(一) 材料來源
本研究分析的材料為台灣原生種蝴蝶蘭之一的蘭嶼姬蝴蝶蘭 P. equestris (2n = 2x = 38)，由伍圓蘭園提供，以水苔種植於成功大學生命科學系溫室。姬 蝴蝶蘭之花期為夏季，待開花後採適當大小花苞，將花苞內的花粉塊予以適當 固定保存供染色體分析用。
(二) 姬蝴蝶蘭粗絲期染色體的製備 1.試驗材料的收集與保存
粗絲期係位於細胞週期中減數分裂的前期 (prophase I)，染色體時期可以 由尚未開花前之花苞長度作簡單的判定。姬蝴蝶蘭開花後，收集長度約 4.5-5 mm 大小之花苞，以聶子及刀片小心取出花苞內之黃色花粉塊，置於新鮮配置 的 carnoy 固定液 (100% acetic acid : 95% ethanol 為 1 : 3)保存在-20℃冰箱中，
待隔天花粉塊顏色由黃色轉變成白色後，將樣品置換到 70%酒精保存以提高固 定的效果。為了比較粗絲期與中期染色體收縮程度的差異，除了花粉外同時也 採集根尖細胞供後續的分析。待姬蝴蝶蘭新長出的幼根約 1-2 cm 左右時，以解 剖刀切取末端的根尖，將根尖垂直對半後浸置於 2 mM 8-hydroxyquinolino 溶液 中 4-5 小時，溫度保持在 15℃。之後取出根尖，在室溫下以蒸餾水洗淨根尖兩 次，每次時間約 5 分鐘，再將此根尖作 carnoy 固定液處理至少三小時或置於固 定液中，於-20℃環境下保存樣品，待根尖轉為白色再置換到 70%酒精保存。
2.花粉細胞粗絲期的鑑定
花粉細胞鑑定的方式，係依據成大生命科學系張松彬老師實驗室所建立的 鑑定方法。保存後的花粉細胞進行鑑定前，先置換到蒸餾水，隨後將花粉置於 載玻片上，以刀片小心切出少許分生組織後，剩餘的花粉塊細胞暫時置回蒸餾
水。用刀片將樣品搗碎後，加一滴 1% 醋酸洋紅 (acetocarmine)染劑，隨即覆 蓋蓋波片 (24 x 32 mm)。將玻片置於酒精燈上來回火烤 3-4 次，此步驟須注意 不要讓醋酸沸騰。接著讓載玻片正面朝下置於濾紙上，以食指及中指固定，再 以大拇指前端輕壓玻片將染色體壓散，於顯微鏡下觀察染色體的時期。姬蝴蝶 蘭粗絲期染色體的特徵為可見一條條明顯散開的絲狀物。若確認該花粉為粗絲 期，將蒸餾水中剩餘之花粉分生組織細胞繼續保存在 70%酒精供後續染色體製 備用。
3.以加熱板製備染色體(用於核型分析)
本實驗係參考台大農藝系劉麗飛老師與張松彬老師合編之植物細胞分子顯 微技術一書中所用的方法。將鑑定過的花粉塊從酒精取出時，先浸泡於蒸餾水 至少 30 分鐘洗去酒精，將花粉切成數小塊以利後續的酵素反應。把樣品先放到 1x citrate buffer (4 mM citric acid, 6 mM sodium citrate, pH 4.5)中，於室溫下靜置 5-10 分鐘，再換到配置的三合一酵素液 ( 1% (w/v) cellulose Onozuka RS (Yakult Honsha), 1% (w/v) pectolyase Y23, 1% (w/v) pectinase solution )，將樣品置於 37℃
烘箱中作用 30-40 分鐘。酵素作用完畢後，用滴管小心吸出樣品置換到蒸餾水，
減緩酵素作用。準備乾淨的載玻片，吸取一花粉置於玻片中央，以濾紙吸去多 餘水分。用酒精消毒過的別針針頭輕輕搗碎花粉後迅速加一滴 45% acetic acid，
用針頭使花粉與 acetic acid 溶液均勻混合。將載玻片放在 42℃加熱板上，靜置 約 5 秒讓已混合的溶液向中央聚集。以別針在不碰觸玻片情況下，來回牽動此 液體並沿著玻片周圍移動擴散，讓染色體能夠平均分散在整個玻片上。在加熱 板上時間約 2 分鐘或樣本液體未完全乾掉前將載玻片從加熱板上移開，用現配 的 carnoy 固定液沖洗此玻片，隨後浸泡於 95% ethanol 數秒，將載玻片置於架 上風乾，再移至 37℃烘箱中，隔天將樣品保存在 4℃冰箱作後續核型分析用。
4.以液態氮製備染色體(用於核型分析與原位雜交反應)
從冰箱取出花粉塊後，仍先將樣品置於蒸餾水至少 30 分鐘，再置換到三合 一酵素液，於 37℃烘箱進行酵素反應 30-40 分鐘，待作用完成將樣品小心置換 到蒸餾水以洗去殘餘的酵素液。準備乾淨的載玻片，吸取一花粉塊至玻片中央，
以濾紙吸去周遭多餘水分，此時加一滴 45% acetic acid 於樣品旁邊，用濾紙吸 去 2/3 的 acetic acid，以別針針頭搗碎樣品後，將剩餘的 acetic acid 與樣品均勻 混合，蓋上蓋玻片(18 x 18 mm)並將載玻片翻轉置於濾紙上，用鉛筆平面端以彈 跳的方式輕輕敲打蓋玻片中央及周圍四個角，讓染色體更容易散開。將載玻片 浸泡於液態氮中，待嘶嘶聲停止及不再冒出氣泡時將載玻片移出液態氮，迅速 以刀片將蓋玻片挑開並將玻片置於 42℃加熱板，待玻片上殘餘的液體尚未完全 烘乾前，以現配的 carnoy 固定液沖洗玻片，浸泡於 95% ethanol 數秒，將載玻 片置於架上風乾，晾乾後於 Nikon ECLIPSE 顯微鏡下觀察，挑選細胞多以及型 態完整、無細胞質且異染色質明顯的玻片，置於 37℃烘箱，隔天將樣品保存於 4℃冰箱作後續原位雜交實驗用。
(三) 螢光原位雜交反應 1.質體 DNA 的抽取
本實驗螢光原位雜交所使用的四種探針及標定方式列於(表 1)。45S rDNA 序列片段來源為小麥 (Triticum aestivum)，單一拷貝數長度約 9 kb，5S rDNA 序 列來自玉米 (Zea mays)，單一拷貝數長度約 700 bp，Telomeric repeat 片段則取 自阿拉伯芥。將含有質體之單一菌落置於 5 ml LB 培養液 (Luria-Bertani medium, 10 mg/ml ampicillin)試管，於 37℃震盪培養 16 小時。核醣體 rDNA 及 telomeric repeat plasmid 的抽取根據 EasyPure Plasmid DNA miniprep kit (Bioman, Scientific) 與 Molecular Biology Tools (BioKit)製備。
分子標誌 SOC1 基因選自姬蝴蝶蘭 BAC library，該基因庫為成功大學生命 科學系吳文鑾老師實驗室所建構，基因庫中的 BAC 選殖體可作為基因定址選
殖 (map-based cloning)與染色體圖譜中基因定位重要的材料。將含質體的菌落 置於 25 ml LB 培養液 (含 12.5 ug/ml CM, chloramphenicol macrolides)，於 37℃
生長箱震盪培養 24 小時。隔天以 13,000 rpm，2 分鐘離心並去除上清液。加入 1 ml STE buffer (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.1 M NaCl)後 充分震盪讓菌塊懸浮，於常溫下以 13,000 rpm 離心 2 分鐘去除上清液，此步驟 重複 2 次。加入 200 µl MP I (25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucose)及 2 µl RNase (10 mg/ml)混合後，在冰上靜置 1 小時，以促進 RNase 的作用。待反應完成，加入 400 µl 現配之 MPII (10N NaOH, 10% SDS, ddH2O)，
翻轉一次且在溶液完全透明前加入 300 µl MPⅢ (3M Potassium acetate (KOAC), 28.5% v/v Acetic acid, ddH2O)，輕輕翻轉數次使白色沉澱物位於溶液上方。在 4℃下以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，取 650-700 µl 透明的澄清液至新的微量離心 管，再加入等體積之 isopropanol，搖晃均勻，在-20℃下靜置 20 分鐘。待 DNA 沉澱，以 13,000 rpm，4℃下離心 10 分鐘並去除上清液，以 500 µl 70% ethanol 清洗 DNA 沉澱物，在 4℃下以 13,000 rpm 離心 5 分鐘去除上清液，於室溫晾 乾後，以 20 µl 65℃無菌水回溶並置於 4℃保存。
2.探針的標定
將含有 5S rDNA、45S rDNA、telomeric repeat 及 SOC1 的 plasmid DNA ， 採用 nick translation 的方式，以 biotin-16-dUTP 及 digoxigenin-11-dUTP 標定探 針，標定的方法參考 Roche (Nick Translation Mix for in situ probes)的實驗步驟進 行。取 1-2 µg template DNA ，加入無菌水使體積至 16 µl，接著再加入 4 µl 的 Digoxigenin-Nick translation mixture (Roche Molecular Biochemicals) 或 (Biotin- Nick translation mixture)使總體積為 20 µl。以 13,000 rpm 短暫離心 30 秒，於 15℃
反應 2 小時。待作用完成後加入 1 µl 0.5M EDTA (pH 8.0)於 65℃水浴槽加熱 10 分鐘以終止反應，再加入 2 µl 4M LiCl (1/10 倍體積)及 50 µl 預冷(-20℃) absolute ethanol (2.5 倍體積)並混合均勻，置於-20℃冰箱以沉澱 DNA。隔天在 4℃下以
13,000 rpm 離心 20 分鐘，倒掉上清液後直接晾乾或以 70% ethanol 再清洗一次，
最後再以 20 µl 預熱(65℃)之無菌水回溶，保存在-20℃冰箱備用。
3.探針濃度之定量
探針定量的標定方式，參考 (劉與張，2008) -植物細胞分子顯微技術中提 到的方法。準備兩個乾淨的塑膠培養皿，以酒精噴洗乾淨。剪取適當大小之轉 印用尼龍膜 (Hybond-N+ Membrane, Amersham Pharmacia Biotech)，置於塑膠培 養皿內，以鉛筆輕輕在膜上邊緣作記。將 5 ng/µl 濃度之 control DNA 以無菌水 稀釋使之濃度為 1000 pg/µl，再依序稀釋 10 倍(1 : 10、1 : 100 及 1 : 1000)，由 左而右、濃度由高到低依序取 1 µl 點漬到 membrane 上。將保存於-20℃中之探 針短暫 vortex 後離心，先取 1 µl 加入 9 µl 無菌水稀釋 10 倍(1:10)，再連續稀釋 10 倍 (1 : 100、1 : 1000、1 : 10000)，同樣由左而右、濃度高到低依序取 1 µl 點漬到 membrane，所有待測的探針均依此方式做連續稀釋並點漬於膜上。將 membrane 以 120,00 uJ/cm2進行 crosslink (UV stratalinker 1800)。以 buffer 1 (100 mM maleic acid, 150 mM NaCl, pH 7.5 )潤洗 membrane 數分鐘，再將 membrane 置換到 10 ml buffer 2 (1% Roche blocking reagent in buffer 1 ) 30 分鐘。接著加入 2 µl Anti-dig AP-conjugate (或 streptavidin AP-conjugate , 150 mU/ml 稀釋 1:5000) 到 buffer 2 作用 30 分鐘。待反應完成，將 membrane 置換到 wash buffer (10 ml buffer1+0.3% Tween20)清洗兩次，每次 15 分鐘。最終進行呈色反應，將 membrane 移至 10 ml buffer 3 (100 mM Tris-HCl,100 mM NaCl,50 mm MgCl2, pH 9.5 )，再 加入 100 µl NBT/BCIP，保持在黑暗環境並小心不要移動 membrane 以確保呈色 均勻，於 15 分鐘至 3 小時可見定量結果，觀察膜上圓點顏色深淺與 control DNA 作比較，檢查探針濃度及評估原位雜交反應所需加入的探針量。
4.螢光原位雜交
原位雜交係參考 (Schwarzacher and Heslop-Harrison, 2000)以及 (劉與張，
2008)所提到的方法。在進行雜交反應前，先將挑選過型態完整的染色體載玻片 置於 37℃烘箱至少 8 小時或於 65℃加熱板上加熱 30 分鐘。當染色體周圍細胞 質明顯時，將載玻片放入 0.01 M HCl 清洗 2 分鐘，加 100 µl 稀釋過的 pepsine 酵素溶液 (pepsine : 0.01M HCl 為 1 : 100)於蓋玻片(24 x 40 mm)上，將載玻片正 面朝下吸附蓋玻片，之後將玻片仍以正面朝下的方式倒置於染缸中，於 37℃反 應 5 - 10 分鐘。酵素作用完畢後以無菌水清洗 2 分鐘，再以 2x SSC 於振盪器中 清洗 2 次，每次 5 分鐘。以 70%、90%、100% ethanol 連續脫水各 3 分鐘，靜 待其自然乾燥即完成玻片之前處理。
配置 20 µl 雜交混合液 (4 µl 50% dextran sulphate, 10 µl 100% formamide, 2 µl 20 x SSC, 0.5 µl 10% SDS, 3.5 µl probe DNA)，於滾燙的沸水煮熱 10 分鐘，冰浴 5 - 10 分鐘。每一載玻片滴上 20 µl 雜交混合液，蓋上蓋玻片(24 x 32 mm)，隨即放 到 80℃加熱板上靜置 2 分 30 秒，再將載玻片以正面朝下方式置於染缸，將染 缸放在內含濕紙巾的保溫盒(潮濕容器)內於 37℃烘箱中進行雜合反應。
隔天將載玻片浸泡於 2x SSC，讓蓋玻片自然滑落，並於 2 x SSC 中震盪搖 動 2 次，每次 5 分鐘，再將玻片放入 42℃之 SF50 (50% formamide, 2 x SSC)溶 液中浸泡 3 次，每次 5 分鐘。接著以 2 x SSC 清洗 2 次，每次 5 分鐘，再置換 到 4T (4 x SSC, 0.5% Tween20 )溶液清洗 5 分鐘。加入 100 µl TNB (1% blocking reagent in 1 x TN, 10 x TN = 1 M Tris-HCl,1.5 M NaCl, pH 7.5 )溶液於蓋玻片(24 x 40 mm)上，將載玻片正面朝下吸附蓋玻片，倒放置於染缸內於 37℃潮濕容器 中作用至少 30 分鐘。後續的抗體抗原反應皆以此方式吸附蓋玻片。待作用完畢 浸泡 4T 溶液讓蓋玻片自然滑落，取出載玻片，滴上 100 µl 以 TNB 稀釋之 Avidin Texas-Red (Vector Laboratories)抗體溶液 (Texas-Red : TNB 為 1 : 800)，此過程 須避光處理，置於潮濕容器中 37℃下處理 1 小時。取出載玻片，以 4T 溶液清 洗 5 分鐘並讓蓋玻片自然滑落，再以 TNT (1 x TN ,0.5% Tween20)溶液清洗載玻
片 2 次，每次時間約 5 分鐘。接著再滴上 100 µl 以 TNB 稀釋之 Biotinlyed Anti-avidine (Vector Laboratories)抗體溶液(Anti-avidine : TNB 為 1 : 100)或 Sheep anti-digoxigenin-FITC (fluorescein isothiocyanate ,Vector Laboratories)抗體溶液
片 2 次，每次時間約 5 分鐘。接著再滴上 100 µl 以 TNB 稀釋之 Biotinlyed Anti-avidine (Vector Laboratories)抗體溶液(Anti-avidine : TNB 為 1 : 100)或 Sheep anti-digoxigenin-FITC (fluorescein isothiocyanate ,Vector Laboratories)抗體溶液