箭頭所指的地方，可以觀察到姬蝴蝶蘭單離的染色體短臂上，末端有一處染 色較深，且尚未完全收縮進來的區域，此處即為次級收縮區所在。觀察該染色

體的型態，發現與細胞中第 13 對染色體相當接近。因此觀察次級收縮區(衛星 染色體)的有無，可作為染色體識別的重要標誌。

5. 染色體收縮程度的差異

為比較姬蝴蝶蘭中期與粗絲期染色體收縮程度的差異，同時觀察有絲分裂 中期染色體的型態 (圖 5 )並測量染色體長度 (表 3)。(圖 5 A)的中期染色體圖，

經測量後得到染色體平均長度為 1.78 µm，染色體最大與最小相差約 2 倍。而 (圖 5 B)的染色體平均長度是 1.76 µm，兩個樣本細胞中平均長度大小非常相近，

與粗絲期染色體 (21.95 µm)相較下，平均長度相差約 12 倍，兩者最大的染色 體間相差約 13 倍。因此以粗絲期染色體建立核型，將可提高至少 12 倍以上的 基因或序列定位解析力。

(三) 姬蝴蝶蘭螢光原位雜交與基因定位 1. 重複性序列的定位

核醣體 DNA 基因與端粒序列皆屬於縱向重複性序列，普遍分布在染色體 上特定的位置。將 45S rDNA 以 biotin-16-dUTP 及 digoxigenin-11-dUTP 標定探 針，以螢光原位雜交分別定位在姬蝴蝶蘭粗絲期染色體上 (圖 6)，前者 (biotin) 以 Rodamin (紅色螢光)偵測，後者 (dig)以 FITC (綠色螢光)偵測。依據 (圖 6 ) 的結果，45S rDNA 於一對中等長度的染色體末端呈現明顯的訊號，而在 (圖 4)的單離染色體上曾觀察到次級收縮區，於 (圖 6 B、C)該染色體末端確實也 出現 45S rDNA 的訊號，顯示藉由 45S rDNA 的觀察，可判斷具有衛星體的染 色體。以阿拉伯芥型的端粒重複序列 (TTTAGGG)n 為探針進行螢光原位雜交，

觀察到單離染色體的端點上有微弱的訊號 (圖 6 D)。以雙標的螢光原位雜交同 時觀察這兩種序列的分佈 (圖 7 )，可發現到端粒序列的訊號大多位於染色體的 端點上，顯示姬蝴蝶蘭染色體的端粒是屬於阿拉伯芥型的端粒序列，而 45S rDNA 則出現在第 13 對染色體的末端。此外再將另一種核醣體基因 5S rDNA 定位在染色體上，螢光原位雜交的結果顯示，5S rDNA 於不同的細胞中皆出現 在一對長度較短的染色體上，且訊號皆分佈在染色體的末端 (圖 8 )，由 (圖 8 A) 內含 5S rDNA 染色體實際分析的數據指出，該染色體的平均長度將近 16 µm，

異染色質與真染色質分別約為 6.2 µm 以及 9.6 µm，以及依據染色體型態與異染 色質比率(40%)等型態與特徵皆與第 17 對染色體相似，比對 (圖 8 D)單離染色 體型態，共同之處皆在於，異染色質的分佈位置很靠近染色體的端點。

2.內含功能性基因獨特序列的定位

以螢光原位雜交技術將開花時間相關基因 SOC1 定位在染色體，發現於一 對染色體上出現明顯的訊號，該訊號的型式包含兩個明顯的點以及一個較微弱 的點，觀察細胞分裂中染色間期 (interphase)的細胞同樣也發現到一對訊號的分 佈 (圖 9 A)。另外在相異細胞中也觀察到其中一對染色體有出現 SOC1 基因的 訊號 (圖 9 B)，對照 李(2006) 對 SOC1 基因進行的序列分析，本實驗證實了 SOC1 在姬蝴蝶蘭中確實為單一拷貝的基因序列；另外於相異細胞單離的染色 體上，同樣偵測到 SOC1 基因的訊號，而訊號的型式包含一個極為明顯的點以 及兩個相對較微弱的點 (圖 10 A)，以影像軟體編輯加強染色質的對比 (圖 10 B) 並對染色體進行分析，發現該染色體長度約為 25.25 µm，異染色質與真染色質 大小分別為 8.58 µm 與 16.67 µm，其異染色質占了染色體總長的 34%，臂比約 為 1.4，SOC1 基因位於染色體短臂的真染色質上，距離短臂末端約 5.16 µm，

無論染色體型態與統計數據比對的結果發現最接近第 1 對染色體。

(四) 姬蝴蝶蘭結合分子標誌高解析核型

綜合不同細胞染色體型態的觀察、長度的測量、異染色質的大小與分佈位 置、臂比的計算以及整合螢光原位雜交訊號的結果(其中 CMT 與 EFS 基因的位 置係分別參考林 (2012) 以及周 (2012) 所分析的結果)，手繪出姬蝴蝶蘭核型 之模式圖 (ideogram) (圖 11)，建構姬蝴蝶蘭完整的核型分析。根據這些結果，

針對每一對染色體的特徵分別描述如下：

第 1 對染色體：屬於次中位中節染色體，平均長度為所有染色體中最大，中央 有一段極長的異染色質，約占染色體總長的 1 / 3，大多分佈在

長臂上。短臂真染色質上有一個 SOC1 的基因。

第 2 對染色體：屬於中位中節染色體，異染色質較少，均勻分佈在中心節的兩 側，真染色質與異染色質的相對比例為所有染色體中最大。

第 3 對染色體：屬於中位中節染色體，異染色質均勻分佈在中心節兩側，短臂 的長度為所有染色體中最大。

第 4 對染色體：屬於次中位中節染色體，異染色質較多，主要分佈在長臂。

第 5 對染色體：屬於中位中節染色體，異染色質均勻分佈在中心節兩側，長短 臂的比例較均勻。

第 6 對染色體：屬於次中位中節染色體，短臂上僅含有極少量的異染色質，長 短臂相差約 2 倍，靠近長臂的末端有一個 CMT 基因(附圖 1)。

第 7 對染色體：屬於次中位中節染色體，中心節兩側異染色質較大。

第 8 對染色體：屬於次中位中節染色體，有較多的異染色質均勻分佈在中心節 兩側，異染色質平均長度約 8.5 µm，含量僅次於第 1 對染色體。

第 9 對染色體：屬於次中位中節染色體，異染色質均勻分佈在中心節兩側，臂 比相對較大。

第 10 對染色體：屬於次中位中節染色體，異染色質集中在短臂處，長短臂相差 約 2 倍，靠近長臂的末端有一個 EFS 的基因(附圖 2)。

第 11 對染色體：屬於次中位中節染色體，有較多的異染色質，主要分佈在長臂。

第 12 對染色體：屬於中位中節染色體，長短臂的分佈較均勻，異染色質於短臂 上的分佈量略多於長臂。

第 13 對染色體：屬於近端中節染色體，具有最大的臂比，中心節靠近短臂的端 點。異染色質的大小與短臂皆為所有染色體中最小。其中異染 色質的分佈位置相當靠近短臂，且在短臂末端有一 45S rDNA

的基因，為染色體次級收縮區所在的地方。

第 14 對染色體：屬於次中位中節染色體，異染色質相對較少，於長臂上的分佈 量略多於短臂，長短臂相差約 2.5 倍。

第 15 對染色體：屬於中位中節染色體，有較多的異染色質，主要分佈在長臂。

第 16 對染色體：屬於中位中節染色體，異染色質均勻分佈在中心節兩側，長短 臂的分佈最均勻，臂比為所有染色體中最小。

第 17 對染色體：屬於次中位中節染色體，異染色質的分佈位置相當靠近短臂，

長短臂的分佈比較不均勻，臂比相對較大，短臂末端有一 5S rDNA 的基因。

第 18 對染色體：屬於中位中節染色體，異染色質較多，但主要集中在長臂，短 臂上僅含有極少量的異染色質。

第 19 對染色體：屬於中位中節染色體，平均長度最小。真染色質與長臂皆為所 有染色體中最小，長短臂相差約 1.5 倍，真染色質與異染色質 的相對比例亦為所有染色體中最小，僅相差 1.1 倍。