Caco-2 cell 於繼代培養後，以倒立式顯微鏡觀察細胞培養皿中細胞
生長情況及Caco-2 cell monolayer 之完整性。結果發現於繼代培養後第 0 天(如圖 4.1-A)，細胞呈現完整圓點形狀，且尚未貼附至細胞培養皿上，
至第四天(如圖 4.1-B)可觀察到大多數細胞已貼附於細胞培養皿壁上，呈 扁平狀且細胞數增多，至第七天(如圖 4.1-C)時細胞已長滿培養皿並開始 分化，至第十五天(如圖 4.1-D)後細胞分化完成，本研究吸附試驗所使用 之cell monolayer 皆為 Caco-2 cell 繼代培養十五天後之樣品。
2-2 吸附性試驗結果
表4.4 為各試驗乳酸菌株對 Caco-2 cell 之吸附率，亦即各菌株對腸 道細胞吸附能力的指標，其吸附能力依序為 L. acidophilus (8.28%，圖 4.2-A)＞B. bifidum (0.97%，圖 4.2-B)＞L. paracasei (0.012%，圖 4.2-C)，
L. acidophilus 在此試驗中呈現最佳吸附性(p＜0.05)。Lactobacillus 及
Bifidobacterium 吸附於腸道細胞之能力因菌種間之差異而有所不同
(Bernet et al., 1993; Coconnier et al., 1992; Gopal et al., 2001)。
益生菌欲定殖於腸道必須預先吸附於腸道，因此欲成為益生菌必須 具有吸附於腸道細胞之能力，並發揮其有益人體健康之功效(Havenaar et al., 1992; Morelli et al., 1997; Ouwehand et al., 1999c)。另外，許多文獻指
出具吸附性之益生菌並不能長久定殖於腸道，許多研究中發現當給予具 吸附性之益生菌時可在糞便中測得益生菌，但停止給予後發現糞便中益 生菌菌數便逐漸減少，因此推測益生菌只能短暫定殖於腸道中(Saxelin,
圖4.1、Caco-2 cells 繼代培養後之生長型態(A)繼代培養後第 0 天； (B) 第4 天；(C)第 7 天；(D)第 15 天 (放大倍率 100×)
Fig. 4.1. Changes in shape of Caco-2 cells at after subculture (A) 0 day; (B) 4 days; (C) 7 days; (D) 15 days (magnification 100×)
A B
C D
表4.4、各試驗乳酸菌株對 Caco-2 cells 之吸附率(%)
Table 4.4. Adherence rate (%) of the tested LAB to Caco-2 cells
a-c Values with different superscript letters significantly differ at the 5% level, n=3.
Strain
L. acidophilus B. bifidum L. paracasei Adherence (%) 8.28a 0.97b 0.012c
圖 4.2、各試驗乳酸菌株吸附於 Caco-2 cells 上之光學顯微鏡照像圖 (A) L. acidophilus; (B) B. bifidum; (C) L. paracasei (放大 2, 000×) Fig. 4.2. Photograph of the tested LAB adhered to Caco-2 cells in a light microscope (A) L. acidophilus; (B) B. bifidum; (C) L. paracasei
(magnification 2, 000×)
A
B
C
1997; Spanhaak et al., 1998)。
L. acidophilus 為一種典型益生菌，具耐酸、耐膽鹽及可吸附於腸道
細胞之能力，且具有多種有益於人體健康之功效(Tuomola and Salminen, 1998; Tejada-Simon et al., 1999; Lin and Chen, 2000; Gopal et al., 2001;
Hütt et al., 2006)。Coconnier et al. (1992)探討 L. acidophilus BG2FO4 之腸 道吸附模式，提出胞外蛋白質雙價橋理論，如圖4.3 所示，L. acidophilus 藉由此種胞外蛋白質連結至人體的腸道細胞受體，達到吸附與定殖的效 果。Bifidobacteria 也為源自人類腸道之益生菌，已有許多文獻證實其多 項益生效果(Tejada-Simon et al., 1999, Lee et al., 2004)。曾有學者以花生 凝集素(peanut agglutinin; PNA)做為研究素材來探討 B. bifidum EB102 之 吸附機制，結果發現此菌株是以細胞蛋白表面之蛋白質成分
(proteinaceous components)結合至模擬腸道細胞株 Caco-2 cell 之醣脂質 (glycolipid)的醣部分(carbohydrate moieties) (Mukai et al., 2004)。
2-3 乳酸菌耐酸耐膽鹽後之腸道吸附性
各試驗乳酸菌株經 pH 2, 3, 4 及 0.1, 0.2, 0.3%連續作用後之存活與 吸附菌數(log CFU ml-1)及吸附率(%)如表 4.5 所示。結果顯示只有經 pH 4
酸液及0.1%膽鹽連續作用後之乳酸菌株仍具有吸附能力，其吸附率依序
為：L. paracasei (80.68%，圖 4.4-C)＞L. acidophilus (9.71%，圖 4.4-A)
HUMAN LACTOBACILLUS
Extracellular Bridging Protein Adherence Receptor
for Bacteria
HUMAN ENTEROCYTE
圖4.3、L. acidophilus BG2FO4 對人類腸道細胞之吸附模式
Fig. 4.3. The model of adherence of L. acidophilus BG2FO4 to human intestinal cell (Coconnier et al., 1992)
表4.5、試驗乳酸菌株以 pH 2, 3, 4 分別處理 3 hr 後再連續以 0.1, 0.2, 0.3% 膽鹽分別處理 3 hr 後之存活菌數(log CFU ml-1)、吸附菌數(log CFU ml-1)及吸附率(%)
Table 4.5. The viable count of survival (log CFU ml-1), adherence (log CFU ml-1) and adherence rate (%) of the tested LAB treated with pH 2, pH 3, and pH 4 acid solutions for 3 hr and then 0.1, 0.2, 0.3% oxgall bile salt solutions for 3 hr respectively
x-y Different letters in the same column significantly differ at the 5% level, n=3
a Viable counts after the treatment of acid and continued action by bile salt; the initial inoculum is N×108 CFU ml-1
b Adherence rate (%)
pH 2 pH 3 pH 4
0.1% 0.2% 0.3% 0.1% 0.2% 0.3% 0.1% 0.2% 0.3%
Strain
survival adherence survival adherence survival adherence survival adherence survival adherence survival adherence survival adherence survival adherence survival adherence
L. acidophilus 0a
圖4.4、各試驗乳酸菌株經 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽連續處理後吸附於 Caco-2 cells 上之光學顯微鏡照像圖(A) L. acidophilus; (B) B. bifidum; (C) L.
paracasei (放大 2, 000×)
Fig. 4.4. Photograph of the tested LAB after being treated with pH 4 acid solution and 0.1% bile continually adhered to Caco-2 cells in a light microscope (A) L. acidophilus; (B) B. bifidum; (C) L. paracasei
A
B
C
＞B. bifidum (5.20%，圖 4.4-B)，其中 L. paracasei 具最高吸附率(p＜
0.05)。所有試驗乳酸菌株於 pH 2 或 pH 3 酸液作用後再分別以 0.1, 0.2, 0.3%膽鹽處理後，皆喪失其吸附能力。另外，與未經酸及膽鹽溶液連 續作用前之吸附率(表 4.4)比較，經 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽溶液連續作 用後存活之乳酸菌表現較高的吸附率(表 4.5)。經 pH 3 酸液及 0.1%膽 鹽、pH 4 酸液再分別以 0.2, 0.3%膽鹽連續作用後存活之乳酸菌皆喪 失其吸附能力，推測此結果可能因菌體表面蛋白質成分之吸附因子於 酸液及膽鹽作用後受到損害所導致。