由 in situ 來看 Him 跟 tin 的 RNA 時空表現，在胚胎 9~12 時期 Him 的表現皆比 tin 稍晚，暗示 Him 在胚胎發育前期是受 tin 的活化；
而在晚期15、16 時期，Him 與 tin 則是共同侷限於心臟細胞，其餘外 胚層僅剩零星的表現。由此可知，在胚胎晚期心臟即將發育成熟時，
tin 與 Him 共同參與調節心臟發育的角色。
Him enhancer 序列具有高度保守性
藉由基因體資料庫搜尋與軟體的分析 (Fig. 5)，我們發現 Him 上 游區域enhancer 2.2kb 的區域，密集的存在許多與心臟發育有關的轉 錄因子認知序列，例如Tin、Pnr、Mef2。並藉由 EMSA 的實驗結果，
也證明了純化後的轉錄因子蛋白，確實會與設計好的Him enhncer 片 段序列結合 (Fig. 6)。然而作了四種不同品系果蠅的同源比對之後，
在與 D. melanogaster 親源關係較遠的 D. ananassae 仍然在 D-Mef2 (-75)與 Tin (-206)兩個位置的轉錄因子認知序列，有完全相同的保守 性，而越往上游的認知序列，其保守性越低，可見Him enhancer 受到 調控的序列，應以靠近轉錄起始點 D-Mef2 (-75)與 Tin (-206)這一段最
為重要，次者為 D-Mef2(-1023)、Tin(-1111)，最後則為 Tin(-1346)以 及二個Pnr (-1645、-2323)。本實驗室將 Him-en 2.2 此段 enhancer，以 primer 做分段夾出，再重組成 enhancer reporter 並做成基因轉殖果蠅 做分析(Lin, 2004 #130)，僅包含兩個 Pnr 認知序列片段的 enhancer (-2414~-1591)沒有任何螢光表現，若是只含有 D-mef2 (-75)及 Tin(-206) 的段落(-17~-619)，因為單獨的 Tin 不起作用，所以其螢光表現僅由 單一D-Mef2 所誘導，故其螢光也侷限表現於中胚層肌肉細胞與心臟 細胞的cardial cells ，圍心細胞 (pericardial cells)則無螢光表現。但若 將(-1723~-17)此段 enhancer 擷取下來，其螢光表現就與原長 2.2 kb 的 螢光表現類似，此實驗佐證了由親源關係上所得的推論 (Lin, 2004
#130) 。
Him enhancer 直接受 tin 的調控
為了進一步探究各轉錄因子與 Him 表現的關係，藉由 Posakony 實驗室所發表的Him en-2.2 reporter 為背景(Rebeiz, 2002 #17)，也因 為其綠螢光表現與in situ 或抗體表現非常接近(Liotta, 2007 #31)，可 以用來作為 Him 基因表現的指標。藉由外胚層的單獨異位表現 tin、 pnr 與 d-mef2，只有 tin 能間接活化 Him en2.2 使其在外胚層出現綠營 光，其他兩者則沒有像 tin 的情形。此現象表示 Him en2.2 在單獨三
種轉錄因子中，僅有 tin 能活化這一片段的表現，而其他兩者 pnr 與 d-mef2 則無法單獨活化 Him en2.2。若從 loss of function 來看，在中
胚層分別單獨降低前述三種轉錄因子表現，只有tin 和 pnr 的 dominant negative 皆會影響心臟細胞的綠螢光表現，使原本 Him en2.2 在心臟
內所現的螢光，大幅降低，而無法藉由綠螢光觀察到完整的心臟，但 d-mef mutant 的遺傳背景下，還是可以觀察到正常的螢光表現。因此，
總和以上的實驗結果作一個初步的推論，在Him en2.2 中，tin 扮演主 要的 activator，而 pnr 與 d-mef2 則扮演輔助性的角色，而缺乏 d-mef 的遺傳背景之下，Him en2.2 的螢光表現不受影響，只能說明 tin 與 pnr 所調控這段 enhancer 的能力是獨立於 d-mef2 之上的，因此即使在 d-mef2 null mutant 的情況下，僅僅靠 tin 與 pnr 便能活化 Him，但並
不能說 d-mef2 對於 Him 是不重要的，由 Liotta 與本實驗的研究皆證 明 Him 與 d-mef 彼此間具有交互作用的關係，且 Him 的 enhancer 上 具有兩個保守性相當高的 Dmef2 認知序列，Him 與 d-mef 之間的關 係必須要再由進一步的實驗來證明，例如進一步以S2 cell culture 做 reporter assay。
Him 在 Notch pathway 上所扮演的角色
由 Liotta 所發表的研究，認為 Him 的 C 端所具有的 WRPW 序列，
能與Gro 之 coprpressor 結合後才有抑制肌肉的作用，加上 Rebeiz 發
現Him 的 enhancer 上具有四個 Su(H ) binding sites，因此Him 應為 Notch signal pathway 的成員之ㄧ，但 WRPW 這個 motif 會抓一個 Gro
並與一些 bHLH 及 repressor 共同作用，但 Him 的胺基酸序列本身並 無bHLH domain，也就是說 Him 本身並不直接與 DNA 結合。具有像 果蠅Him 這樣特性的基因也在脊椎動物中被發現，Ripply1 就是一個 在N 端具有 WRPW domain 但是本身又不具有 bHLH 序列的蛋白，他 的角色很可能是結合 Gro 與 DNA binding repressor 形成一個大的 repressor complex 的中間者(Kawamura, 2005 #131)，因此 Him 的角色
或許跟脊椎動物的Ripply1 同屬於一個平行演化的地位 (Rebeiz, 2002
#17; Liotta, 2007 #31)。在本研究中，Him 的 enhancer 會受到 tin 的直 接調控，在原本不表現 tin 與 Him 的外胚層，異位表現 tin 時，可以 引發Him en 2.2 的螢光，也就是說 Him 為 tin 的下游基因，直接受到 tin 的活化而表現基因產物。而 tin 屬於 Dpp 與 Wg 共同調控 pathway
的成員，果真如此，那便意味著Him 可能為 Dpp-Wg 與 Notch 兩種截 然不同的訊息傳遞路徑的交會點，是一個十字路口的關鍵角色。文獻 指出，如果在缺乏Notch 的影響下，藉由 Dpp-Wg pathway 成員的影 響，細胞便朝向心臟專一的先驅細胞分化；相反的，若是Notch 訊號 影響之下，即會抑制心臟細胞走向特殊分化的命運，不論 Dpp or Wg 的訊息是否已存在都不影響。(Zaffran, 2002 #114) 換句話說，Him 所
在的十字路口，或許便由是否受到Notch 的訊息調控，來扮演抑制心 臟細胞生成的角色。
心臟細胞的組成是透過不對稱的細胞分裂來分化不同命運的細 胞，例如心肌細胞（myocardial cells）及圍心細胞 (pericardial cells) 的形成，是由一個心臟先驅細胞經由不對稱的細胞分裂分化為二，一 個是將來分化為心臟細胞的先驅；而另一個則是將來走向為心細胞的 命運。此作用的分子機轉為Numb 在細胞內抑制 Notch 造成 Notch 分 佈的不平均，在細胞分裂的過程即分裂為不同的細胞命運的兩個細胞 (Su, 1999 #83)，例如在 numb 的突變底下，odd-positive-pericardial cells 會變多，是因為svp-myocardial cells 轉變導致 (Ward, 2000 #94)。本 實驗中，Him 的過度表現與降低表現所導致的心臟細胞數目便少或增 多，卻似乎無法觀察到不對稱分裂的現象，這跟已知的Notch pathway 不相符，或許是，就我們使用的分子標誌來看，anti-D-Mef2 只能染 到果蠅的心臟細胞，而anti-Tin 包括心臟與圍心細胞都能染到，由這 兩個心臟細胞的分子標誌，並無法清楚區別出果蠅的心臟與圍心細 胞，所以使用更多的細胞標誌也許是個釐清的方式。此外，更進一步 的做reporter assay 與 Chromatin IP 也可以再進一步的分析，以上實 驗所不足之處，這也是未來亟待進行的工作。