3.1 研究方法與材料 顯影劑
此標靶顯影劑載體為線性聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)，分子量約為 4000。載體終端具有十六個樹枝狀分子枝節，以羥基的作為功能基以便日後接合 分子探針與各類顯影劑。此載體之製作根據擴散合成方法於線性聚乙二醇兩端產 生(Ihre, Padilla De Jesus et al., 2001)一到三產代 2,2 -雙（羥甲基）丙 酸之鏈接物。過程包括酸酐-耦合步驟和隨後的脫氫一序列的反應，此步驟被重 複直到該載體具有 16 個羥基的 G3 代樹枝狀功能性群組並結晶被獲取。接著，出 現在該樹枝狀結晶表面的羥基功能基被用來結合葉酸（平均數=5），以及二乙烯 三胺五乙酸五鈉(diethylenetriaminepentaacetate，DTPA)（平均數=11）。最後，
該 DTPA 終端與钆離子(Gadolinium)（圖 22）產生嵌合(chelation)以產生葉酸 接受體標靶顯影劑。詳細步驟敘述如下：
備製亞芐基保護的聚乙二醇-樹枝狀結晶的 G1 產代[PEG-bis[G-1]-(O2Bn)]
聚乙二醇 PEG (MW 4000 Da, 9.2 克, 2.3 m 莫耳, 1 當量) 及 4 -二甲氨基吡啶
（4-dimethylamiopryidine， DMAP）(0.1670 克, 0.39 m 莫耳)被放置在一個 氮氣環境下的 R.B.燒瓶，並加入 25 毫升的二氯甲烷以溶解該混合物。溶於二氯 甲 烷 （ 25 毫 升 ） 的 Benzylidene-2, 2-bis (oxymethyl) propionic (BOP) anhydride （4.27 克，10 mmol）被滴加到上述溶液中。將該反應的混合物於室 溫下攪拌一整夜。第二日添加甲醇（10 毫升）以淬取剩餘的酸酐並將該反應混 合物另再攪拌 6 小時。該反應混合物倒入劇烈攪拌後的剩餘乙醚（700 毫升）。 將分離出的過濾和乾燥成白色粉末（收成率：95％）。紅外線光譜儀（RX - 1，
PerKin Elmer，美國）和 1H NMR (MQ-20,Brucker，德國）被用來剖析該合成品 的特性。
備製 PEG-樹枝狀分子的 G1 產代[PEG-bis[G-1]-(OH)2]
具保護的 PEG-bis[G-1]-(O2Bn) (11.8 克）被溶解在二氯甲烷基和甲醇（1:2）
的混合物中。添加 1.18 克的鈀 /炭(Pd / C)到燒瓶中並在氫氣下攪拌該混合物 一夜。藉由小的矽藻土慮片濾掉鈀 /炭(Pd / C)，並將濾液倒入乙醚（600 毫升）。 將該濕性白色粉末迅速濾離並在真空中乾燥（收成率：90％）。
備製亞芐基-保護的聚乙二醇-樹枝狀分子的 G2 產代 [PEG-bis[G-2]-(O2Bn)2]
第二產代也如上所述備製。PEG-bis[G-1]-(OH)2 (9.56 克, 0.83 m 莫耳, 1 當 量)和 DMAP（0.326 克，2.6 m 莫耳，3.2 當量）溶解在 25 毫升的二氯甲烷，且 滴加 DCM（50 毫升）中的 BOP-酸酐溶液（5.69 克，13.3 m 莫耳，16 當量）而攪 拌一夜。剩餘的酸酐藉由添加甲醇（15 毫升）予以淬取，則混合物會沉澱在乙 醚中。分離的白色沉澱物予以過濾並在真空中乾燥（收成率：80％）。
備製 PEG -樹枝狀分子的 G2 產代[PEG-bis[G-2]-(OH)4]
PEG-bis[G-2]-(O2Bn)2（5.5 克）複合物的脫去是進行於將之溶解在 DCM 和甲醇
（60 毫升）的 1:2 混合物並在室溫於氫氣中攪拌 Pd / C 24 小時。該反應混合 物藉由矽藻土墊片過濾。白色濕性粉末可於乙醚濾液（1 升）沉澱後獲得之（收 成率：88％）。
備製 PEG-bis[G-3]-(O2Bn)4
該芐基-保護的樹枝狀分子第三產代的備製是在室溫的二氯甲烷（100 毫升）中 攪拌 PEG-bis[G-2]-(OH)4 (2.88 克, 0.40 m 莫耳, 1 當量.)，DMAP（0.3151 克，2.57 m 莫耳，6.4 當量。）和 BOP-酸酐（5.48 克，12.8 m 莫耳，32 當量）
混合物 24 小時。產物則如 G2 情形予以分離和乾燥（收成率：89％）。 備製 PEG-樹枝狀分子的 G3 產代 [PEG-bis[G-3]-(OH)8]
該樹枝狀分子的芐基-保護的第三產代則以 PEG-bis[G-3]-(O2Bn)4 (4 克)溶於 1:2 的 DCM：甲醇（60 毫升）混合物，並加入鈀 /炭（Pd /C 0.40 克）。該懸浮 液在氫氣環境下攪拌 24 小時，如其他產代所述的作為產出了白色粉末的樹枝狀 結晶（收成率：76％）。
備製 PEG-G3-(folate)m
葉酸（13.76 毫克，5.76 m 莫耳）和二環己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide, DCC）的混合物（1.07 毫克，5.19 m 莫耳），在二甲基亞砜（DMSO）（20 毫升）
中於 500C 攪拌一夜。然後，加入[PEG-bis[G-3]-(OH)8]樹枝狀分子（2.04 克，
0.36m 莫耳）。由此產生的混合物在 60℃攪拌 24 小時以生成的樹枝狀分子-葉酸 結合物。游離的葉酸以 M.W.CO 1000 膜的超濾器(ultrafiltration)予以去除。
該反應物的收成率為 35％（0.97 克，0.126m 莫耳）。葉酸含量則以 UV-Vis(紫 外-可見光) 吸收的光譜儀(Libra S22, Biochrom,美國）定其特性。
備製 PEG-G3-(folate)m-(DTPA)n
該葉酸所結合的 G3 樹枝狀分子（0.73 克，0.0945 m 莫耳）則在室溫下與 DTPA 單元，於三乙胺（0.515 毫升）之中用二甲基亞砜（20 毫升）為溶劑附著在 DTPA-monoanhydride (1.56 克, 4.15 m 莫耳) 的表面 24 小時。游離的 DTPA 單 元以 M.W.CO 1000 膜的超濾器予以去除。該反應物的收成率為 80％（0.895 克，
0.075m 莫耳）。
DTPA 群組的內容是由一種螯合滴定法所確定。一個已知重量的樹枝狀結晶溶解 在去離子水，並加入銨緩衝液（pH 10）之後再滴一種鉻的 Black - T 指示劑。
這種混合物被對 0.1 M 的氯化鈣溶液而滴定，直至藍色變成橙紅色。
備製 PEG-G3-(folate)m-(Gd-DTPA)n
該 DPTA-終端的樹枝狀分子與钆的複合物的合成，其進行方式為加入必要等效的 钆鹽(GdCl3.6H2O)（0.29 克，0.783m 莫耳）到溶解於脫鈣水的樹枝狀結晶（0.785 克，0.0661 m 莫耳），並使用 1N 的氫氧化鈉(NaOH)溶液調整 pH 值在 6.0-6.5 之 間。以 M.W.CO 1000 膜的超濾器予以去除。該反應物的收成率為 95％（0.86 克，
0.063m 莫耳）。
游離的钆離子是否消失之測試是用 pH 5.8（醋酸緩衝液）的二甲酚橙色指示劑 進行。未被螯合的 DPTA 單元是否消失之證實乃以該滴定法其用來確定存於樹枝 狀分子的 DPTA 單元數目。钆離子的摻雜數目是以實驗測定其採用電感性耦合的
電漿-原子發射光譜儀(ICP-AES, S-35, Kontron,，德國）。該複合物被用 0.45um 的過濾器過濾後並冷凍乾燥。
T1 弛豫率之測量
裝載著钆的樹枝狀分子（0.2 - 1m 莫耳）被測量它們改變水的弛豫率之能力，
乃在 370C 利用核磁共振(NMR)光譜儀(20 MHz, 0.47 T) (MQ-20, Brucker,德國）
而採反轉-回復的標準脈衝程式（TR 的範圍：0-300 毫秒）。
PEG-G3-(Gd-DTPA)11-(folate)5 的樹枝狀結晶分子重量是 12556。此外，一些樹 枝狀分子在 Gd - DTPA 和葉酸結合前被以熒光異硫氰酸酯（Fluorescein isothiocyanate，FITC）作標記以進行細胞攝取實驗。
細胞實驗
根據文獻(C. C. Wu, Lee et al., 1994)，人類上皮細胞癌 KB 細胞(CCL-17,ATCC, Manassas, VA)為大量表現葉酸接受體的細胞而人類纖維肉瘤 HT - 1080 細胞 (CCL-121,ATCC, Manassas, VA)為不表現葉酸接受體的細胞。本研究進行了即時 -聚合酶鏈反應（RT - PCR 法）和免疫組織化學以顯示細胞葉酸接受體的顯現水 平，且進行 FITC 標記的樹枝狀分子之細胞攝取試驗以 KB 和 HT - 1080 細胞進行 測試。
RT-PCR
以 Qiagen 公司 RNeasy 試劑盒（Qiagen 公司，希爾登，德國）從 KB 和 HT–1080 細胞提取總 RNA，並將提取的總 RNA 取 1 微克使用高容量(High-Capacity)的 cDNA 反轉錄試劑組（reverse Transcription Kits 應用生物系統公司，福斯特 市，加州，美國）施行逆轉錄反應。取用 20 奈克總 RNA 的互補 DNA 被作為模板，
GAPDH 和葉酸接受體 mRNA 之定量使用 TagMan 基因顯現檢測（TagMan Gene Expression Assay,應用生物系統公司）以序列檢測儀器（Sequence Detection System instrument RPISM 7000，應用生物系統公司）計算產生。 該葉酸接受 體引體和探針的 DNA 序列的是：TGGANCAGAGCTGGCG，反向引體：
ACCCAGCCCAGGGCAA，探針：CCCTGTGCAAAGAG。
免疫組織化學染色
使用100％乙醇將KB和HT-1080細胞凝固後，使用鼠類-抗人類-單株抗體
（ab3361，1:50稀釋，Abcam，劍橋，英國）進行免疫組織化學染色，以biotin 化的羊-抗鼠-二次抗體（NEF823，1:250稀釋，珀金埃爾默，MA，美國）顯現之。
染色程序則以修改的avidin-biotin-peroxidase complex technique（PK - 6100，Vector Laboratories向量實驗室，柏寧頓，加州，美國）進行。以二氨 基聯苯胺(diaminobenzidine , DAB)予以呈色並以蘇木（hematoxylin）(Vector Laboratories）加以對比染色。控制組部分進行完全相同的處理，但採用具有非 特異性免疫球蛋白的同型抗體（Vector Laboratories）。
FITC標記的樹枝狀分子的細胞攝取實驗
將KB和HT-1080細胞(5x104 )分別培養於蓋玻片一夜。 FITC標記的樹枝狀結 晶（2毫莫耳濃度）加入培養液中2小時，然後用100％乙醇將細胞固定。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)（D8417，Sigma - Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州，美國）被用於細胞核染色。切片使用螢光 顯微鏡分析（Axioplan，蔡司，德國）。藍色和綠色通道被用於DAPI和FITC的螢 光檢測， Axiovision軟體（蔡司）則用於圖像數位採樣。.
游離葉酸的競爭試驗和 FR siRNA 的抑制實驗
在細胞攝取實驗中，加入 FITC 標記的樹枝狀分子（2 毫米）前，一組多加的 200 倍游離葉酸（400 mM）被添加到培養液中作為葉酸接受體顯影劑的競爭對手。
在另一組設定中，KB 細胞在做細胞攝取研究 48 小時前先被 FR siRNA 處理，以 抑制 KB 細胞的葉酸接受體表現。FR- siRNA 購自 Ambion 公司（NM_016724）。經 亂序處理的 FR siRNA 處理的 KB 細胞被用於對照組。RT-PCR 被用於驗證 FR 抑制 是否成功。 然後 FR siRNA 處理過的 KB 細胞，經亂序處理的 FR siRNA 處理過的 KB 細胞和正常的 KB 細胞，被用於 FITC 標記的葉酸接受體標靶顯影劑之細胞攝 取研究。
動物的準備及腫瘤模型
所有的動物研究都由我們機構的動物實驗委員會(Institutional Animal Care Committee)所批准。使用麻醉機（VIP3000，Midmark，凡爾賽，俄亥俄，
美國）老鼠麻醉使用異氟醚(isoflurane)吸入方法，我們使用5％異氟醚以誘導 麻醉和1％異氟醚以維持麻醉。二氧化碳吸入被用於安樂死。
Non-obese-diabetic severe combined immunodeficiency (NOD–SCID) 雄性老 鼠，（國立台灣大學動物中心，台北，台灣），重量 18-24克（平均體重二十一點 二克），8週大，完全按照政府指引處理飼養。
為了誘發腫瘤的產生，1x106 的KB和HT-1080細胞被皮下注射到相同老鼠的雙 邊側翼，（KB：右翼，HT-1080：左翼），在30隻老鼠中。在植入後的20-30天，每 隻老鼠雙邊側翼長出12 ± 5毫米大小的腫瘤。老鼠雙邊側翼有可見的腫瘤後，被 餵食了無葉酸的飼料（TestDiet，Richmond, IN,美國）。
磁振造影影像
老鼠的磁振造影影像是用 1.5 - T 超導系統（Powertrak 6000;飛利浦，Best，
荷蘭）所作。使用了 C4 的表面線圈。獲取定位圖像後，梯度回波的 T2-加權冠 狀磁共振圖像（TR/TE = 50/20，翻轉角= 30，層片厚度/間隙= 2/0.2mm，FOV(視 野）12 厘米，NEX = 2）被進行以顯示雙邊側翼腫瘤的範圍，（KB 腫瘤在右側翼 而 HT - 1080 腫瘤在左側翼）。橫切面動態顯影的磁共振圖像則以 2 毫米的切片 厚度以及一個透過雙側腫瘤中心的 12 厘米的 FOV(視野)而獲得。 使用 TR / TE=
188/3.4，NEX = 1，翻轉角 80 °，179 × 256 探測矩陣的 T1-加權梯度回波序列
（FFE;飛利浦）。在 30 分鐘內自各老鼠總共獲得了 50 個動態影像。 PEG- (Gd-DTPA)11-(folate)5（200ul，0.1 m 莫耳/每公斤）藉由 31 號針頭以人工給 藥，留置針在 MR 研究前置於老鼠的眼球後靜脈叢並藉由聚乙烯管（PE- 10，Becton.
Dickinson and Co.,USA）連接到 300ul 注射器。顯影劑注射前，該動態顯影增 強的磁共振造像已開始，並開始在不同的時間間隔掃描總共觀察 30 分鐘，影像 間隔時間為：10 秒（0-3 分鐘），30 秒（3-10 分鐘），1 分鐘（10-30 分鐘）。
雙側帶有KB和HT-1080腫瘤的30隻老鼠被分為三組。第1組（n = 18），被注射 了(Gd-DTPA)11-(folate)5-PEG（2 mmole /mouse）。第2組（n = 6），接受無葉酸 結合物的(Gd-DTPA)11-PEG（2 mmole /mouse）。第3組（n = 6），被注射了200倍 游離葉酸（400 mmole /mouse）和(Gd-DTPA)11-(folate)5-PEG（2 mmole /mouse）
的混合物。
數據分析
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