合與 dTMP 之結構做比較，觀察其是否有結構變化，提供一些關於催化機制的資訊。我們成功地找到了只含AMPPNP 晶體的條件，此結構能模擬當 hTMPK 與ATP 結合的情形，並且這個結構也未有人解出，然而其晶體零碎且細小，其解析度最好約為4.0 Å ，並且找不到其晶格排列，等待進一步微調使晶體品質提升。

除此之外，此晶體仍不排除可以用來作為YMU1 的 crystal soaking 實驗。

圖 17：微調 hTMPK-AMPPNP-Mg²⁺複合體的結晶條件

為了取得繞射解析度更好的晶體，我們針對晶體培養的條件進行微調，縱向為 magnesium formate 的濃度，由 50 mM 到 200 mM；橫向為 PEG 3350 之濃度，從 9

%到 19 % (w / v)，約兩週後可從圖右上角之結晶條件得到晶體。

圖 18-1 Index 92 (微調) 圖 18-2 Index 92 (微調)

圖 18：微調後之 hTMPK-AMPPNP-Mg²⁺複合體結晶

微調所得之晶體體積明顯較大並且稜角較為分明，這些晶體經過 paraffin oil 作 為抗凍保護劑，再以X-ray 繞射分析，發現其解析度仍偏低，約為 10 Å 左右。

圖 19：hTMPK、AMPPNP、dTMP 與 MnCl2 條件之晶體，以 X-ray 繞射實驗檢 測是否為蛋白晶體

利用台灣大學生化科學所內之 X 光分子結構分析儀，進行繞射所得到的圖

在文檔中人類胸腺嘧啶核酸激酶與抑制物YMU1之複合體結構解析 (頁 37-57)