乳酸菌拮抗病原菌吸附之益生特性 - 乳酸菌經模擬胃腸道條件之酸與膽鹽作用後的基礎益生特性探討; Basic Probiotic Properties of Lactic Acid Bacte

3-1 乳酸菌預防 C. perfringens 侵襲模擬腸道細胞之吸附性抑制功效 (adherence inhibition effect)

乳酸菌預先吸附於Caco-2 cell 上，再分別加入(1)不經酸及膽鹽 作用之螢光染色 C. perfringens，以及(2)經 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽連續 作用後螢光染色之 C. perfringens，所得之乳酸菌預防 C. perfringens 吸附之結果如圖4.5 所示。C. perfringens 未經酸及膽鹽作用前吸附於 Caco-2 cell 上之菌數為 5.94 log CFU ml^-¹，預先以pH 4 酸液及 0.1%

膽鹽溶液連續作用後，其吸附於Caco-2 cell 上之菌數為 4.87 log CFU ml^-¹，並以此數據作為圖4.5 上未吸附乳酸菌組（LAB-free）100%之 吸附率。結果顯示各試驗乳酸菌株皆可顯著預防 C. perfringens 吸

圖 4.5、預先吸附於 Caco-2 cell 上之乳酸菌對螢光染色之 C.

Fig. 4.5. Adherence inhibition effect of the tested LAB pre-adhered to Caco-2 cells upon the adhesion of FITC-labeled C. perfringens (with and without pretreatment of acid (pH 4) and bile (0.1%)).

*Significantly different from the LAB-free group (p＜0.05).

a Values of the identical LAB do not differ significantly (p＞

0.05). A₁, A₂, A₃: FITC-labeled C. perfringens without the treatment of acid and bile. B₁, B₂, B₃: FITC-labeled C.

perfringens pretreated with acid and bile

LAB-free L. acidophilus B. bifidum L. paracasei

附於Caco-2 cell (p＜0.05)。此外，同一乳酸菌株預防不經酸及膽鹽作 用之 C. perfringens 及經 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽連續作用後之 C.

perfringens，雖然各乳酸菌株預防經 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽連續作用

後之 C. perfringens 結果較佳，但兩者間並未達到顯著差異(p＞0.05)。

由上可知，不論 C. perfringens 是否經酸與膽鹽作用，乳酸菌株均能 有效預防 C. perfringens 對腸道細胞之侵襲，圖 4.6(病原菌未經酸、膽 鹽作用)及圖 4.7(病原菌先經酸、膽鹽作用)為其螢光顯微照相圖，由 圖中可知預先以乳酸菌定殖之樣品，C. perfringens 螢光強度皆有減弱 的現象。

病原菌吸附至腸黏膜表面被認為是感染腸道細胞之首要步驟 (Beachey, 1981; Finlay and Falkow, 1997)，因此抑制病原菌之吸附可預防其定殖及感染腸道(Tuomola et al., 1999)。已有許多研究證實乳酸菌具有抑制病原菌吸附及侵入腸道細胞之功效(Bernet et al., 1993;

Coconnier et al., 1993; Hudault et al., 1997; Lee et al., 2000; Fernández et al., 2003; Asahara et al., 2004)，目前也已廣泛應用於人體及動物治

療腸胃道疾病(Rolfe, 2000)。

大多生體外拮抗病原菌能力之試驗(Coconnier et al., 1993; Lee et al., 2003; Gagnon et al., 2004)其乳酸菌株或病原菌株並未經酸及膽鹽 連續作用後，再進行試驗。本研究中拮抗病原菌之生體外試驗，欲更

A

C

B

D

Fig. 4.6. Fluorescent microscopic photographs representing the preventive effects of the tested LAB pre-adhered to Caco-2 cells upon the adhesion of

FITC-labeled C. perfringens. (A) LAB-free group (not treated with LAB), and LAB pre-adhered to Caco-2 cells with (B) L. acidophilus;(C) B.

bifidum;(D) L. paracasei, respectively

圖4.6、預先吸附於 Caco-2 cell 上之乳酸菌預防螢光染色 C. perfringens 吸附之 螢光顯微鏡照相圖。(A)LAB-free 組，未預先吸附乳酸菌；(B)預先吸附 L. acidophilus；(C)預先吸附 B. bifidum；(D)預先吸附 L. paracasei

Fig. 4.7. Fluorescent microscopic photographs representing the preventive effects of the tested LAB pre-adhered to Caco-2 cells upon the FITC-labeled C.

perfringens (pretreated with pH 4 acid solution and 0.1% bile solution) adhesion (A) LAB-free group (not treated with LAB), and LAB

pre-adhered to Caco-2 cells with (B) L. acidophilus;(C) B. bifidum;(D) L paracasei, respectively

圖4.7、預先吸附於 Caco-2 cell 上之乳酸菌預防先以 pH 4 酸液及 0.1%

膽鹽溶液處理之螢光染色 C. perfringens 吸附之螢光顯微鏡照相 圖。(A)LAB-free 組，未預先吸附乳酸菌；(B)預先吸附 L.

acidophilus；(C)預先吸附 B. bifidum；(D)預先吸附 L. paracasei

A B

C D

接近實際生體內之情況，因此於乳酸菌預防 C. perfringens 侵襲腸道 細胞試驗中，假設乳酸菌株已吸附並定殖於腸道上，以驗證定殖於腸道之乳酸菌對於經酸、膽鹽作用後之病原菌是否有較佳之吸附性抑制 (adherence inhibition)效果。若攝入病原菌，則病原菌必須先經胃腸 道之作用，再與乳酸菌株競爭吸附，結果發現乳酸菌可顯著降低 C.

perfringens 之吸附，且效果較佳，雖然與未經酸及膽鹽作用之 C.

perfringens 拮抗能力比較並未達到顯著差異。另外，乳酸菌經酸及膽

鹽作用後之吸附能力之結果中發現，只有經pH 4 酸液及 0.1%膽鹽預

先作用乳酸菌仍具有吸附能力(表 4.5)，因此以 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽 作為模擬胃腸道及 C. perfringens 所受酸、膽鹽之作用條件。

3-2 乳酸菌取代 C. perfringens 吸附於模擬腸道細胞之功效

(displacement effect)

將螢光染色之 C. perfringens 預先吸附於 Caco-2 cell 上，再加入

未經酸液及膽鹽作用之乳酸菌株及經pH 4 酸液及 0.1%膽鹽連續作用

之乳酸菌株，探討上述兩種不同情況下乳酸菌對 C. perfringens 吸附

性之影響，結果如圖4.8 所示。由圖可知乳酸菌株無論是否先經酸液

及膽鹽預先作用，皆可顯著降低 C. perfringens 對 Caco-2 cell 的吸附。

另外，同一乳酸菌株，經酸液及膽鹽預先作用後，其抑制 C. perfringens

圖 4.8、乳酸菌(未處理及連續以 pH 4 酸液及 0.1%膽鹽溶液處理)取 代螢光染色之 C. perfringens 對 Caco-2 cell 吸附之試驗結 果。^*含乳酸菌組與 LAB-free 組(未吸附乳酸菌)比較後達統計上顯著性差異(p＜0.05)；含相同乳酸菌組標示字母不同者，表示彼此間具顯著性差異(p＜0.05)。A₁, A₂, A₃：未以酸液及膽鹽溶液處理之乳酸菌(控制組)；B₁, B₂, B₃：預先以酸液及膽鹽溶液處理之乳酸菌(試驗組)

Fig. 4.8. Displacement effect of the tested LAB with and without the pretreatment of acid (pH 4) and bile (0.1%) on the adhesion of pre-adhered FITC-labeled C. perfringens. ^* Significantly different from LAB-free group (p＜0.05). ^a-b Values of the

identical LAB with different letters differ significantly (p＜0.05).

A1, A2, A3: the three LAB without the pretreatment of acid and

吸附之作用下降，三株菌中又以 L. acidophilus 之取代吸附能力降低 程度達到顯著差異(p＜0.05)，因此可推論乳酸菌株以酸液及膽鹽預先 作用會對其造成傷害，雖然 B. bifidum 及 L. paracasei 也顯示相同之結 果，但並未達顯著差異(p＞0.05)。圖 4.9(乳酸菌未經酸、膽鹽作用者) 及圖4.10(乳酸菌先經酸、膽鹽作用者)為各試驗乳酸菌株取代 C.

perfringens 吸附程度之螢光顯微照相圖，結果顯示螢光染色 C.

perfringens 之螢光強度皆減弱。

許多文獻指出乳酸菌具有抑制病原菌吸附及侵襲腸道細胞之能力(Bernet et al., 1994; Tuomola et al., 1999; Tsai et al., 2004)。本研究中

試驗之乳酸菌株無論是否預先以pH 4 酸液及 0.1%膽鹽作用，皆可有

效取代 C. perfringens 吸附於腸道細胞。由先前許多學者及本研究中 之結果可知，如將乳酸菌應用於臨床上應可改善腸胃道菌相有助於腸胃道疾病之治療與緩解。

本研究中，L. acidophilus 在未經酸及膽鹽連續作用前，擁有最佳

的吸附能力，但在拮抗病原菌試驗中與 B. bifidum、L. paracasei 比較 後，並未表現出最佳拮抗能力。Tuomola et al. (1999)指出拮抗病原菌吸附之能力與益生菌本身之吸附能力並無相關性。其拮抗能力與益生菌及病原菌競爭腸道上之特定吸附因子之接受器(Lee and Puong, 2002)，及乳酸菌與病原菌之間共凝集作用有關(Reid et al., 1988;

圖4.9、乳酸菌取代螢光染色 C. perfringens 吸附之螢光顯微鏡照相 圖。(A)LAB-free 組，螢光染色 C. perfringens；(B)添加 L.

acidophilus；(C)添加 B. bifidum；(D)添加 L. paracasei

Fig. 4.9. Fluorescent microscopic photographs representing the displacement effect of the tested LAB on the adhesion of pre-adhered

FITC-labeled C. perfringens. (A) FITC-labeled C. perfringens (LAB-free group), FITC-labeled C. perfringens treated with (B) L. acidophilus;(C) B. bifidum;(D) L. paracasei, respectively

A B

C D

圖4.10、預先以 pH 4 酸液及 0.1% 膽鹽溶液處理之乳酸菌取代螢光 染色 C. perfringens 吸附之螢光顯微鏡照相圖。(A)LAB-free 組，螢光染色 C. perfringens；添加酸、膽鹽連續處理之(B) L.

acidophilus；(C)添加 B. bifidum；(D)添加 L. paracasei Fig. 4.10. Fluorescent microscopic photographs representing the

displacement effect of the tested LAB (pretreated with pH 4 acid solution and then 0.1% bile) on the adhesion of pre-adhered FITC-labeled C. perfringens. (A) FITC-labeled C. perfringens (LAB-free group), FITC-labeled C. perfringens treated with (B) L. acidophilus;(C) B. bifidum;(D) L. paracasei, respectively

A B

C D

Gueimonde et al., 2006)。Lee et al. (2003)研究中發現，益生菌取代病 原菌株之作用(displacement effect)與其本身競爭及預防吸附

(adherence inhibition)之能力是有差異的，且通常在與病原菌競爭排除試驗上，取代病原菌吸附之效果通常比預防其吸附之效果來的低，本研究也發現了相似的結果(圖 4.5，圖 4.8)。

第四節 β-半乳糖苷酶活性

各試驗乳酸菌株分別經pH 2, 3, 4 酸液及 0.1, 0.2, 0.3%膽鹽連續

作用後之β-半乳糖苷酶活性如表 4.6 所示。由結果得知各試驗菌株在

相同pH 值作用條件下，其 β-半乳糖苷酶活性隨著膽鹽濃度增加也增

加。

許多文獻指出膽鹽會破壞菌體細胞膜上雙層脂質結構，使細胞膜受到傷害(Adamowicz et al., 1991; Flahaut et al., 1996)，造成細胞膜通透性增加(Noh and Gilliland, 1993; de Valdez et al., 1997)，致使測得之 β-半乳糖苷酶活性也增加，因此可藉由測定 β-半乳糖苷酶活性來判斷細胞膜受破壞之程度。Taranto et al. (2006)探討不同濃度膽鹽對 L.

reuteri CRL 1098 細胞膜通透性之影響，結果發現其 β-半乳糖苷酶活 性隨著膽鹽濃度之提高而增加，而本研究也發現類似之結果。

此外，隨作用酸液pH 值降低 β-半乳糖苷酶活性也下降，推測可

表4.6、各試驗乳酸菌株以 pH 2, 3, 4 分別處理 3 hr 後再連續以 0.1, 0.2, 0.3%膽鹽分別處理 3 hr 後之 β-半乳糖苷酶活性(μmol/ml)

Table 4.6. β- galactosidase activity (μmol/ml) of the tested strains after the treatment of acid (pH 2, pH 3, pH 4) and then bile salt (0.1, 0.2, 0.3%), respectively.

*Control: β- galactosidase activity without the action of acid and then bile salt.

a-b Different letters within a column significantly differ at the 5% level, n=3.

w-z Different letters within a row are significantly different from the control at the same pH value (p＜0.05).

pH 2 pH 3 pH 4

Strain control^*

0.1% 0.2% 0.3% 0.1% 0.2% 0.3% 0.1% 0.2% 0.3%

L. acidophilus 0.085^aw 0.142^ax 0.319^ay 0.346^by 0.366^ax 0.685^ay 0.763^ay 0.680^ax 0.941^ay 1.024^ay B. bifidum 0.074^aw 0.272^ax 0.293^ax 0.424^ay 0.325^ax 0.403^ay 0.533^ay 0.398^bx 0.810^ay 1.066^az L. paracasei 0.058^aw 0.095^ax 0.236^ay 0.319^az 0.116^bx 0.335^by 0.450^by 0.178^bx 0.429^by 0.439^by

能原因為不同pH 值酸液導致菌體死亡程度不一，並使 β-半乳糖苷酶

失去活性所造成之結果；較低pH 值酸液之乳酸菌存活菌數較低，而

已死亡之菌體無法表現其受損細胞膜之β-半乳糖苷酶活性，因而所測

得β-半乳糖苷酶活性較低。

在文檔中乳酸菌經模擬胃腸道條件之酸與膽鹽作用後的基礎益生特性探討; Basic Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria after Being Treated with Simulate Gastrointestinal Conditions of Acid and Bile Salt (頁 81-93)