7-1-1 乳酸菌預防 C. perfringens 侵襲模擬腸道細胞之試驗(prophylactic
effect of adherence inhibition) – 控制組
此試驗乃參考Wadström 等(1997)之方法來進行。將試驗乳酸菌株預 先吸附於Caco-2 cell，試驗其防止 C. perfringens 侵襲腸細胞之能力。先 將Caco-2 cell 以 0.25% (v/v) glutaraldehyde 固定 15 min，再以 PBS buffer 潤洗cell monolayer 二次，接著添加不含抗生素之 DMEM 培養基培養 1.5 hr。將試驗乳酸菌株離心後，以 PBS buffer 沖洗菌體沉澱二次，再以不
吸附率＝ × 100%
經酸及膽鹽連續作用後吸附至 細胞單層膜上的菌數(CFU/ml) 經酸及膽鹽連續作用後添加至 細胞單層膜上的存活菌數(CFU/ml)
含抗生素之DMEM 將菌體重新懸浮。另外將 C. perfringens 菌液與 fluorescein isothiocyanate (FITC, Sigma)螢光染劑(2 mg/ml)等體積混合，
並作用20 min，接著離心以去除過量 FITC，再以 PBS buffer 清洗菌體 沉澱3 次，將其重新懸浮於不含抗生素之 DMEM 中。將 1 ml (約 108 CFU/ml)乳酸菌液加入含有 Caco-2 cell monolayer 之 well 中，以 37℃, 5%
CO2培養 2 hr，吸除培養液並以 PBS buffer 潤洗 well 五次，以移除未吸 附於cell monolayer 上之菌體，然後加入 1 ml FITC 染色之 C. perfringens 菌液(約 108 CFU/ml)，於 37℃, 5% CO2培養 2 hr，吸除培養液並以 PBS buffer 潤洗 well 五次，以移除未附著之菌體。然後使用螢光檢測器 (Bio-Tek, FLX-800, USA)以激發波長 485 nm 和散發波長 528 nm 偵測樣 品之螢光強度(fluorescence density)，並以螢光顯微鏡拍照觀察，另外製 備未預先吸附乳酸菌，但加入FITC 染色之 C. perfringens 的樣品
(LAB-free)，同時測定其螢光強度。螢光強度比值之計算方式是以含乳
酸菌樣品之螢光強度值除以未含者之螢光強度值，再乘以100，並將未
含乳酸菌樣品之螢光強度值定為100%，若螢光強度比值降低，則表示
預先吸附於Caco-2 cell 上之乳酸菌株能有效降低 C. perfringens 對 Caco-2 cell 之侵襲。
7-1-2 乳酸菌預防 C. perfringens 侵襲模擬腸道細胞之試驗 (C.
本試驗乃參考Lee et al. (2003)所述之方法來進行。本試驗模擬體內 腸道之情況，假設乳酸菌已可良好定殖於腸道細胞上，當外來大量之病 原菌攝入體內時，必須通過胃腸道中胃酸與膽鹽之作用，因此於此體外 試驗先將各試驗乳酸菌株之懸浮菌液(約 108 CFU/ml)於 37℃, 5% CO2培 養2 hr。另一方面則預先將 C. perfringens (約 108 CFU/ml)於 pH 4 酸液中 作用3 hr，接著於 0.1% bile solution 中作用 3 hr，作用後離心收集菌體
沈澱，並以不含抗生素之DMEM 重新懸浮，依實驗 7-1-1 所述之方法將
C. perfringens 螢光染色，並加入已預先吸附乳酸菌株之 Caco-2 cell
monolayer 之 well 中，於 37℃, 5% CO2培養2 hr，以螢光偵測器偵測其 螢光強度，並以螢光顯微鏡拍照觀察，另外製備未預先吸附乳酸菌，但 加入FITC 染色之 C. perfringens 的樣品，同時測定其螢光強度。螢光強 度比值計算方法為含乳酸菌樣品之螢光強度值除以未含者之螢光強
度，再乘以100，將未含乳酸菌樣品之螢光強度定為 100%，若螢光強度
比值降低，則代表乳酸菌菌體能有效預防經pH 4 酸液及 0.1%膽鹽連續
作用後之 C. perfringens 吸附於 Caco-2 cell。
7-2-1 乳酸菌取代 C. perfringens 吸附於模擬腸道細胞之試驗
(therapeutic effect of displacement test) – 控制組
本試驗參考上述7-1-1 之方法，將 FITC 染色之 C. perfringens 預先 吸附於Caco-2 cell monolayer 上，於 37℃作用 2 hr 後，接著於 well 中加
入各試驗乳酸菌株之懸浮菌液(約 108 CFU/ml)，於 37℃, 5% CO2培養 2 hr，接著偵測樣品螢光強度，並以螢光顯微鏡拍照觀察。另外製備預先 吸附FITC 染色之 C. perfringens，但是未加入試驗乳酸菌之樣品，同時 測定其螢光強度。螢光強度比值之計算方式為含乳酸菌樣品之螢光強度
值除以未含者之螢光強度，再乘以100，將未含乳酸菌樣品之螢光強度
定為100%，若螢光強度比值降低，則代表乳酸菌菌體能有效取代 C.
perfringens 吸附於 Caco-2 cell。
7-2-2 乳酸菌取代 C. perfringens 吸附於模擬腸道細胞之試驗 (乳酸菌預
先以酸及膽鹽連續處理) – 試驗組
本試驗參考前述7-2-1 之方法，本試驗假設 C. perfringens 已侵襲腸 道細胞，當外來乳酸菌攝入體內時，必須通過胃腸道中胃酸與膽鹽之作 用，因此先將FITC 染色之 C. perfringens 懸浮菌液(約 108 CFU/ml)於 37℃, 5% CO2培養2 hr 使之吸附於 Caco-2 cell 上，另一方面則將各試驗乳酸 菌株(約 108 CFU/ml) 預先於 pH 4 酸液中作用 3 hr，接著於 0.1%膽鹽中
作用3 hr，作用後離心收集菌體沈澱，並以不含抗生素之 DMEM 重新
懸浮，於37℃, 5% CO2培養2 hr，偵測其螢光強度，並以螢光顯微鏡拍 照觀察。另外製備預先吸附經FITC 染色之 C. perfringens，但是未加入 試驗乳酸菌之樣品，同時測定其螢光強度。螢光強度比值計算方法為含
乳酸菌樣品之螢光強度定為100%，若螢光強度比值降低，則代表經 pH 4 酸液及 0.1% 膽鹽連續作用後乳酸菌菌體能有效取代 C. perfringens 吸 附於Caco-2 cell。