乳酸菌之耐酸性研究目前大多著重於對其在低pH 值條件下之耐受
性試驗，以生體外試驗模擬胃酸(pH 2)的環境條件來進行探討。臨床分
析顯示胃酸pH 值會隨進入胃中之食物種類和進入時間而改變，變化範
圍一般在pH 1.5-4.58 之間，而食物停留時間也會因食物種類及數量之不 同而異，一般之停留時間平均約2-3 小時(Insel et al., 2001)。胃酸之性質 與鹽酸類似，因此模擬胃酸多以鹽酸製備之。de Man et al. (1960)使用鹽 酸將MRS broth 調整其 pH 為 2.0-3.4 以之探討受試菌株之存活率；
Berrada et al. (1991)以發酵乳品提供禁食隔夜的健康成人食用，測定不同 時間胃內容物及活菌數變化；而 Toit et al. (1998) 以鹽酸調整不同 pH 值
(陳，2006) 圖2.6、B. bifidum 之掃描式電子顯微鏡圖(A)短桿狀形態(放大倍率 6500×); (B)Y 字形形態(放大倍率 10000×)
Fig. 2.6. Scanning electron micrograph of B. bifidum (A) rod shape (magnification 6500×); (B) Y shape (magnification 10000×)
A
B
圖2.7、L. paracasei 之掃描式電子顯微鏡圖(放大倍率 6500×) Fig. 2.7. Scanning electron micrograph of L. paracasei (magnification
6500×)
的MRS broth 以進行耐酸性菌株之篩選。菌株本身之耐酸性對於增加所 攝入菌株在腸道中之存活具有十分重要的意義。
4-2 乳酸菌之膽鹽耐受性研究
腸內膽鹽對微生物是一種抑制因子，膽鹽於阻止活菌進入下段腸道 中扮演著重要角色，Gilliland (1979)指出 Lactobacillus 對膽鹽之抵抗力 與棲息於腸道之能力有關。生體外試驗模擬膽鹽耐性之困難在於人體腸 道中膽汁濃度尚未有完整數據(Gilliland, 1989; Lankaputhra and Shah, 1995)，食物停留在腸道時間的長短也是影響菌體存活的一大變因。直接 利用人體膽汁進行試驗研究甚少，通常以牛膽汁(oxgall)模擬人體膽汁 (Klaver and Van Der Meer, 1993)，其成份包含 cholate, deoxycholate, dehydrocholate, cheno- deoxycholate, glycocholate,
glycochenodeoxycholate, glycodeoxycholate, taurocholate,
taurochenodeoxycholate, taurodeoxycholate 等。篩選具膽鹽耐受性之菌株 所使用的膽鹽濃度不一，其濃度範圍約為0.05% - 4% (Mayara-Makinen et al., 1983; Suskovic et al., 1997; Garriga et al., 1998; Kimoto et al, 1999;
Noriega et al., 2004)。雖然腸道中膽鹽濃度多變，但其平均值約為 0.3%
(Sjovall, 1959; Gilliland et al., 1984)；因此目前研究多以 0.3%模擬腸道中 膽鹽的濃度進行相關試驗(Gilliland and Walker, 1990; Noh and Gilliland, 1993; Chateau et al., 1994; Hyronimus et al., 2000; Mainville et al., 2005)。
4-3 乳酸菌吸附於腸道細胞之試驗模式
許多生體外試驗利用腸道細胞株進行乳酸菌吸附性試驗，如人類腸 上皮細胞株Int-407，人類結腸腺癌細胞株 Caco-2, HT-29 (Tuomola and Salminen, 1998; Bibiloni et al., 1999; Gopal et al., 2001; Fernández et al., 2003; Tsai et al., 2004)。
Caco-2 cell line 被廣泛使用在對人體腸道細胞的組織和功能研究上 (Zweibaum et al., 1991)，是一株由人類結腸腺癌所分離出來之細胞株，
其優點在於可以表現出體外型態及功能上的分化，並表現成熟腸道的特 性，包括極化(polarization)、具功能性的刷狀緣微絨毛及腸道上層的水 解酵素等(Pinto et al., 1983; Hauri et al., 1985; Peterson and Mooseker, 1992)，因此 Caco-2 cell 被認為是很方便的腸道細胞模式，且是研究細 菌對細胞的吸附和侵入之生化過程的極佳模式(Chauviere et al., 1992a;
1992b; Gopal et al., 2001; Lee et al., 2003; Matijašic et al., 2006)。
第五節 乳酸菌對產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)之競爭排除 作用
5-1 產氣莢膜梭菌之介紹
產氣莢膜梭菌之前稱為魏氏梭菌(Clostridium welchii)，為產孢、不
具運動性之革蘭氏厭氧陽性桿菌，其型態如圖2.8 所示，可於 20-50℃生
長。根據主要產生的致命毒素可分為5 類(A、B、C、D、E)，廣泛分布
圖 2.8、C. perfringens 之掃描式電子顯微鏡圖
Fig. 2.8. Scanning electron micrograph of C. perfringens
(Zhang et al., 2006)
於自然界的土壤、水、動物腸道中，其營養細胞是人體胃腸道與陰道中
的正常菌叢，可利用碳水化合物作為營養源。菌體耐膽鹽，不會被 20%
膽汁所抑制，當pH 值於 5.5-8.0 之間、2% NaCl 時並不會抑制其生長，
當NaCl 濃度達 6.5%時，則會明顯抑制其生長(Krieg and Holt, 1989)。
產氣莢膜梭菌為學者公認腸道中最常見的厭氧壞菌(Pyrtek and Bartus, 1962; Shimada et al., 1977)，其在腸道中對人體健康產生之不良影 響包括產生腐敗物質、致癌的促進物質等(顏，1990)，同時也是食品中 毒的原因菌之ㄧ，可藉由屠宰場之禽畜糞便污染屠體。感染後的潛伏期
約6-24 小時，發病時會有噁心、腹瀉及嚴重的腹痛等症狀。肉類、雞肉、
魚肉與其加工品是最常見之傳染原，食物中毒的原因通常是因為烹煮過 程沒有將孢子去活化，而將食物置於可讓孢子萌發的環境中。
5-2 產氣莢膜梭菌之致病機轉
(1)產生毒素
產氣莢膜梭菌的腸毒素是對熱敏感蛋白質，作用於後段小腸，其與 上皮細胞表面接受器結合後會改變細胞膜，導致體液與細胞內蛋白的流
失，分泌腸毒素的菌株通常具耐熱性，孢子在100℃加熱 1 小時後仍可
存活，因此更加強此菌於腸道之感染與致病率(蕭等，2004)。
(2)侵入性(invasion)
產氣莢膜梭菌會分泌許多致病性的外毒素與水解酵素，分泌α-toxin 與腸毒素的A 型菌株是人類感染最常見的致病菌(Brynestad and Granum, 2002)。α-toxin 是一種可分解哺乳動物細胞膜上卵磷脂成分的磷脂酶 (phospholipase C)，因此可溶解上皮細胞、紅血球、白血球及血小板，造 成侵入性。此病原菌是新陳代謝快之細菌，可製造蛋白酶、去氧核糖核 酸酶、玻尿酸酶與膠原蛋白酶等水解酵素，這些酵素會液化組織，促使 感染範圍擴大(蕭等，2004)。
5-3 乳酸菌之競爭排除作用
病原菌吸附至腸黏膜表面被認為是感染腸道的首要步驟(Beachey,
1981; Finlay and Falkow, 1997; Scaletsky et al., 2002)，因此抑制病原菌之 吸附可預防其感染及定殖於腸道(Tuomola et al., 1999)，已有許多生體外 試驗中証實乳酸菌可抑制病原菌吸附及侵入腸道細胞(Coconnier et al., 1993; Bernet et al., 1994; Lee et al., 2000; Fujiwara et al., 2001; Gagnon et al., 2004)。病原菌上之吸附因子可辨認腸黏膜上特定受體，因此益生菌
藉由與病菌菌競爭吸附位置或利用空間妨礙(steric hindrance)來抑制其 吸附(Coconnier et al., Tuomola et al., 1999; Fujiwara et al., 2001, Lee and Puong, 2002)。