第三部份:以整合素 integrin αvβ3 動態顯影磁振造影標靶影像偵測

4.1 研究方法與材料

整合素 integrin α^vβ³標靶顯影劑的製備

我們使用含有 16 羥基組的第三代(G3) 的 PEG 樹狀分子作為載體，使用第二 部分研究所描述的方法(W. T. Chen, Thirumalai et al., 2010)備製。接著，

PEG 樹狀分子表面的羥基組被用來跟 diethylenetriaminepentaacetate (DTPA) 結合。接著，部分 DTPA 終端胺基跟 c(RGDfK) (Peptides International Inc., Louisville, KY, USA)結合在一起，還有部分 DTPA 終端胺基與釓離子螯合。各 步驟詳述如下：

PEG-G3-(DTPA)m的製備

在氮氣環境下，DTPA [0.28 g, 40 當量 (eq)], HBTU(0.27 g, 40 eq)以及 HOBt(0.19 g, 80 eq)被溶解在 20ml 的二甲亞碸(DMSO)裡。此溶液在室溫(RT) 中被攪拌 24 個小時。PEG-G3-OH¹⁶ (0.1 g, 1 eq, 0.0178 mmol),

1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene (DBN) (0.07 ml, 16 eq)被溶解在 3ml 的 DMSO 裡，且攪拌 10 分鐘。此 DMSO 溶液被滴加在 PEG-G3-OH¹⁶的溶液裡，並且在 常溫下攪拌兩天。此溶液接著使用去離子水加以透析。游離的 DTPA 藉由 M.W.CO 1000 的薄膜用超濾法移除。接合於載體上的 DTPA 數量則是用螯合測定法來確 立。一個已知重量的樹狀分子產物被溶解在去離子水裡，接著加入銨緩衝液(pH 10)和 EBT 指示劑。此混和液以 0.1M 的氯化鈣溶液滴定直到此藍色溶液轉至橘色 溶液。

PEG-G3-(DTPA)m-n-(cRGD-DTPA)n的製備

PEG-G3-(DTPA)^m (130 mg, 0.01625 mmol)，hexafluorophosphate (HBTU) (154 mg, 25 eq)以及氫氧基苯(HOBt) (110 mg, 50 eq)被溶解在 20ml 的 DMSO，且在 室溫下攪拌一個小時。環狀(RGDfK) (25 mg, 2.5 eq)以及 N,N-二異丙基乙基胺

(DIPEA) (21 mg, 10 eq)被溶解在 30ml 的 DMSO 裡。環狀(RGDfK)溶液用滴加的 方式加入 PEG-G3-(DTPA)^m溶液裡，並在在氮氣下，在常溫下攪拌一整晚。溶液 接著用去離子水來透析，為了要移除過多的殘留物，使用離心層析管柱

(Centricon, Millipore Corp., Billerica, MA, USA)來過濾，目的要移除小分 子量的分子。除此之外，c(RADfK) (Peptides International Inc., Louisville, KY, USA)被用來生成 PEG-G3-(DTPA)^m-n-(cRAD-DTPA)ⁿ當做對比顯影劑，而其餘合 成步驟所使用的方法是一樣的。

PEG-G3-(Gd-DTPA)m-n-(cRGD-DTPA)n 的製備

PEG-G3-(DTPA)^m-n-(cRGD-DTPA)ⁿ (47 mg, 0.0053 mmol)被溶解在 5ml 的去離 子水裡。GdCl3 (0.097 M, 0.273 ml)被加在此溶液裡，並用 0.1N NaOH 將 pH 調整到 6.0~6.5 之間，接著攪拌三個小時。使用離心層析管柱將溶液裡的自由钆 離子和小分子量的分子過濾且移除，接著冷凍乾燥。

二甲酚橘在 pH5.8（醋酸緩衝液）的環境下，被用來確認自由钆離子已不存 在。游離的 DTPA 單位是藉由上述滴定方法來確立其並不存在於溶液中。接合上 的钆離子數量是藉由使用感應偶合電漿放光光譜儀(ICP-AES, S-35, Kontron, Germany)來做確認的動作。此合成物是用 0.45 µm 的超濾器來過濾，藉著就冷凍 乾燥。此外，有一些結合 cRGD 的樹狀分子在細胞吸附實驗裡，是用異硫氰酸鉀 螢光劑(FITC)來做標記。

T1 弛緩測量

裝載著钆的樹枝狀分子（0.2 - 1mmole）被測量它們改變水的弛豫率之能力，

乃在 37⁰C 利用核磁共振(NMR)光譜儀(20 MHz, 0.47 T) (MQ-20,

Brucker,Germany）而採反轉-回復的標準脈衝程式（TR 的範圍：0-300 毫秒）。 細胞實驗

根據過去文獻(Abdollahi, Griggs et al., 2005; Xiao, Yao et al., 2009)，

人類膠質母細胞瘤細胞 U87MG (ATCC, Manassas, VA, USA)被當成整合素 α^vβ³ 陽性細胞使用，而人類上皮癌細胞 KB (ATCC, Manassas, VA,USA)被當成整合素

α^vβ³陰性細胞使用。即時分析聚合脢鏈鎖反應(RT-PCR)以及免疫組織染色實驗 (immunohistochemistry, IHC)被用來評估細胞整合素 α^vβ³的表達。使用由 FITC 做標記結合 cRGD 的樹狀分子載體和 U87 MG, KB,和由 siRNA 處理過後的 U87 MG 細胞來進行細胞結合試驗。

整合素 α^V的即時分析聚合脢鏈鎖反應(integrin α^V RT-PCR)

藉由使用 Qiagen RNeasy kit(Qiagen, Hilden, Germany)，將 U87 MG 和 KB 細胞的總量 RNA 萃取出來，且 1μg 萃取的總量 RNA 也藉由 High-Capacity cDNA reverse Transcription Kit(Qiagen, Hilden, Germany)來進行反轉錄反應。由 20 ng 總量 RNA 而來的互補 DNA 被當成是模版。GAPDH 以及整合素 α^v mRNA 藉由 序列檢測系統儀器(RPISM 7000, Applied Biosystems)，使用 TagMan 基因表達 分析(Applied Biosystems)來進行量化。整合素 α^v的引體(primer)和探針 (probe)皆在 Applied Biosystems corporation（應用生物系統公司） (Assay ID:

Hs00233808_m1)這家公司所購買而得。

免疫組織化學染色

在使用 100％的乙醇而固定 U87 MG 細胞之後，使用小鼠抗人類整合素 α^vβ³ 單株抗體(LM609, 1:50 dilution, Millipore Corp., Billerica, MA, USA)來 執行免疫組織化學染色，而此法次級抗體為山羊抗小鼠次級抗體(NEF823, 1:250 dilution, PerkinElmer, MA,USA)。染色的過程是用修正後的 ABC 免疫組織化學 方法(PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)來執行。

最後是用二氨基(DAB)來做呈色，且用蘇木色素(Vector laboratories)來進行對 比染色。對照組切片的處理方式是一樣的，但是用非特異性同型免疫球蛋白 (Vector Laboratories)來取代單株抗體，而非使用 LM609。

為了將 KB 細胞移植腫瘤進行冷凍切片，腫瘤會被解剖且對半切割，用 Tissue-Tek (Sakura)將組織包埋，並用液態氮將組織冷凍起來。腫瘤的試片是 用 Reichert-Jung Frigocut 2700 的切片機(Leica)將其切割（厚度 5μm），並 用甲醇/丙酮固定。這些試片接著使用 M.O.M. immunodetection kit (Vector

laboratories, Burlingame, CA, USA)阻隔，並用小鼠抗人類整合素 α^vβ³單株 抗體(LM609, 1:50 dilution, Millipore Corp., Billerica, MA, USA)來培養 兩個小時。接著用山羊抗鼠次級抗體(NEF823, 1:250 dilution, PerkinElmer, MA,USA)來培養 30 分鐘，如同上述，執行修正的 ABC 免疫組織化學方法(PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)。對比控制組冷凍切片的處理方 式是一樣的，但是用非特異性同型免疫球蛋白(Vector Laboratories)來培養，

而非使用 LM609。

細胞吸附實驗

在蓋玻片上培養 U87 MG 和 KB 細胞（5x10⁴細胞）一整晚。由 FITC 做標記，

結合 cRGD 的樹狀分子(2mM)被加到培養基裡兩個小時，接著這些細胞用 100%的 乙醇固定。 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，D8417, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA )被使用在細胞核染色上。這些試片是用螢光顯微鏡(Axioplan, Zeiss, Germany)來進行分析。藍色和綠色的通道是用來當做 DAPI 以及 FITC 螢 光的偵測，圖像採集是藉由使用 Axiovision 軟體(Zeiss)。

另外，也進行自由 cRGD 競爭實驗和整合素 α^v si-RNA 抑制的實驗。在加入由 FITC 標記的樹狀分子(2mM)前，兩百倍的 cRGD(400mM)被加入到培養基中，作為 整合素 α^vβ³的競爭者。在另一個環境裡，在細胞攝取研究之前，U87 MG 先用 整合素 α^v siRNA 處理 48 個小時，以抑制整合素 α^v的表達。整合素 α^v siRNA 是從 Ambion (AM_16708)購得。未處理的 U87 MG 細胞被當成是陽性對比組，由 亂序的整合素 α^vsiRNA (Ambion)處理過的 U87 MG 細胞被當成陰性對比組使用，

藉助 RT-PCR 被用來印證整合素 α^v被抑制表現的百分比。

動物準備、腫瘤模型的建立、以及實施抗血管新生藥物治療

所有的動物研究都由我們機構的動物實驗委員會(Institutional Animal Care Committee)所批准。使用麻醉機（VIP3000，Midmark，凡爾賽，俄亥俄，

美國）提供異氟醚吸入用於老鼠麻醉，我們輸送了 1％異氟醚給維持麻醉和 5％

異氟醚以誘導麻醉。二氧化碳吸入被用於安樂死。 Athymid nude mice 雄性老

鼠，（國家動物中心，台北，台灣），重量 17-24 克（平均體重 22.5 克），8 週大，

完全按照政府指引處理。

為了要在腫瘤血管生成的過程裡，評估跟腫瘤血管新生有關的整合素 α^vβ³ 表達，整合素 α^vβ³陰性 KB 細胞被使用來發展異種移植腫瘤模型。為了誘導實 體腫瘤，1x10⁶KB 細胞被注射到 24 隻 nude mice 小鼠的右腰部脂肪墊的皮下組織 裡。在植入的 24 到 35 日之間，每隻小鼠都發展出 12±6 mm 的右側皮下腫瘤。

抗血管新生藥物治療藥物包括經靜脈注射抗整合素 α^vβ³ 單株抗體 LM609(25μ g/mouse)，以及腹腔內注射抗 VEGF 單株抗體 bevacizumab (5mg/Kg)。

動物的實驗組

長有 KB 腫瘤的小鼠被分為 4 個組別：也就是 PEG-G3-(Gd-DTPA)^m-n-(cRGD-DTPA)ⁿ注射組(n=12)，

PEG-G3-(Gd-DTPA)^m-n-(cRAD-DTPA)ⁿ注射組(n=12)，

抗整合素 α^vβ³MAb(LM609, Millipore, Billerica, MA, USA)治療組(n=3)，以 及抗 VEGF MAb (bevacizumab, Roche, South San Francisco, CA, USA) 治療 組(n=4)。在 PEG-G3-(Gd-DTPA)^m-n-(cRGD-DTPA)ⁿ和

PEG-G3-(Gd-DTPA)^m-n-(cRAD-DTPA)ⁿ注射組裡，我們意圖在同一隻小鼠注射兩種 顯影劑，為的是要避免不同對象的測量偏差(inter-subject biases)。然而，由 於在 MRI 檢查時動物的移動，或是靜脈注射的失敗，只有六隻小鼠在動態顯影磁 振造影的研究裡，短時間內前後接受了 cRGD-和 cRAD-標靶顯影劑的注射。

在 LM609 處理組裡，在處理的前一天，治療前的動態顯影磁振造影已被執行，

隔天，小鼠就從眼球後靜脈叢裡(25μg/mouse)接收靜脈 LM609 的注射。最後它 們在 LM609 的注射兩個小時候，接受動態顯影磁振造影檢測。

在 bevacizumab 處理組裡，在執行動態顯影磁振造影成像研究後，小鼠在同 一天接受 bevacizumab 的腹腔注射（5mg/Kg）。在 bevacizumab 處理後的第三日 和第六日，小鼠接受治療後的動態顯影磁振造影檢測。第二劑的

bevacizumab(5mg/Kg, IP)在治療後的動態顯影磁振造影檢測後的第三天被注

射。選擇一隻小鼠在開始處理的第七天後被犧牲，且切除腫瘤實施抗整合素 α^vβ³免疫組織化學染色以觀察整合素 α^vβ³的表現。其餘小鼠繼續養殖觀察腫 瘤體積變化，體積計算公式為體積=π/6x 長度 X 寬度 X 高度，另有 6 隻長有腫 瘤的裸鼠接受的是腹腔生理食鹽水注射作為對照組。

動態顯影磁振造影

老鼠的磁共振影像是用 1.5 T 超導系統（Powertrak 6000;飛利浦，Best，荷 蘭）所作。使用了 C4 的表面線圈。獲取定位磁共振圖像後，梯度回波的 T2-加 權冠狀磁共振圖像（TR/TE = 50/20，翻轉角= 30，層片厚度/間隙= 2/0.2mm，

FOV(視野）12 厘米，NEX = 2）被進行以顯示右側翼腫瘤的範圍。橫切面動態顯 影的磁共振圖像則以 2 毫米的切片厚度以及透過右側腫瘤中心的 12 厘米的 FOV(視野)而獲得。使用 TR/TE= 188/3.4，NEX = 1，翻轉角 80 °，179 × 256 探測矩陣的 T1-加權傾斜式回波序列（快速場回波;飛利浦）。在 30 分鐘內老鼠 總共獲得了 50 個動態影像。PEG-G3-(Gd-DTPA)^m-n-(cRGD-DTPA)ⁿ或是

PEG-G3-(Gd-DTPA)^m-n-(cRAD-DTPA)ⁿ樹狀分子（0.1 mmole/Kg）（200ul）藉由 31 號針頭以人工給藥，其在 MR 研究前置於老鼠的眼球後靜脈叢並藉由聚乙烯管（聚 乙烯 PE- 10，Becton. Dickinson and Co.,USA）連接到 300ul 注射器。顯影劑 注射前，該動態顯影增強的磁共振造像已開始，並開始在不同的時間間隔掃描，

總共觀察 30 分鐘。觀察時間間隔為：10 秒（0-3 分鐘），30 秒（3-10 分鐘），1 分鐘（10-30 分鐘）。

資料分析

信號強度值在操作員-定義的關注區域（ROIs ,regions of interest）測量。

該 ROIs 由一名研究員，（W.T.C.）輔以游標和圖形顯示設備而佈排並透過右側邊 腫瘤中心於橫切面圖像上，包含整個腫瘤面積，然後測量 KB 腫瘤的信號強度。

源於該關注區域的信號強度值由一個軟體系統（Extended MR WorkSpace;

Philips, Best, Netherlands）對時間繪製而成為時間-訊號強度曲線

（time-intensity curve,TIC）。時間-訊號強度曲線上的信號強度基準值（SI^base）

被定義為頭兩個圖像的平均信號強度。顯影劑注射後觀察時間-訊號強度曲線上 的三個不同階段。早期動脈階段(arterial phase)代表顯影劑進入首次病灶。實 質階段(parenchymal phase)代表顯影材料滲透到病體組織間隙的時段。遲滯階 段(delayed phase)可觀察到實質階段後的顯影劑滯留時間。最大信號強度，

（SI^max），被定義為在器質階段的峰頂增強值。 SI^30min被定義為注射顯影劑 30 分 鐘後所測得的信號強度。顯影增強的上升時間，（T^rise），被定義為 SI^base和 SI^max 之間的時間。顯影的流出時間，（T^washout），被定義為 SI^max和 SI^30min 之間的時間。

時間-訊號強度曲線模式

時間-訊號強度曲線模式