運用動態顯影磁振造影於臨床與基礎研究:鑑別脊椎病理性骨折、實施腫瘤分子標靶影像並早期評估抗血管新生藥物治療之反應

國立臺灣大學臨床醫學研究所 博士論文

Graduate Institute of Clinical Medicine College of Medicine

National Taiwan University Doctoral Dissertation

運用動態顯影磁振造影於臨床與基礎研究:鑑別脊 椎病理性骨折、實施腫瘤分子標靶影像並早期評估

抗血管新生藥物治療之反應

Dynamic contrast enhanced MRI in clinical and basic researches: differentiating vertebral pathologic fracture, tumor targeting molecular imaging, and early assessment of

anti-angiogenic treatment response

陳慰宗 Wei-Tsung Chen

指導教授﹕施庭芳 教授，楊泮池 教授

Professor Ting-Fang Shih & Professor Pan-Chyr Yang 中華民國 一百 年 七 月

July 2011

誌謝

選擇走分子影像基礎研究實在是一條孤單的路。在這路上我有許多需要感謝 的人。謝謝我的妻子余月華，全心照顧家務使我沒有後顧之憂，我實在花太少時 間與妳和我們的女兒加恩相處了。感謝我父母的栽培，母親永遠不變的關心。我 要感謝施庭芳教授給我研究全力的支援與指導，楊泮池教授每在關鍵時刻畫龍點 睛的評論使研究抓住了重點，感謝論文指導委員們不吝熱心的指正，使我在研究 過程學習到以各種角度來觀看問題。我要謝謝賴明陽所長，陳培哲所長與高嘉宏 所長及所裏的師長們，因著您們平日的教誨，使我從一個做研究的門外漢如今而 能略有能力對於基礎醫學研究與實驗方法一窺究竟。謝謝我科裏的長官與同事平 日對我的支持與諒解。謝謝我的歷任研究助理予佑，裕惠，津君，其達，因著你 (妳)們的幫忙才能使一位繁忙的放射科醫師進行基礎醫學研究成為可能。我是一 位基督徒，末了我要感謝神，祂在愛裏為我所預備的道路遠遠超過當初我自己所 規劃的，使我懂得謙卑，學會感恩。最後我以一段聖經的話結束這段感謝:

詩篇 36 篇 9 節:「因為在你那裡有生命的源頭；在你的光中，我們必得見光。」

中文摘要

本論文分為臨床研究與基礎研究兩部分，以動態顯影磁振造影為切入點，在臨 床研究方面，我們利用動態顯影磁振造影具有偵病灶血管新生並顯示組織內血液 灌流現象的能力，找出良性與病理性脊椎壓迫性骨折病灶中骨髓血液灌流模式的 差別，此發現對於某些困難診斷的脊椎壓迫性骨折提供了一個有效的解決方法。

這在患者沒有惡性腫瘤的病史情形下尤其重要，因我們若是將病理性脊椎壓迫性 骨折誤診為良性骨折，將延誤治療時機，增加日後治療的困難度。

在此研究過程中，我們同時發現並證實了脊椎骨髓血液灌流生理現象與老 化的關係:年齡越大、其骨髓血液灌流的程度就越低，且脊椎骨髓血液灌流在女 性隨年齡下降的更快。因著上述發現，我們又推想骨髓血液灌流的程度多寡會不 會與動脈硬化的程度有關? 在一個 43 對性別年齡配對研究中,我們將性別和年 齡這兩個重要的干擾因子控制住，證實了內頸靜脈內膜厚度越大，脊椎骨髓血液 灌流就越少。另外我們也同時提出了脊椎骨髓內脂肪水分比例與脊椎骨髓血液灌 流具有負相關性的證據。這一系列發現使我們懷疑骨髓血液灌流與老年人的大 敵”骨質疏鬆”是否有關聯。事實上，在指導教授施教授後續的研究中，也證實 了女性骨髓血液灌流越低，其骨質密度也越低。故將來在討論骨質疏鬆的機轉 時，組織缺血也可能是一重要影響因子。

在基礎研究方面，我們利用動態顯影磁振造影配合標靶顯影劑來偵測組織或 病灶內特殊分子標記的表現。在實驗中我們先成功將多個葉酸以及磁振造影 T1 顯影劑 Gd-DTPA 接合在以聚二乙醇為主幹的分子載體上，使其成為可在生物體內 尋找葉酸接受體的磁振標靶顯影劑，並以動態顯影磁振造影觀察到此顯影劑如何 流進與流出在表現葉酸接受體腫瘤內的情形，並和不表現葉酸接受體之腫瘤做對 照。這個研究證明了使用大分子載體接合傳統磁振造影顯影劑與一些對腫瘤標記 有高親和力的分子探針來從事磁振造影標靶影像的可行性。這種方法不僅讓本來 無特異性的磁振造影顯影劑在體內增加了尋找腫瘤標記的能力，同時因一個分子 載體上接合了多個 Gd-DTPA，而同時達到將磁振造影訊號放大的目的，因而可提

高磁振造影的敏感度。一般 Gd-DTPA 的Ｔ1 鬆弛度為 2.9(mM S)-1，此葉酸接受 體標靶顯影劑的Ｔ1 鬆弛度為 53.2(mM S)-1，此標靶顯影劑之顯影能力比傳統 磁振造影顯影劑多了 18.3 倍。

在論文第三部份：以動態顯影整合素 integrin αvβ3 標靶磁振造影影像 偵測腫瘤血管新生並早期評估抗血管新生藥物治療後之反應。我們也再次證實了 這個概念，並將其推廣到早期評估抗血管新生藥物治療療效。在本論文的第一部 分我們證實了動態顯影磁振造影具有偵測病灶血管新生與分析其內血液灌流的 能力，但已達到目前傳統磁振造影能力的極限。在第二、三部分我們配合磁振標 靶顯影劑擴展了目前磁振造影的能力，不僅證明了接合上環狀 RGD 胜肽的分子載 體在細胞層級具有吸附表現整合素 integrin αvβ3 的 U87 細胞的能力；我們更 在活體影像中，以動態顯影磁振造影以及所產生的參數”三十分鐘顯影劑流失比 率”證實此分子探針會因著吸附在活化內皮細胞上的整合素 integrin αvβ3 而有較長的時間停留在有腫瘤血管新生的部位，而被磁振造影偵測出來。實驗中 所有腫瘤若使用此標靶顯影劑，其”三十分鐘顯影劑流失比率”皆為負值(但若 使用對照組接合環狀 RAD 胜肽的顯影劑此現象即消失)。 但是在腫瘤開始接受抗 血管新生標靶藥物治療的實驗後，（包括使用 anti-integrinαvβ3 monoclonal Ab 及 anti-VEGF monoclonal Ab），即使使用環狀 RGD 胜肽的顯影劑，腫瘤的”

三十分鐘顯影劑流失比率”也變為正值，代表此標靶顯影劑在三十分鐘內就會從 腫瘤流失；而我們在十多天後才觀察到腫瘤體積開始縮小。本實驗結果證實了標 靶磁振造影加上動態顯影磁振造影所提供的”三十分鐘顯影劑流失比率”，不僅 可以用來確認病灶內有分子標記的表現，更可以在腫瘤大小發生改變以前得知腫 瘤已發生治療反應，這是目前影像醫學尚無法達到的。

總而言之，本論文一方面以動態顯影磁振造影在臨床分析病灶血管新生血液 灌流模式成功鑑別了病理性脊椎壓迫骨折與良性壓迫性骨折；一方面在基礎研究 以動態顯影磁振造影配合標靶顯影劑成功實施了葉酸接受體標靶影像和整合素 αvβ3 標靶影像並將其應用於早期評估抗血管新生藥物治療之反應，本研究之

發現對未來磁振造影分子影像與臨床癌症治療規劃決策將產生很大衝擊。

關鍵字: 動態顯影磁振造影，血液灌流，壓迫性骨折，分子影像，葉酸接受體，

血管新生，整合素αvβ3，抗血管新生治療，早期療效評估

Abstract

Clinical (part 1) and basic researches (part 2, 3) were included in this thesis. By using dynamic contrast enhanced (DCE) MRI, we first demonstrated its ability for revealing hemodynamic changes in vertebral compression fractures, and successfully differentiated pathologic form benign vertebral compression fracture by analyzing the blood perfusion patterns and parameters. We established an effective and easy way for the diagnosis of pathologic vertebral compression fracture in cases with equivocal conventional MR findings. This is valuable when the primary malignancy is not known by the patient or physicians. If the pathologic fractures are misdiagnosed, the proper treatment timing will be delayed.

We also found an interesting issue of the relationship between the vertebral blood perfusion status and aging process. We noticed that the older our patients, the lower the bone marrow blood perfusion degree, revealed by DCE MRI. To validate this finding, we analyzed DCE MRI data from 60 subjects with varied age in both genders, and found a significant negative correlation between vertebral marrow blood

perfusion and aging, this phenomenon was especially noticeable in female subjects.

According to above findings, we hypothesized that there might be a correlation between atherosclerosis and marrow blood perfusion. A sex- and age- matched study was proposed. We selected patients whose internal carotid artery intemal thickness was larger than 1mm from a database of 2245 patients who received carotid artery ultrasonography in our hospital, once a thick IMT subject was included in this study, another subject was selected with normal IMT from the same database under sex- and age matched policy. Totally 43 sex- an age- matched pairs were included in this study.

Out results showed a significant negative correlation between internal carotid intemal thickness and marrow blood perfusion.

We also noticed that the fatty marrow deposition progressed with aging process,

and hypothesized that the lipid ratio within bone marrow might have a correlation with marrow blood perfusion. MR spectroscopy was used to analyze MRS data from 50 female subjects to reveal the relationship between the marrow lipid water ratio and marrow blood perfusion, and a significant negative correlation between marrow blood perfusion and marrow lipid water ratio was proven.

In the clinical research portion, we first developed an easy and reliable method to differentiate pathologic vertebral compression fracture from osteoporotic fracture, by analyzing the blood perfusion patterns. Furthermore, we evaluated the vertebral marrow blood perfusion phenomenon with aging, atherosclerosis and marrow lipid water ratio, such relationships were not explored in the literature. Our results lead us to hypothesize that there is a link between marrow blood perfusion and osteoporosis, which is an important issue in aging medicine. In later studies, professor Shih

demonstrated that there is a positive correlation between bone mineral density and marrow blood perfusion. This finding implied that ‘ischemia’ might be an important factor related to osteoporosis.

In the basic research portion, the aim of our study was to use DCE MRI combine with receptor-targeted MRI contrast medium to detect molecular signatures in tumors.

We first successfully synthesized a folate conjugated, Gd-DTPA loaded polyethylene glycol (PEG) dendrimer, as a folate receptor (FR) targeted contrast medium. We observed hemodynamic changes of FR positive and FR negative tumors in living mouse DCE MR imaging. Our results showed that the conjugation of molecular ligand to a carrier loaded with Gd-DTPA is feasible for receptor targeted MR imaging.

This methodology not only turned a non-specific MR contrast medium into a receptor specific MR contrast agent, but also had the advantage of MR signal magnification, but adding multiple Gd-DTPA onto a dendrimer, hence, the sensitivity of this receptor contrast medium will increase. The T1 relaxicity of Gd-DTPA was 2.9(mM S)-1，

however, the T1 relaxicity of the FR targeted contrast medium was 53.2(mM S)-1, which was 18.3 fold higher.

In the third part of the thesis, we demonstrated that the cRGD conjugated contrast medium can attached to the cell surface of the integrin αvβ3 expressing U87 MG in cellular attachment experiments; we also showed the targeting ability of this integrin αvβ3 targeting contrast medium in living animals, by using DCE MRI. The 30-min contrast washout percentage derived form DCE MRI showed that the integrin αvβ3 targeting contrast medium stayed longer in sites of tumor angiogenesis. If we used cRAD conjugated contrast medium as a control drug, in stead of RGD domain, the persistent contrast enhancement phenomenon was disappeared. However, in the anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody or anti-VEGF monoclonal antibody studies, the persistent contrast enhancement phenomenon was disappeared, and a rapid

contrast washout pattern was observed rapidly following the anti-angiogenetic therapy, even before the tumor volume decreased, which was observed 10 days after the start of anti-angiogenetic therapy. We confirmed our hypothesis, i.e., receptor targeted MR imaging was achievable and can be used in early assessment of target therapy, even in advance to tumor size decrease. Such ability is beyond any present medical imaging modalities.

In conclusion, we have demonstrated the clinical application of DCE MRI for differentiating pathologic vertebral compression fracture. The ability of DCE MRI is reinforced by using receptor targeting MR contrast medium. We have not only demonstrated the ability of folate receptor and integrin αvβ3 targeting conjugates in

vitro and in vivo, but also showed its superior ability in the early assessment of

Keywords: dynamic contrast enhanced MRI, blood perfusion, compression fracture,

口試委員會審定書………i

誌謝 ………ii

中文摘要………iii

英文摘要 ………iv

目錄 ………x

第一章 緒論………1

1.1 第一部份:以動態顯影磁振造影研究良性與病理性脊椎壓迫性骨折病灶血管 新生血液灌流之差別 ………1

1.1.1 背景、文獻回顧、欲研究的問題及其重要性 ………1

1.1.2 欲研究的問題及其重要性 ………5

1.1.3 研究假說 ………6

1.1.4 研究目的 ………6

1.2 第二部份:以葉酸接受體動態顯影磁振造影標靶影像偵測具有葉酸接受體之 腫瘤 ………6

1.2.1 背景、文獻回顧 ………6

1.2.2 欲研究的問題及其重要性 ………12

1.2.3 研究的假說 ………13

1.2.4 研究的目的 ………13

1.3 第三部份:以整合素 integrin αvβ3 動態顯影磁振造影標靶影像偵測腫瘤 血管新生並早期評估抗血管新生藥物治療後之反應 ………13

1.3.1 背景、文獻回顧 ………13

1.3.2 欲研究的問題及其重要性 ………17

1.3.3 研究的假說 ………18

1.3.4 研究的目的 ………18

第二章 第一部份:以動態顯影磁振造鑑別良性與病理性脊椎壓迫性骨折 ………19

目 錄

2.1 研究方法與材料 ………19

2.2 結果 ………21

2.3 其他相關發現 ………22

2.3.1 以動態顯影磁振造研究脊椎血液灌流與年齡性別之關係 ………22

2.3.2 以動態顯影磁振造研究脊椎血液灌流與內頸動脈內膜厚度之關係 ……22

2.3.3 以動態顯影磁振造研究脊椎血液灌流與脊椎脂肪比例之關係 ………23

第三章 第二部份:以葉酸接受體動態顯影磁振造影標靶影像偵測具有葉酸接受 體之腫瘤 ………24

3.1 研究方法與材料 ………24

3.2 結果………31

第四章 第三部份:以整合素 integrin αvβ3 動態顯影磁振造影標靶影像偵測 腫瘤血管新生並早期評估抗血管新生藥物治療後之反應………35

4.1 研究方法與材料 ………35

4.2 結果 ………42

第五章 討論 ………46

第六章 展望 ………56

6.1 磁振造影目前的能力 ………56

6.2 利用動態顯影磁振造影我們可以分析病灶內血液灌流情形以助鑑別診斷 ………57

6.3 利用動態顯影磁振造影可以研究組織內血液灌流隨老化發生的生理現象 ………57

6.4 如何突破磁振造影目前能力的限制 ………58

6.5 分子影像將開啟影像醫學另一個里程碑 ………60

6.6 將對某分子標記有高親和力的物質和 Gd-DTPA 一起接合在分子載體上達到 磁振造影分子影像放大訊號的方式是可行的 ………62

6.7 分子載體的發展使未來標靶治療更有遠景 ………62

6.8 標靶磁振造影分子影像將對未來早期評估標靶治療療效造成衝擊 …62

6.9 未來發展方向………64

論文英文簡述(summary) ………67

參考文獻 ………95

圖 1 ………103

圖 2 ………103

圖 3 ………104

圖 4 ………104

圖 5 ………105

圖 6 ………105

圖 7 ………106

圖 8 ………107

圖 9 ………108

圖 10 ………109

圖 11 ………110

圖 12 ………110

圖 13 ………111

圖 14 ………111

圖 15 ………112

圖 16 ………113

圖 17 ………114

圖 18 ………114

圖 19 ………115

圖 20 ………115

圖 21 ………115

圖 22 ………116

圖 23 ………117

圖 24 ………117

圖 25 ………118

圖 26 ………119

圖 27 ………120

圖 28 ………121

圖 29 ………122

圖 30 ………123

圖 31 ………124

圖 32 ………125

圖 33 ………126

表 1 ………127

表 2 ………127

表 3 ………128

表 4 ………128

表 5 ………129

表 6 ………129

附錄：個人在碩博士班修業期間所發表之相關論文清冊 ………130

第一章 緒論

本論文分為三個部份，包含臨床研究(第一部份)與基礎研究(第二、三部份)兩方 面:

第一部份: 以動態顯影磁振造影研究良性與病理性脊椎壓迫性骨折病灶血管新 生血液灌流之差別

第二部份: 以動態顯影磁振造影葉酸接受體標靶影像偵測具有葉酸接受體之腫 瘤

第三部份: 以動態顯影磁振造影整合素 integrin α^vβ³標靶影像偵測腫瘤血管 新生並早期評估抗血管新生藥物治療後之反應

茲分述如下:

1.1 第一部份:以動態顯影磁振造影研究良性與病理性脊椎壓迫性骨折病灶血管 新生血液灌流之差別

1.1.1 背景、文獻回顧、欲研究的問題及其重要性

細胞生長所需的氧氣與營養是經由血液所供應，血管新生(angiogenesis)是 許多正常和病態過程的關鍵要素， Cell 雜誌在千禧年特輯內 “ The hallmarks of cancer”中將持續性血管新生(sustained angiogenesis)列為癌細胞六大基 本改變之一(Hanahan & Weinberg, 2000)(圖 1A)。 但血管新生並非只在惡性腫 瘤中才能觀察到，人類從胚胎階段就開始一連串有秩序有條理的血管新生以配合 各組織器官之發育增生，到了成人階段各種類型的血管新生過程仍持續發生 (如 在骨折癒合的過程中，新生血管量可高達平時的二十倍以上(如圖 1B)，其他如 女性月經週期及懷孕，傷口癒合及腫瘤生長等)。在許多良性腫瘤內(如血管瘤)，

或是在其他良性的血管新生(如骨折的癒合)，我們可見到豐富的血管新生，此與 惡性腫瘤之血管新生究竟有何不同?是很有興趣的課題。

隨著科技的進步，影像醫學日新月異，加上先進不倦的努力研究，吾人如今 可利用能量都卜勒超音波 (power Doppler ultrasound) 計算腫瘤內之血管係數 (vascularity index)，藉以有效地評估腫瘤血管新生的程度以及反應出惡性腫

瘤的侵襲力和轉移力。但是目前即使是最靈敏的能量都卜勒超音波，其解析力仍 未能看到腫瘤的新生血管以及供給或匯流小靜脈。至於腫瘤新生血管和其供給或 匯流血管之間的相互關係，亦即腫瘤組織內血液灌流(blood perfusion)的情 形，我們目前也不甚明瞭。

血管新生同時也會伴隨血流量增加，腫瘤內動靜脈分流，血液流過微血管床 (capillary bed)的時間會改變，然而組織內部因血管新生過程而產生的組織顯 微血流的動態變化目前卻少有相關的研究與觀察。惡性腫瘤內血液灌流的情形是 否與良性的病灶有所差別? 惡性腫瘤內組織血液灌流的是否有量化的機會? 其 是否可反應出惡性腫瘤的侵襲力和轉移力? 此方向之研究應具有臨床上的價 值。以上這些問題能量都卜勒超音波並無法回答，同時超音波對某些系統之病灶 無法評估(因超音波會被其他物質如空氣,骨骼，…所阻斷)， 是否有其他方法可 評估病灶內血管新生程度，或是否有方法可了解進而定性或定量組織內顯微血管 通透性的動態變化? 檢視目前醫學所使用的診斷工具，利用動態顯影磁振造影 (contrast-enhanced dynamic, DCE MRI)來評估組織內血管新生程度及血液灌流 (blood perfusion)被認為是一頗具潛力的工具(Polverini, 2002)。

磁振造影所使用的顯影劑 Gadolinium –DTPA，是一具有複磁性

(paramagnetic effect)之稀有金屬嵌合物。該顯影劑因有 T1 鬆弛作用 (T1 relaxation effect) 而在 T1 影像呈現高訊號之顯影效果(Strich, Hagan et al., 1985)，加上其安全性高，固在臨床上被廣泛使用作為磁振造影顯影劑。該物質 在進入組織血管後會快速由血管內空間(intravascular space)進入血管外空間 (extravascular space)，亦即間質空隙 (interstitial space) (Brasch, Weinmann et al., 1984)。 此種特性使吾人有機會一方面檢查組織內血管組織 之多寡程度(vascularization)，並可藉快速磁振造影觀察到血液如何從開始經 血管進入組織(first-pass)， 灌流入細胞間質， 何時且如何流出組織，以達到 觀察組織血液灌流的目的。Bock 等人 (Bock, Henrikson et al., 1995)運用定 量分析模式發現運用高速(每秒 1-2 張)動態顯影磁振造影觀察組織血液灌流，發

現二者間之相關係數(r)可高達 0.98。

動態顯影磁振造影目前在臨床上已有一些相關運用，如研究心肌之血液灌流 以了解心肌梗塞之範圍與找尋有機會存活之心肌組織，利用動態顯影磁振造影於 手術前定位經化療後惡性腫瘤存活位置以利完全切除，Verstraete 等人曾用以 區分在骨骼肌肉系統良性與惡性腫瘤血液灌流之差別(Verstraete, De Deene et al., 1994)，該篇文章以顯影強度隨時間作 time-intensity curve(圖 2)，然後 以顯影劑在第一次流入組織之顯影斜率(enhancement slope)來代表組織之血管 密度(vascularity)，發現顯影斜率與血管密度(vascularity)有很好的線性相 關，二者之相關係數 r = 0.93；同時也發現惡性腫瘤之顯影斜率平均大於良性 腫瘤，但是良性與惡性腫瘤二者之間其顯影斜率有重疊的區域，使鑑別診斷有時 也會發生困難。回顧此篇文章，作者只對顯影劑流入組織(wash-in)的量及速度 作探討，並未探討進入組織間係之後顯影劑留在組織內的情形及其如何流出組織 (wash-out)。 Daniel 等人(Daniel, Yen et al., 1998)後來運用動態顯影磁振 造影在乳房腫瘤，以顯影劑早期流出組織(early wash-out)的表現來鑑別良性與 惡性乳房腫瘤(圖 3)，他們發現顯影劑有在早期就流出組織的現象。此表現在侵 犯性乳癌(invasive cancers)之特異度(specificity)可達 93%，而顯影劑早期 流出組織現象在原位癌出現的比率則不高。但是一旦有顯影劑在早期流出組織現 象，其鑑別良性與惡性乳房腫瘤的敏感度可達 91%。動態顯影磁振造影目前已常 規用於乳癌之影像診斷 (El Khouli, Macura et al., 2009; Pickles, Manton et al., 2009; Turnbull, 2009)。事實上顯影劑早期流出組織的現象在其他系統之 惡性腫瘤也有報告，如在三相顯影電腦斷層(tri-phasic CT)或注射顯影劑之磁 振造影，都發現肝癌在早期動脈相(early arterial phase)會快速顯影，而在實 質期(parenchymal phase)腫瘤訊號即降低，此亦為 early washout 之表現,為 診斷肝癌之一重要影像診斷工具，良性的肝臟血管瘤則有延遲顯影(delayed enhancement)的現象，與肝癌恰好相反。

由以上研究可知良性與惡性腫瘤之血液灌流，存在有意義之差別。但 Daniel

並未在組織病理學上找到可以解釋的理由。 Woude 等人(van der Woude, Bloem et al., 1995)曾經用動態顯影磁振造影在惡性骨肉瘤發現顯影劑早期流出組織 的現象， 並將其與組織病理作對照，發現顯影劑早期流出之腫瘤組織在組織病 理學上表現為緻密高細胞密度之區域，細胞間質(interstitial space)較少，作 者將該現象解釋為在此類組織細胞因間質較少，故顯影劑流入組織後無法堆積在 不多的組織間質內，而馬上流出組織。此種推論頗為合理，同時腫瘤血管不同於 一般成熟血管，他們缺乏血管內膜的肌肉層並會產生動靜脈間的分流 (C. C. Wu, Lee et al., 1994)，這也許也是造成顯影劑早期流出組織的原因之一。

組織的血管灌流除了 early washout-out 外還有其他什麼模式? Daniel 等人 (Daniel, Yen et al., 1998)提出了五種模式(圖 4)。但是該篇文章只對 early wash-out 在惡性乳房腫瘤之表現加以討論，對於其他四種模式並未多有著墨。

回顧文獻發現其餘模式也有在別人的研究出現。 Ross 等人(Ross, Delamarter et al., 1989)曾以動態顯影磁振造影來觀察脊椎手術後 epidural scar 的表現，

發現 epidural scar 在早期會快速顯影，接著可見緩慢而持續地顯影，其表現 恰如 Daniel 觀察到之第三類曲線，同樣的曲線我們可在 Konig 等人(Konig, Sieper et al., 1990)對類風濕性關節炎之血管翳(pannus)在動態顯影磁振造影 的 time-intensity curve 上看到，但作者並未特別討論此種顯影模式，只強調 pannus 有極強之顯影，可作為類風濕性關節炎在動態顯影磁振造影的診斷依據。

有興趣的是當回顧文獻，發現 early wash-out 多在惡性腫瘤內出現，而早期快 速顯影，接著緩慢而持續地顯影多在良性病灶表現，但在文獻整理中我們無法找 到該項論點(尤其對良性病灶)，也無法找到對不同顯影模式(time-intensity curve)在良性與惡性病灶之統合性研究。由以上之文獻整理，本論文第一部分的 假說是: 良性與惡性病灶之間應該會存在不同之血液灌流模式。

至於為何會選擇脊椎病變作為研究對象? 對於脊椎病變之診斷，目前主 要以素片，核子醫學，電腦斷層，與磁振造影檢查為主，但有時對於某些病 變之診斷，如鑑別單純骨折與病理性骨折，尤其在病人過去病史不能提供線

索下，鑑別診斷早期良性與病理性脊椎壓迫性骨折仍會遭遇到困難。良性壓 迫性脊椎骨折在癒合過程中也會發生大量之血管新生，而使傳統之顯影劑檢 查在二者皆會發生明顯顯影。若是動態顯影磁振造影對良性與惡性乳房腫瘤 有鑑別的能力，是否也可將其用在鑑別良性脊椎壓迫性骨折與病理性脊椎骨 折上?我們查詢文獻，對於各種脊椎本身病變(如良性與惡性腫瘤，骨髓炎，

壓迫性骨折，病理性骨折…)之血液灌流模式，目前並無有系統之研究分析。

同時，動態顯影磁振造影只是在注射顯影劑後馬上增加一組脈衝程序(約八十 多秒的檢查時間)，並不會改變傳統檢查方式，但有可能藉增加對各種脊椎病 灶本身血液灌流之了解以提供更多正確診斷之機會，其實光是了解各種脊椎 病變本身之血液灌流模式即為一很有興趣的課題。

1.1.2 欲研究的問題及其重要性

隨 著 社 會 高 齡 化 ， 骨 質 疏 鬆 及 脊 椎 壓 迫 性 骨 折 的 發 生 率 也 跟 著 增 加 ， 近 十 年 來 台 灣 流 行 病 統 計 調 查 結 果 發 現 ： 65 歲 以 上 台 灣 城 市 婦 女 ， 19%已 有 一 個 以 上 之 脊 柱 體 壓 迫 性 骨 折 ； 男 性 則 為 12%有 一 個 以 上 之 脊 柱 體 壓 迫 性 骨 折 ， 而 脊 椎 壓 迫 性 骨 折 的 鑑 別 診 斷 應 包 括 因 癌 症 轉 移 造 成 之 病理性腰椎壓迫性骨折。對於二 者 之鑑別診斷，當轉 移 性 癌 症 組 織 還 不 是 很 明 顯 時 ， 尤 其 在 還 不 知 道 患 者 具 有 原 發 性 癌 症 時 ， 有時即 使 傳 統 磁振照影檢查在診斷上仍會遭遇困難，甚至連加做顯影劑注射的磁振造影 有時仍不能確定 (Chan, Peh et al., 2002; Harrington, 1993; Moulopoulos, Yoshimitsu et al., 1996; Yuh, Zachar et al., 1989)。而在一位癌症患者身 上，也可能發生同時良性脊椎壓迫性骨折，可是二者在 MRI 影像學上的變化有時 非常類似，連專科放射線醫師仍會遭遇困難，因而錯失了診斷與治療的時機。從 一次顯影劑注射的磁振造影我們是否可以獲得更多的訊息以利判斷患者的壓迫 性骨折是屬於良性或需懷疑是癌症轉移病理性骨折?我們認為動態顯影磁振造影 只佔用注射顯影劑後約二分鐘的時間，其後我們仍可實施傳統 T1 顯影後的檢 查，應該可以提供更多的資訊，同時不會影響傳統磁振造影檢查的進行。

1.1.3 研究假說

骨 質 疏 鬆 引 起 之 脊 椎 壓 迫 性 骨 折 病 灶 的 本 質 為 骨 樑 受 傷，而 續 發 病 理性脊椎壓迫性骨折病 灶 的 本 質 為 腫 瘤 合 併 骨 骼 受 傷 ， 二 者 組 織 內 血 管 新 生 之 血 液 灌 流 的 特 性 前 者 為 骨 折 修 復 的 炎 症 反 應 ； 後 者 是 因 內 有 惡 性 組 織 存 在 而 有 的 腫 瘤 血 管 新 生 ， 二 者 血 液 灌 流 的 表 現 應 該 會 有 所 不 同，而 我 們 應 可 藉 助 動態顯影磁振造影，經由觀察壓 迫 性 骨 折 內血液灌流參 數的差異，以及顯影劑在組織內流進（wash-in）及流出(wash-out)的情形,來區 分良性與病理性脊 椎 壓 迫 性 骨 折 。

1.1.4 研究目的

本子計劃的目的乃是要藉由動態顯影磁振造影鑑別分析骨 質 疏 鬆 引 起 之 脊 椎 壓 迫 性 骨 折 與 續 發 病理性脊椎壓迫性骨折病 灶 內 血 管 新 生 血液灌流的 特性之不同，以增加磁振造影診斷病理性脊椎壓迫性骨折的能力。

1.2 第二部份:以葉酸接受體動態顯影磁振造影標靶影像偵測具有葉酸接受體之 腫瘤

1.2.1 背景、文獻回顧

在第一部份的臨床研究中，我們成功利用動態顯影磁振造影將良性腰椎壓迫 性骨折與病理性腰椎壓迫性骨折骨髓內血管新生血液灌流的情形的區分出來。雖 然二者內部都有進行血管新生現象，但顯影劑早期流出病灶為病理性腰椎壓迫性 骨折特有之現象。第一部份的完成也反映出目前臨床所使用的磁振造影檢查對病 灶的偵測(包含病灶的偵測，大小，範圍，成分，以及病灶內的一些血流生理現 象)所能達到的極限。我們有沒有甚麼方法，可以使磁振造影偵測病灶的能力更 上一層樓?

自西元 1895 年侖琴發現 x 光後，開啟了臨床醫學的新里程碑-影像醫學，

人類從此可以在生物體還活著的時候，看到其內部的構造。儘 管 過 去 的 20 多 年 裏 ， 醫 學 影 像 的 設 備 和 技 術 有 了 顯 著 的 進 步 ， 如 電腦斷層掃描，超音

波，磁振造影等各 種 影 像 儀 器 的 解 析 度 不 斷 提 高，所 能 檢 查 的 構 造 越 來 越 清 晰 ， 但各種傳 統 影 像 學 儀 器 主 要 依 賴 非 特 異 性 的 物 件 成 像 原 理 來 進 行 不 正 常 病灶的 檢 測 ， 如 利 用 不 同 組 織 物 理 學 特 性 （ 如 組 織 的 吸 收 、 散 射 、 質 子 密 度 等 ）的 不 同 ， 或 者 從 生 理 學 角 度（ 如 血 流 速 度 的 變 化 ）來 診 斷 疾 病，但 無 法 以 影 像 方 式 顯 示 體 內 具 體 分 子 或 細 胞 層 級 的 改 變。現 今 面 對 人 類 十 大 死 因 之 首 的 癌 症，各 種 傳 統 影 像 儀 器 也 只 有 當 身 體 發 生 明 顯 的 解 剖 結 構 發 生 改 變 時 才 能 發 現 異 常 。 但事實上，

當一個腫瘤長到可被影像診斷儀器偵測到時，在此之前身體內已經發生了許多生 理, 代謝, 以及許多特殊分子的變化；甚至我們可說，一個腫瘤的產生只是組織 內眾多分子變化之後一個最後的結果(圖 5)。

故從另一角度來看，傳統醫學影像已面臨到一個瓶頸，光偵測各種組織器官 外型構造的變化已經逐漸無法滿足臨床醫學的需求；我們需要新的影像診斷策 略，使我們能在身體內開始發生代謝，生理，甚至一些特定分子變化的時候，能 夠用影像學的方式偵測出來。因此，1999 年美國哈佛大學 Weissleder 等人提出 了分子影像學（molecular imaging）的概念(Weissleder, 1999)：意即應用影 像學方法，對活體狀態下的生物進行細胞和分子層級的定性和定量的活體影像研 究，意 圖 在 分 子 生 物 學 與 傳 統 影 像 醫 學 之 間 搭 建 起 一 座 橋 樑 ， 通 過 活 體 影 像 直 接 顯 示 細 胞 或 分 子 層 級 的 生 理 和 病 理 變 化 。

分子影像學預計能達成的目標如下：第一，分子影像技術可將基因表達、生 物信號傳遞等復雜的過程變成直觀的圖像，使人們能在分子層級上理解疾病的發 生機制；第二，分子影像技術能夠發現疾病早期的分子變異及病理改變過程；第 三，分子影像技術可在活體上早期、連續觀察藥物或基因治療的機轉和效果。在 器官層級，我們可藉分子影像偵測腫瘤所在、數量(tumor burden)及有否轉移；

在組織層級，我們可藉分子影像觀察血管新生現象，藥物給予途徑；在細胞層級，

我們可藉分子影像觀察腫瘤標記與藥物標的(drug targeting)；在基因層級，我 們可藉分子影像偵測 DNA 合成速率，基因治療之效果。目前，分子影像研究還處

於起步階段，但已經在動物模型、基因治療、藥物篩選和腫瘤檢測等方面的研究 中取得了令人矚目的成績。對癌症的研究是分子影像學研究的重點之一，如果在 腫瘤的早期將其發現，在癌症藥物治療的早期，即可判斷是否發生效果，這將引 發腫瘤診斷、腫瘤治療的重大變革。

分子影像的目標要如何達成呢？我們如何利用現有的影像儀器，而獲得活體 內分子活動的證據？ 其關鍵就在發展具有高親和力的分子標靶顯影劑

(molecular targeting contrast medium)。分子標靶顯影劑的結構內包含兩大 部分。在分子標靶顯影劑內應具有能夠和腫瘤相關的特異標靶(target)結合的分 子探針（如抗體，酵素受體，或與某腫瘤標記具有高親合力的分子結構，…等），

分子標靶顯影劑內也應接合各類醫學影像儀器的顯影劑（可以是放射性物質[迦 瑪射線攝影機、正子攝影機]，磁振照影 T1 影像釓顯影劑，磁振照影 T2 影像氧 化鐵顯影劑，微氣泡[超音波]，光學報告基因（luciferase reporter gene）[光 學攝影機]，螢光試劑[活體螢光攝影機, 活 體 顯 微 鏡 ]等）。將分子標靶顯影劑 注入活體內後，因其有能夠和生物體內特異靶點結合的分子結構，故顯影劑會在 體內有大量表現目標靶點的組織或病灶聚集，接著依標靶顯影劑所接合的顯影 劑，使用相關的影像系統收集由分子標靶顯影劑所產生的信號來呈像。

以上的想法若能完全執行自然十分的理想，但實際上在活體影像需要克服許 多問題。例如：第一、 此探針需具有很好的特異性（specificity），若是該標 靶顯影劑特異性不好，則其偽陽性將是影像判讀之一大問題。第二、標靶顯影劑 需要能夠克服各種生理屏障，包括血管壁、細胞間隙、細胞膜、血腦屏障等，這 是分子影像的一大難點，在技術上至少需要將標靶顯影劑做到 50nm 直徑以下，

同時標靶顯影劑直徑又不能太小，以維持標靶顯影劑血中濃度，避免馬上被排出 體外。第三、需要顯影劑信號放大策略，由於標靶顯影劑在體內(即使已經聚積 在病灶附近)的濃度很低，所以一方面影像偵測儀器需要具備極高的靈敏度

（sensitivity），另一方面我們需要通過化學或生物的方法使顯影劑信號放大。

就影像偵測儀器之靈敏度而言，目前核子醫學影像儀器具有最高偵測放射性分子

探針的靈敏度，當顯影劑濃度在組織內有 nM 濃度的量時即可被核子醫學攝影機 偵測到；而磁振照影顯影劑濃度在組織內要有µM 濃度以上才能被偵測到，二者 敏感度相差 1000 倍，這也是為什麼核子醫學分子影像學在目前的分子影像研究 中佔有先驅的地位。 另外就顯影劑信號放大策略而言，可以藉助載體（carrier）

等方法，將多個顯影劑分子嵌合於一個載體上，同時亦將多個和特異靶點(target) 結合的分子結構，嵌合於同一個載體上，而達到放大訊號的目的(圖 6)。一方面 因載體為較大的分子，使標靶顯影劑不致馬上被排出體外，一方面載體選用生物 鈍性(biological inert)物質使此標靶顯影劑不致與體內蛋白質有吸附作用或 遭巨噬細胞吞噬，生物相容性 (Biocompatibility) 高而不具毒性，另外載體上 可攜帶多個功能基(functional group)，使一個載體可同時接合多個顯影劑以達 到顯影信號放大的目的，以及可接合多個和生物體內特異靶點(target)有高親和 力的分子探針，以增加尋找特定標靶的能力。

學生於2003年前往美國麻州總院放射科分子影像實驗室(Center for molecular imaging research, CMIR)研習一年, 期間以葉酸接受體標靶影像與 活性氧光化學影像為題目完成了三項計畫並將其成果分別發表相關分子影像雜 誌 (W. T. Chen, Khazaie et al., 2005; W. T. Chen, Mahmood et al., 2005;

X. Chen, Conti et al., 2004)。基於在發炎組織中活化的巨噬細胞會大量表現 葉酸接受體(Nakashima-Matsushita, Homma et al., 1999)，我們使用葉酸接受 體近紅外線光學分子探針，在老鼠lipopolysacchride關節發炎模式成功的偵測 到在發炎組織中活化的巨噬細胞(圖7)。我們又利用此分子探針在 KRN mice serum transfer 模式，KRN鼠的血清內有攻擊關節滑液囊的自體抗體，若注入到 健康B6小鼠體內，不久健康B6小鼠也會在各處發生關節炎。我們在KRN鼠的血清 注入到健康B6鼠體內36小時後即偵測到小鼠右腕有高訊號表現(圖8)，但此時小 鼠右腕外觀上仍無紅腫熱等異狀。將小鼠犧牲後組織學證實右腕已有輕微發炎反 應與活化的巨噬細胞聚集(圖八)(W. T. Chen, Mahmood et al., 2005)。因活化 的巨噬細胞也常伴隨腫瘤的發生(Pasricha & Motamedi, 2002)，我們又利用此

探針在APC^- mice腸腺瘤模式，該鼠因APC基因缺陷，在生長一段時間後即在腸內 發生多發性腸腺瘤(dysplastic adenoma)，隨後我們也證實了葉酸接受體近紅外 線光學探針可以偵測tumor associated activated macrophages(圖9)(W. T.

Chen, Khazaie et al., 2005)。在美國剩下的時間，我們也完成了以luminol 容 易產生光化學反應的現象，利用極敏感之光學攝影機來偵測在發炎關節中的活性 氧致使luminol氧化的發光現象(圖10)(W. T. Chen, Tung et al., 2004)。

返國後打算運用所學,從事分子影像的研究。在美國進修的研究內容是以近 紅外線光(near infrared)為攝影工具，從事葉酸接受體標靶近紅外線光學影 像。但是回國之後，一方面因當時國內找不到可用的近紅外線光學攝影機，二方 面光學攝影較難推廣到臨床應用，因近紅外線光在組織內最多與能穿透2-3公分 的厚度。再加上學生本身是放射科醫師，深知磁振造影具備不可限量之開發能 力；故返國後打算朝磁振造影標靶分子影像發展。剛開始的目標，打算從較熟悉 的葉酸接受體磁振造影標靶分子影像著手。

卵巢癌一直是威脅女性的十大癌症之一，過去研究發現，卵巢癌細胞表面會 大量表現葉酸接受體 folate receptor α (Nilsson, Gustavson-Kadaka et al., 1997)，葉酸接受體與葉酸有很強的親合力，而正常卵巢細胞表面不會表現葉酸 接受體。葉酸接受體是一 38-kDa glycosyl phosphatidylinositol -anchored protein， 又可分為 α、β 兩種 isotypes (Miller, Wang et al., 2007)，具 有和葉酸極強的親合力(dissociation constant< 1 nM) (Antony, 1992)，在正 常組織中只有腎臟，胎盤，脈絡叢，甲狀腺及少數 luminal epithelium 有表現 葉酸接受體，而其他組織平時並不表現 (Sudimack & Lee, 2000)。除了卵巢癌 之外，睪丸癌，子宮癌，肺癌與腎臟癌亦會大量表現葉酸接受體(Campbell, Jones et al., 1991; Iwakiri, Sonobe et al., 2008; M. Wu, Gunning et al., 1999;

X. Wu, Jeong et al.)。因葉酸接受體具有和葉酸極強的親合力，這給我們一個 機會可以將診斷顯影劑甚至癌症治療藥物經由接合葉酸而高選擇性的帶到身體 內有大量表現葉酸接受體的腫瘤(Landen, Kim et al., 2008; Low & Antony,

2004)，以達到標靶影像甚至標靶治療的目的。Moon 等人(Moon, Lin et al., 2003) 曾將 folate 與近紅外線螢光顯影劑接合在活體螢光攝影機下成功偵測到表現葉 酸接受體之腫瘤，但近紅外線螢光探針有組織穿透力差的缺點(Weissleder, 1999)；在體內深部放出的光在很短的距離內就會被相鄰的水分或血色素等物質 吸收掉，故在臨床應用上較難偵測深部器官。

Shinoda 等人將葉酸接在白蛋白與¹¹¹In，亦成功看到有意義的顯影差別 (Shinoda, Takagi et al., 1998)，但迦碼攝影機影像解析度較粗糙，同時同位 素具有放射性與其有半衰期之缺點。而磁振造影具有非常優異的軟組織對比能 力，可顯示清晰的解剖構造提供良好的組織解析度，若是我們能讓磁振造影顯影 劑接上分子探針來從事分子影像之研究，將可同時得到解剖上，生理上與在分子 層級對腫瘤更多的了解 (Hogemann, Basilion et al., 2001)。

釓 Gadolinium(Gd)為一副磁性(paramagnetic)物質, 有很強的 T1 鬆弛 (relaxation)現象， 當在磁振造影 T1 脈衝程序下，有釓的地方其訊號會明顯 的上升, 藉以達到磁振造影顯影的目的，如 Gd-DTPA 已經成為臨床使用多年之磁 振造影 T1 影像顯影劑，但 Gd-DTPA 在血流內無法停留太久，很快就會進入組織 間隙，並快速流出組織，此特性不利於將其作為標靶顯影劑(Vexler, Clement et al., 1994)。有研究將 gadolinium 連接於大分子量的載體如白蛋白(albumin) 或右旋糖酐(dextran), 使其在血流內停留的延長(Feng, Zong et al., 2006;

Schnorr, Wagner et al., 2003)，此種作法有利於磁振造影分子影像的發展。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一直鏈狀高分子，由於其分子本身不 具有毒性與免疫性，且具有抗蛋白質吸附的特性，因此聚乙二醇被廣泛應用於生物 科技和醫學領域(Duncan, 2006; Winter, Caruthers et al., 2003)；目前認為聚 乙二醇能夠抗血清蛋白質吸附的主因，為聚乙二醇分子在溶液中所產所的立體排除

（steric exclusion）效應，以及其良好的水合能力，使得聚乙二醇分子周圍形成 類似保護膜的水籠結構，造成其它物質不易吸附於其上。近年來工研院材化所開發 出聚乙二醇樹枝狀分子載體 [polyethylene glycol (PEG)– G3- dendrimer](圖

11)。該載體具有三代(G3)樹枝狀分子結構，分子兩端各具有 8 個氫氧功能基 (hydroxyl functional group)，可以用來接合多個和生物體內特異標靶(target) 有高親和力的分子探針以及接合多個顯影劑以達到顯影信號放大的目的與增加尋找 特定標靶的能力，甚至將來有可能攜帶治療藥物以達到標靶治療(target therapy) 的目的，是ㄧ具有潛力的藥物平台。經接洽學生和工研院材化所達成合作發展聚乙 二醇樹枝狀分子載體葉酸接受體磁振造影標靶顯影劑的計畫。

過去使用磁振造影分子影像的研究，研究者皆是在注射標靶顯影劑後，於固定時 間點(半小時，1 小時，2 小時，6 小時，12 小時，…)觀察腫瘤顯影程度，但在先驅 實驗(pilot study)中我們發現此種作法有幾項缺點: 首先當老鼠下檢查台之後，下 一次檢查很難擺位到和上次檢查一樣的位置，故此種方法有潛在的測量性誤差 (measurement bias)。同時當下一次實施磁振造影檢查時，我們發現每一次磁振造 影檢查的基線訊號(baseline signal intensity)都有所差異，這可能歸因於機器內 部不恆定(internal variability)所造成。動態顯影磁振造影是在生物體位置完全 不移動下，以同一組脈衝程序連續觀察病灶血液灌流動態變化，故可將潛在的測量 性誤差與機器內部不恆定所造成之誤差降到最低。同時根據動態顯影磁振造影所觀 察到的訊號變化，我們可以轉化成各種定量的血液灌流參數來分析。故本論文選用 動態顯影磁振造影來做觀察分析。查詢文獻我們是將動態顯影磁振造影運用於標靶 分子影像的第一個研究團隊。

1.2.2 欲研究的問題及其重要性

過去影像醫學的角色只是盡量去尋找身體內部是否有發生病灶，我們用 解析度最好的影像工具去界定腫瘤的大小範圍，病灶是否有侵襲到相鄰組 織，是否遠端轉移而為腫瘤做正確的分期，以利臨床做最合適的治療。但這 是否是影像醫學所能提供最好的資訊? 分 子 影 像 學 可 以 通 過 活 體 影 像 直 接 顯 示 細 胞 或 分 子 層 級 的 生 理 和 病 理 變 化，是突破目前傳統影像醫學瓶頸 的一重要研究方向。葉酸接受體在許多惡性腫瘤皆會大量表現，我們若有一種偵 測葉酸接受體的磁振造影標靶顯影劑，將可獲得如下好處:一、可以合理推測欲

治療的腫瘤是否有大量表現葉酸接受體，進而選擇最適合的化學治療藥物。二、

未來可以同時將癌症治療藥物酸與載體接合，使癌症治療藥物高選擇性的聚集於 大量表現葉酸接受體的腫瘤，以達到標靶治療之目的。三、我們可利用此偵測葉 酸接受體的標靶顯影劑去評估腫瘤接受治療後葉酸接受體表現量是否有比治療 前下降，藉此判斷治療是否發生成效，而不必等到腫瘤大小發生改變後方能得 知，而能及早對每一個患者制定治療方針。

1.2.3 研究的假說

我們認為以聚乙二醇樹枝狀分子載體作為藥物平台，將多個磁振造影顯影劑 Gd-DTPA 與多個葉酸接合上此載體，可以達到此訊號放大與加強葉酸接受體搜尋 的能力，使我們有機會利用動態顯影磁振造影配合標靶顯影劑偵側出活體內有表 現葉酸接受體的腫瘤(圖 12)。

1.2.4 研究的目的

本論文第二部分研究的目的，欲利用化學合成方式獲得 PEG-G3-

dendrimer-(Gd-DTPA)^m- (folate)n 葉酸接受體標靶顯影劑(與工研院材化所合 作)，藉著在此聚乙二醇樹枝狀分子載體上接合多個 Gd-DTPA 以獲得更大的 T1 鬆弛性(T1 relaxicity)以及在同一分子上可接合多個葉酸分子以增加搜尋葉酸 接受體的能力，加上此標靶顯影劑因分子量較大（10000 dalton），故同時具有 在血流中停留較久的優勢，我們計畫將其運用在 NOD SCID 鼠的腫瘤模式上，使 用動態顯影磁振造影看 PEG-G3 dendrimer- (Gd-DTPA)^m-(folate)ⁿ是否能聚集於 表現葉酸接受體的腫瘤處而被偵測出來；此研究對於將來篩選患者接受化學治療 藥物、以及抗葉酸藥物治療效果的評估均具有重要的臨床意義。

1.3 第三部份:以整合素 integrin α^vβ³動態顯影磁振造影標靶影像偵測腫瘤血 管新生並早期評估抗血管新生藥物治療後之反應

1.3.1 背景、文獻回顧

本論文第二部份的成功，使我們確信利用動態顯影磁振造影實施標靶分子影

像的可行性，我們也已發展出一可行的藥物載體平台，以利其他標靶顯影劑的合 成。這時我們再回到第一部份完成時留下的問題，對於病灶血管新生現象的偵 測，磁振造影的能力還能不能更上一層樓?

血管新生(Angiogenesis)是指從已經存在的血管床產生新血管的過程

(Folkman, 1971)，和癌症的發展有密切的關係。當腫瘤剛形成的時後，癌細胞 本身，或周圍的結締組織，會分泌許多促使血管新生的物質(angiogenic substances)。這些物質會激活血管內皮細胞(endothelial cells)，而發生下列 變化：1) 腫瘤周圍結締組織的分解破壞； 2) 內皮細胞增生； 3) 內皮細胞向 分泌促使血管新生物質的地方移動； 4) 內皮細胞重新組合成新生血管。血管新 生是腫瘤細胞的浸潤、遷移、增殖的重要過程(Felding-Habermann, 2003;

Folkman, 1990; Kerbel, 2008; Varner, 1997)。

血管新生對腫瘤的生長也非常重要。當腫瘤只有 2-3 mm 大小時，它可依靠滲 透作用(diffusion)自外界取得養份。但是一旦超過這個大小，就必需新生血管 來獲取養份。在實驗室中，若將腫瘤細胞種在動物身上無血管的區域(如眼睛的 前房)，腫瘤呈休眠(dormant)狀態；但若種在血管豐富的虹膜區(iris)，腫瘤則 可快速生長(Gimbrone, Leapman et al., 1972)。

腫瘤血管生成不僅受到促血管生成的酶、生長因子及受體的控制，同時也受 到細胞粘附分子的調節(Folkman, 1971)。在血管生成的過程中，內皮細胞必須 先從周圍細胞中游離出來，然後進入到其他組織中。在浸潤和遷移的過程中，內 皮細胞與基底膜的相互作用是通過整合素蛋白(integrin)介導的，同樣在血管生 成的最後步驟，包括毛細血管的組建和內皮細胞極性的確定，都需要細胞-細胞，

細胞-基質間的相互作用來調節(Folkman, 1971)。

整合素 integrin α^vβ³是一種與腫瘤血管新生及腫瘤轉移相關的細胞黏著受 體(cell adhesion receptor)。由於在成熟的血管內皮細胞中幾乎測不

到 integrin α^vβ³的表達(Mahabeleshwar, Feng et al., 2006)，而在腫瘤

等引發的血管生成中 α^vβ³ integrin 的表達增高，使得整合素 integrin α^vβ³ 成為血管新生的重要生物指標(Brooks, 1996; Brooks, Clark et al., 1994; X.

Lu, Lu et al., 2008), 甚至成為標靶治療的目標(Abdollahi, Griggs et al., 2005; Brooks, Montgomery et al., 1994; Kumar, 2003; Landen, Kim et al., 2008)。Brook 等人將整合素 integrin α^vβ³單株抗體注入動物體內，觀察到雞 的絨毛膜尿囊上血管新生的內皮細胞發生凋亡現象（apoptosis） (Brooks, Montgomery et al., 1994)，甚至將與 integrin α^vβ³有親和力的 Arg-Gly-Asp (RGD)序列之胜肽注入體內也可觀察到同樣現象(Brooks, Montgomery et al., 1994)。目前已有抑制 α^vβ³ integrin 單株抗體的標靶治療藥物正在臨床試驗 階段(Hersey, Sosman et al.)。

具 Arg-Gly-Asp (RGD)序列之胜肽與 integrin α^vβ³與具有高度的結合性 (Y. J. Lu, Zhang et al., 2002; Ruoslahti, 2003; Ruoslahti & Pierschbacher, 1986)，有研究顯示環狀 RGD 分子(cRGD) 對整合素 integrinα^vβ³之親和力甚至 比直鏈 RGD 分子更多出一百倍 (Aumailley, Gurrath et al., 1991; Gurrath, Muller et al., 1992)，故 cRGD 目前已被視為一具有潛力的 integrin α^vβ³ 分子探針。迄今已有研究利用放射性標誌 cRGD 胜肽，被探討用於偵測 integrin α^vβ³，進而作為偵測 integrin α^vβ³的腫瘤造影劑(Beer, Haubner et al., 2006;

Janssen, Oyen et al., 2002)。但迦碼攝影機的解析度並不佳，也不能提供切 面呈像。 Chen 等人曾將 cRGD 與近紅外線螢光物質接合，作為偵測 integrin α^vβ³的螢光標靶顯影劑 (X. Chen, Conti et al., 2004)，在螢光攝影機下 觀察 integrin α^vβ³的表現。但光學攝影之缺點乃在於光線在活體組織內的穿 透力很差，在體內深部放出的光在很短的距離內就會被相鄰的水分或血色素等物 質大部分吸收掉，同時光線在組織內亦有散射（scatter）的問題。也有作者將 cRGD 與磁振造影顯影劑接合以評估腫瘤血管新生(Boles, Schmieder et al.;

Huo, Du et al.; Lee, Li et al., 2008; Mulder, Strijkers et al., 2005;

Schmieder, Winter et al., 2005; Winter, Caruthers et al., 2003)，Winter 等人曾將 RGD 與 Gd-DTPA 用 emulsion 方式注入動物體內以偵測腫瘤血管新生，

但該研究無法證實以 emulsion 型態注入體內的 RGD/Gd-DTPA 是否會再度解離 (Winter, Caruthers et al., 2003)。在本論文第二部分與工研院材化所合作開 發葉酸接受體標靶磁振造影顯影劑(W. T. Chen, Thirumalai et al.)的計劃中，

我們成功證實了此藥物可以作為分子影像之藥物平台，並利用比較動態顯影磁振 造影之顯影模式與三十分鐘顯影劑流失百分比可以成功辨別出有表現葉酸接受 體的腫瘤。目前想在此基礎上進一步發展 integrin α^vβ³標靶磁振造影顯影劑，

將數個 RGD 與 GD_DTPA 分子接合於此藥物平台，此藥物具有在血流中停留較久的 優勢，在同一分子上可接合多個 Gd-DTPA 亦可以獲得更大的 T1 鬆弛性(T1 relaxicity)以及在同一分子上可接合多個 RGD 胜肽，並利用比較動態顯影磁振 造影顯示腫瘤血管新生內皮細胞表現 integrin α^vβ³的情形。

使用 cRGD 作為分子探針評估腫瘤血管新生有額外的好處。我們知道ＲＧＤ 並不是只與整合素 integrinα^vβ³有高吸附力，他與整合素家族的許多成員都有 高的吸附力，其中包括整合素 integrin α⁵β¹ (D'Souza, Ginsberg et al., 1991)，而 integrin α⁵β¹也被發現大量表現於血管新生中活化的內皮細胞，

卻不表現於正常組織內的內皮細胞(Bayless, Salazar et al., 2000; Bello, Francolini et al., 2001; Boudreau & Varner, 2004)。故使用 cRGD 作為分子 探針可以同時標定在血管新生中表現 integrin α⁵β¹的內皮細胞，一舉兩得。

許多實體腫瘤本身(如：腦瘤、肺癌、乳癌、消化道及泌尿道腫瘤)與血液惡 性疾病癌細胞(如：淋巴瘤、多發性骨髓瘤及白血病)都有血管內皮細胞生長因子

（vascular endothelial growth factor, VEGF） 過度表現的現象；由於 VEGF 對腫瘤血管新生扮演重要的角色，因此許多抗血管新生藥物的設計為阻斷 VEGF 的訊息傳遞。 Bevacizumab(Avastin®）是最具代表性的血管新生抑制劑，自老 鼠身上所得對抗 VEGF 的單株抗體，利用基因工程的方式，將大部份的結構改造 成人類蛋白質。如此，注射到人體後， 較不會因為物種的不同而產生對抗

bevacizumab 的中和抗體。Kabbinavar 等人用 Bevacizumab 合併

fluorouracil/leucovorin 治療大腸癌轉移病灶有較高的反應比例(Hurwitz, Fehrenbacher et al., 2004)。Rini 等人用 Bevacizumab 合併 interferon-alpha 治療腎細胞癌轉移病灶有較高的存活率(Polverini, 2002)。Bevacizumab 在 1994 年取得 FDA 核准上市，合併第一線標準療法用於治療轉移性結腸直腸癌；

1996 年 10 月獲得核准與 carboplatin 及 paclitaxel 併用，作為對無法切除、

局部進展、復發性或轉移性非麟狀細胞非小細胞肺癌的第一線治療用藥。雖然抗 血管新生藥物為癌症病人帶來新的治療契機，但治療費用卻是非常昂貴；同時抗 血管新生藥物治療也帶來一些副作用（如高血壓，消化道出血，…等）。故若是 有一非侵入性診斷方法，不僅可以偵測出腫瘤血管新生的多寡，甚至可以評估患 者對抗血管新生藥物治療是否有反應(responder)，或當患者已經開始有抗藥性 時能以影像方式診斷出來，這將對抗血管新生藥物治療帶來許多助益。

Kim等人曾用 bevacizumab抑制兔子角膜血管新生，從而發現bevacizumab 會抑制整合素家族的基因表現，其中包括整合素integrin α^vβ³與整合素 integrin α⁵β¹(Kim, Chung et al., 2009)。此發現使得我們所欲合成的接合 cRGD的磁振造影顯影劑，也有機會用來評估bevacizumab抗血管新生藥物治療後 腫瘤反應的評估。

1.3.2 欲研究的問題及其重要性

血管新生是腫瘤細胞的浸潤、遷移、增殖的重要過程，對腫瘤的生長也非常 重要。而如今抗血管新生治療已在臨床應用於轉移性結腸直腸癌與轉移性非麟狀 細胞非小細胞肺癌，但現今抗血管新生治療治療費用非常昂貴，需要患者自行負 擔；可是因多數之抗血管類藥物之作用機轉被認為主要是cytostatic；而不太可 能導致腫瘤快速、明顯之減小。若是患者已經發生抗藥性而我們將過一段時間等 腫瘤變大方能得知，不僅無謂增加患者經濟負擔，更耽誤了調整治療的最佳時 機。若有一非侵入性診斷方法，不僅可以偵測出腫瘤血管新生的多寡，使我們可 以挑選適合接受抗血管新生治療的患者，甚至可以評估患者對抗血管新生藥物治

療是否有反應(responder or nonresponder)，或當患者已經開始有抗藥性時能 以影像方式診斷出來，這將對抗血管新生藥物治療及其他標靶治療帶來許多助 益。

1.3.3 研究的假說

基於 cRGD 與整合素 integrinα^vβ³有高吸附力的特性，我們若能將多個 cRGD 和多個磁振造影 T1 顯影劑 Gd-DTPA, 一起接合在聚乙二醇樹枝狀分子載體 上，使其成為一具有搜尋整合素 integrinα^vβ³能力的磁振造影標靶顯影劑， 我 們就有機會運用動態顯影磁振造影在老鼠腫瘤模式下評估腫瘤血管新生表現整 合素 integrinα^vβ³的情形。同時，由於整合素 integrinα^vβ³是腫瘤血管新生 的重要生物指標(biomarker)，我們也有機會運用此具有搜尋整合素

integrinα^vβ³能力的磁振造影標靶顯影劑來早期評估抗血管新生藥物治療（如 使用 integrinα^vβ³單株抗體或ＶＥＧＦ單株抗體）後腫瘤是否發生反應。

1.3.4 研究的目的

本研究的目的,想利用化學合成方式獲得 PEG dendrimer-(Gd-DTPA)^m- (cRGD-DTPA)n，使之成為具有搜尋整合素 integrinα^vβ³能力的磁振造影標靶顯 影劑，此標靶顯影劑同時具有在血流中停留較久的優勢(分子量約 10000

dalton)，將其運用在 athymic nude mice 鼠的腫瘤動物模式上, 利用動態顯影 磁振造影分析顯影模式與血液灌流參數，看 PEG

dendrimer-(Gd-DTPA)^m-(cRGD-DTPA)ⁿ是否能聚集於表現 integrinα^vβ³所在的 血管新生處而被磁振造影偵測出來，並分析其顯影模式；同時我們也計畫將此搜 尋整合素 integrinα^vβ³能力的磁振造影分子探針用於評估抗血管新生藥物治 療後腫瘤的反應。此計劃對於未來篩選抗血管新生腫瘤標靶治療患者、以及之後 腫瘤臨床治療效果的觀察均具有重要的臨床意義。

第二章 第一部份:以動態顯影磁振造鑑別良性與病理性脊椎壓迫性骨折 2.1 研究方法與材料

患者

本研究包括四十二位患者（男18例，女24例，年齡：39-84歲 [平均66.5歲]）。

每一位患者皆因脊椎病變前來放射科接受動態顯影以及一般常規磁振造影。患者 依病變特性分為四組，進而分析他們的磁振造影與動態顯影參數。第Ⅰ組包括11 位患者（男2例，女9例，年齡：50-82歲 [平均 70.9歲]）具有12個脊椎體的急 性壓迫性脊椎骨折。急性壓迫性脊椎骨折定義為臨床症狀出現在磁振造影檢查前 1個月內（參考臨床病史）。第Ⅱ組包括17位患者（男3例，女14例，年齡：60-84 歲 [平均74.1歲]）而有21個脊椎體的慢性壓縮性骨折，臨床病史超過一個月的 疾病持續時間。第Ⅰ和第Ⅱ組的病人都至少追蹤有6個月沒有脊椎病變或惡性腫 瘤跡象。第Ⅲ組包括17例已知有脊椎體轉移性疾病的患者（男11例，女6例，年 齡：39-74歲 [平均58歲]），包含 32例非塌陷的轉移性脊椎體。這些患者的主 要癌症包括肝細胞癌（3例），食管癌（1例），乳腺癌（3例），直腸癌（1例），

肺癌（4例），腎細胞癌（1例），多發性骨髓瘤（2例），子宮癌（1例）。 其 中有三位患者有接受相關的脊椎活組織切片檢查而得到病理證實。有兩個多發性 骨髓瘤的案例均經骨髓穿刺證實。共四位患者有多重器官轉移並從其他轉移部位

（肝，卵巢，鎖骨上淋巴結，皮下轉移結節）接收到病理證實。在其餘的八個案 例，轉移性疾病的診斷是根據臨床的表現、相關的惡性腫瘤、及來自骨頭掃描影 像的特徵結果，同時包括之後追蹤的顯影磁振造影研究展現出所涉脊椎內的異常 髓內病變，在後續追蹤中呈現進行性的變化。第Ⅲ組的六位患者（男5例，女1 例，年齡：45-71歲 [平均為 64歲]）有六個病理性脊椎骨折而被列為第Ⅳ組。

包括肝癌（1例），乳腺癌（1例），直腸癌（1例），肺癌（2例），和多發性骨 髓瘤（1例）

MRI 磁振造影影像

MRI是在1.5-Tesla的超導系統（Powertrak 6000;飛利浦，荷蘭）實施。使用協

同式的脊椎線圈用於胸腰椎區域。注射顯影劑之前的脈衝程序包括自旋-回波T1- 加權的圖像（重複時間（TR）= 450毫秒，迴聲時間（TE）= 12毫秒），有以及 無脂肪抑制技術的渦輪自旋-回波T2圖像（TR = 2800毫秒，TE = 110毫秒），分 別以30公分及20公分掃描面積以矢壯面和橫切面來實施，切面厚度為 4毫米。動 態顯影磁振造影脈衝序列使用了極快的T1-加權的梯度-迴聲序列（TFE;飛利浦）

其TR = 4.6毫秒，TE =1.5毫秒，預脈衝反轉時間 = 400毫秒，翻轉角= 15 °，

掃描百分比= 70％，獲取矩陣 = 179 X 256。切片厚度為 10毫米，放置在脊椎 體的中間矢狀平面。在83秒中共獲得了120個動態影像。經過在右前臂靜脈預先 放置21號靜脈留置針而全速地手動給藥dimeglumin gadopentetate（Magnevist;

Schering，柏林，德國）（0.1 mmol /公斤/體重），緊接著以相同注入速度沖 洗 20毫升的生理鹽水，動態掃描則在開始注射顯影劑時馬上開始。

數據分析

信號強度值在操作員定義的關注區域（ROIs ,regions of interest）測量，該 ROIs由一名研究員（W.T.C.）輔以游標和圖形顯示設備並透過腫瘤中心於橫切面 圖像上測量。在ROIs內的訊號強度(signal intensity, SI)以 Gyroview軟體（飛 利浦）對時間繪製（圖13）成為時間-訊號強度曲線 (time-intensity curve，

TIC)。時間-訊號強度曲線的訊號值基準值（SIbaseline）以前三個訊號的平均 值計算。最大訊號值（SImax）定義為第一趟顯影的峰頂顯影增強值。顯影上升 時間（Trise）是SIbaseline和SImax的時間間隔。每個關注區域的峰頂頂顯增強 百分比(peak enhancement percentage)為[（SImax - SIbaseline）/ SIbaseline x 100％]和其相對增強斜率(peak enhancement slope)為[（SImax - SIbaseline）

/ SIbaseline / Trise x 100％] 分別被算出並與其他群組進行比較。

統計方法

首先進行F-檢驗以測試變異數的相等性，然後根據各組之間F-檢驗的顯著性 而用相等或不等的差異數來進行非成對的 t檢驗。統計軟體 Stata的7.0（Stata Corp.,USA）則被用來計算。

時間-訊號強度曲線 (time-intensity curve, TIC) 的顯影模式 我們所使用的時間-訊號強度曲線在縱軸是以顯影的相對增強百分比

(relative enhancement percentage)[(SIc – SI baseline)/SI baseline x100%]

對照時間為橫軸（0-80秒）描繪而得到的，其中SIc是顯影後的訊號強度。我們 將時間-訊號強度曲線分為五種類型（圖14）。 A類型代表近似平坦的時間-訊號 強度曲線。 B類型代表緩慢顯影的曲線。 C類型代表早期階段的陡升斜率（顯影 劑流入,contrast wash in），達到增強峰頂後跟著一段停滯期。 D類型代表在 最初的短期內的陡升斜率（顯影劑流入），同於C類型曲線的直立部分，在後半 的部分則表現顯影劑流出現象(contrast washout)。E類型代表了最初的陡升斜 率而跟著第二個慢升階段。如果最大的增強和在80秒的訊號強度差額大於 SI基 準值的20％，則C曲線將被定義為 D或E類型，取決於顯影的注入或洗出。該分界 值被定為 20％，因為在一個帶有10 X 10量測格式時間-訊號強度曲線內較易於 觀察。

2.2 結果

各組峰頂增強百比分的平均值和標準差（SDs）被歸納於表1和表2。如表1所顯示，

第Ⅰ組受試者的急性壓縮性骨折的峰頂顯影增強百比分高於第Ⅱ組受試者的慢 性壓迫性骨折（213.82±193.07對 55.24 ± 47.98；p <0.05）。第Ⅲ組受試者的 轉移性脊椎的峰頂顯影增強百比分較高於第Ⅱ組的慢性壓迫性骨折（152.52±

89.42對 55.24±47.98；p <0.001）。第Ⅳ組的病理性骨折受試者的峰頂顯影增 強百比分較高於第Ⅱ組的慢性壓迫性骨折（136.74 ±51.37對55.24 ±47.98；

p<0.05）。不同群組經標準化的顯影增強斜率的平均值和標準差列於表2。第Ⅰ 組受試者的急性壓縮性骨折透露出顯影增強斜率較高於第Ⅱ組受試者的慢性壓 迫性骨折（8.27 ± 9.9對 1.94 ± 2.31；p <0.05）。第Ⅲ組受試者的轉移性脊 椎的顯影增強斜率較高於第Ⅱ組的慢性壓迫性骨折（7.7 ± 5.11對 1.94 ± 2.31；P<0.05）。第Ⅳ組的病理性骨折受試者的顯影增強斜率較高第Ⅱ組的慢性 壓迫性骨折（8.13 ± 4.54對 1.94±2.31；p<0.05）。顯影峰頂增強百比分和顯

影增強斜率在比較急性脊椎壓縮性骨折，及有或無骨折的轉移性脊椎，非骨折的 轉移性脊椎，以及病理性脊椎骨折中並無顯著差異。

時間-訊號強度曲線 (time-intensity curve, TIC) 的顯影模式

所有數據由兩位放射科醫師在不同的場合進行審查，並對曲線圖形分類達成共 識。各組的五種時間-訊號強度曲線分佈情形列於表 3。來自第Ⅰ和第Ⅱ組的數 據被歸類為良性壓縮性骨折組，而第Ⅲ和第Ⅳ組的數據為惡性組。全部 13 個 D 型曲線都是在惡性組（組Ⅲ和Ⅳ）發現（100％）（圖 15）。七個 E 型曲線（圖 16）中有六個（85.7％）在良性壓迫性骨折組（組 I 和 II）顯現。C 型時間-訊 號強度曲線最常見於惡性腫瘤組（19/38，50％），而第二常見於良性壓迫性骨 折（10/33，30.3％）。 A 型曲線被發現於慢性壓迫性骨折病例（4 / 21，19％）。

B 型曲線則被發現於良性壓迫性骨折（13/33，36.3％）和非骨折的轉移性脊椎

（5 / 32，15.6％）。

2.3 其他相關發現

2.3.1 以動態顯影磁振造研究脊椎血液灌流與年齡性別之關係

在研究過程中，我們同時發現了一些有趣的脊椎骨髓血液灌流生理現象，主 要與老化有關。我們觀察到所收集的病人好像年齡越大其脊椎骨髓血液灌流的程 度（peak enhancement percentage）就越低(圖 17)。為了證實我們的想法，我 們統計了六十位不同年齡層的男女，證實了此一發現，並且脊椎骨髓血液灌流（由 動態顯影磁振造影所計算出標準化後的 peak enhancement percentage 代表）在 女性下降的斜率更快(圖 18a,b)(W. T. Chen, Shih et al., 2002)。

2.3.2 以動態顯影磁振造研究脊椎血液灌流與內頸動脈內膜厚度之關係

從 2.3.2 研究結果我們又推想骨髓血液灌流的程度的多寡會不會與個人動脈 硬化的程度有關? 所以設計了一個性別年齡成對相配研究(sex and age matched study),將性別和年齡這兩個重要的 confounding 因子控制住。我們在 2245 筆來 醫院做過頸部動脈超音波的資料庫中，先從內頸靜脈內膜厚度大於 1mm 的患者詢

問是否願意來參加研究以了解脊椎血液灌流情形；若有人願意我們就在資料庫內 尋找同年齡，同性別的人但其內頸靜脈內膜厚度小於 1mm，詢問是否願意參加實 驗，如此我們就在 43 對性別年齡相配研究中，證實了內頸靜脈內膜厚度越大，

脊椎骨髓血液灌流就越少(圖 19)(表 4)(W. T. Chen, Shih et al., 2002)。

2.3.3 以動態顯影磁振造研究脊椎血液灌流與脊椎脂肪比例之關係

我們在日常經驗中也觀察到隨著年齡增加，骨髓內脂肪成分也日益加多(圖 21)。二者之間是否有相關性，我們於是利用磁振造影磁譜 (MR spectroscopy) 分析五十位婦女獲得了二者之間有相關性的證據(圖 22)(W. T. Chen & Shih, 2006)。

第三章 第二部份:以葉酸接受體動態顯影磁振造影標靶影像偵測具有葉酸接受 體之腫瘤

3.1 研究方法與材料 顯影劑

此標靶顯影劑載體為線性聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)，分子量約為 4000。載體終端具有十六個樹枝狀分子枝節，以羥基的作為功能基以便日後接合 分子探針與各類顯影劑。此載體之製作根據擴散合成方法於線性聚乙二醇兩端產 生(Ihre, Padilla De Jesus et al., 2001)一到三產代 2,2 -雙（羥甲基）丙 酸之鏈接物。過程包括酸酐-耦合步驟和隨後的脫氫一序列的反應，此步驟被重 複直到該載體具有 16 個羥基的 G3 代樹枝狀功能性群組並結晶被獲取。接著，出 現在該樹枝狀結晶表面的羥基功能基被用來結合葉酸（平均數=5），以及二乙烯 三胺五乙酸五鈉(diethylenetriaminepentaacetate，DTPA)（平均數=11）。最後，

該 DTPA 終端與钆離子(Gadolinium)（圖 22）產生嵌合(chelation)以產生葉酸 接受體標靶顯影劑。詳細步驟敘述如下：

備製亞芐基保護的聚乙二醇-樹枝狀結晶的 G1 產代[PEG-bis[G-1]-(O2Bn)]

聚乙二醇 PEG (MW 4000 Da, 9.2 克, 2.3 m 莫耳, 1 當量) 及 4 -二甲氨基吡啶

（4-dimethylamiopryidine， DMAP）(0.1670 克, 0.39 m 莫耳)被放置在一個 氮氣環境下的 R.B.燒瓶，並加入 25 毫升的二氯甲烷以溶解該混合物。溶於二氯 甲 烷 （ 25 毫 升 ） 的 Benzylidene-2, 2-bis (oxymethyl) propionic (BOP) anhydride （4.27 克，10 mmol）被滴加到上述溶液中。將該反應的混合物於室 溫下攪拌一整夜。第二日添加甲醇（10 毫升）以淬取剩餘的酸酐並將該反應混 合物另再攪拌 6 小時。該反應混合物倒入劇烈攪拌後的剩餘乙醚（700 毫升）。 將分離出的過濾和乾燥成白色粉末（收成率：95％）。紅外線光譜儀（RX - 1，

PerKin Elmer，美國）和 ¹H NMR (MQ-20,Brucker，德國）被用來剖析該合成品 的特性。

備製 PEG-樹枝狀分子的 G1 產代[PEG-bis[G-1]-(OH)2]