1. Topo clonning
將心臟發育上三個非常重要的轉錄因子：tin、pnr、dmef2，取得 其cDNA，以 LA Taq (proof reading Taq)進行 PCR 反應，並設計 primer 將整段cDNA 放大，以洋菜膠電泳分離不同大小的 DNA 片段，選取 cDNA 全長大小的片段，挖下存有該片段之洋菜膠體，以 DNA/RNA Extraction Kit (Viogene) 將洋菜膠內的 PCR 產物萃取出來，進行 Topo cloning。
將萃取之PCR產物 0.5 μl，加入ddH2O 0.5 μl、Dilute salt 0.25 μl、
pENTR/TEV/D TOPO vector 0.25 μl，室溫下靜置反應 30 分鐘，便可 得到將PCR產物轉入pENTER/TEV/D的質體，隨即將質體以電穿孔 (electroporation)方式，轉型入大腸桿菌勝任細胞Top 10 內，以抗生素 Karnamycin篩選成功轉型的菌落，再以rTaq作PCR確認，無誤後大量 養菌，並純化其質體DNA (pENTR/TEV/D-gene X)。
2. LR Clonase II reaction
將下列三項依指定濃度、體積混合：
pENTR/TEV/-geneX 以 1X TE buffer 稀釋至 50 ng/μl 取 1.25μl；
目的質體 (pTWF 或 pDEST-17)以 1X TE buffer 稀釋成 150 ng/μl 取 0.25μl；LR clonase II (震盪兩次) 取 0.5 μl；混合後於室溫下靜置反
應1~2 小時，加入 0.25 μl proteinase K 於 37℃下反應 10 分鐘以終止 反應，便能得到標的質體 (pDEST17-gene X)。隨即以電穿孔方式將 標的質體轉入Top 10 勝任細胞中，以抗生素 Carbenicillin 篩選轉型成 功之菌株，以rTaq PCR 檢查再佐以 DNA 定序之方式，確認所轉入之 cDNA 序列正確無誤，以期能表現正確之轉錄因子蛋白 (Tin、Pnr、
Dmef-2)。
確定無誤後，大量養菌並抽取質體 DNA，純化後以電穿孔方式 將標的質體轉型入專司表現蛋白質之勝任細胞—BL21 (plyss)，準備 表現蛋白質。
3. 萃取 Tin、Pnr 及 Dmef2 等轉錄因子蛋白質
將轉型成功之 BL21 細菌以千分之ㄧ Carbenicillin 抗生素之 LB 培養液共10 c.c.作隔夜培養，隔天將菌液倒入 50 c.c.同樣含千分之ㄧ 抗生素之培養液中，於37℃培養至 O.D.600 約為 0.6~0.8 左右，加入 IPTG 至最後濃度為 1mM，放回 37℃搖 3.5 小時。取出後，將菌液倒
入50ml 離心管並以 4℃ 6,000 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，加入 2 ml 6xHis-Tag Binding buffer 劇烈震盪，加入 125 μl Protease Inhibitor Cocktail，以超音波震盪將細菌震碎，以 4℃ 14,000 rpm 離心 10 分鐘，
取上清液通樹酯管柱 (His-Tag Column)以純化蛋白。
4. 純化 6xHis-Tag 之蛋白質
準備好樹酯管柱，先以ddH2O洗一次後，加入Charge buffer靜置 10 分鐘，再以Binding buffer洗一次，便可準備純化蛋白。將離心好的
上清液全數吸入樹酯管柱內，均勻混勻後，搖4 小時~隔夜(4℃)，之 後以Wash buffer洗兩次，加入 200~300μl之Elution buffer靜置 10 分
鐘，以針筒將管柱內液體擠出，便得到純化完成之蛋白質，最後以 Bradfod試劑定量蛋白質，便可進行EMSA。
5. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA)
由Him enhancer 的後半段 2.2 kb 為模板，以 tin、pnr、dmef-2 之 轉錄因子接合認知序列搜尋，找到一個符合的認知序列，並向前後同 時延長，取總長約25 bp 的一段 DNA 如下：
Tin-5’ ATTGTAACGCACTTGAAGTGCACTC Tin-3’ GAGTGCACTTCAAGTGCGTTACAAT Pnr-5’ CAAGCGAAGCGATAGGGAGACATAT Pnr-3’ ATATGTCTCCCTATCGCTTCGCTTG
Dmef-2-5’ GTTATGTTTTATTTTTAATCCCACA Dmef-2-3’ TGTGGGATTAAAAATAAAACATAAC
將設計好的正反雙股序列加在一起升溫至 95℃，等 5 分鐘後，停止 加熱並使其緩緩冷卻，兩互補股便會慢慢結合成雙股序列。將雙股 DNA 稀釋至 2.5μM 加入 Binding buffer（15mM HEPES-KOH pH 8.0, 40mM KCL, 1mM EDTA, 0.5mM DTT, 5% Glycerol）最後加入定量濃 度的純化蛋白(Tin、Pnr、Dmef2-)總體積為 20 μl，室溫下靜置反應 30 分鐘，然後立即以 6% acrylamide Gel/0.5X TBE 以電壓 80V 先跑 10 分鐘後，再以 120V 跑至 60% ~ 70%，以千分之ㄧ濃度的 SYBR Green (染 DNA)染色 20 分鐘，用一次水洗 10 秒兩次，便可照相；或 者染SYPRO Ruby (染蛋白質)隔夜，再退染後以 Typhoon 照相 (Ryan, 2007 #12; Grove, 1998 #25; Jing, 2003 #128; Gajewski, 2001 #33;
Stronach, 1999 #129)。