Him受Tin基因調控抑制心臟細胞分化

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. Him 受 Tin 基因調控抑制心臟細胞分化 Him is regulated by Tin to suppress cardiogenic cell fate. 研究生：郭明偉 Ming-Wei Kuo. 指導教授：蘇銘燦博士 Ming-Tsan Su. 中華民國九十七年七月.

(2) 目次 Abstract………………………………………………………...………3 壹、中文摘要…..…………………………………………....…...…….5 貳、緒論一、二、三、四、. 先天性心臟病……………………………………………………7 果蠅的心臟發育過程……………………………………………8 研究果蠅心臟發育的重要性……………………………………9 研究背景……………………………………………..…….……10. 參、研究目的………………………………………………………….17 肆、材料與方法一、果蠅胚胎收集與固定………………………………….…………18 二、果蠅胚胎原位雜合染色……………………………….…………18 三、基因轉植果蠅品系之建立………………………………….……20 四、果蠅胚胎的顯微注射…………………………………….………22 五、Electrophoresis Mobility Shift Assay(EMSA) ………..….………23 六、Him 基因的 enhancer 在果蠅心臟表現之研究……………….…26 伍、結果一、果蠅胚胎組織化學染色……………………………..……….…28 二、果蠅胚胎原位雜合染色………………………………….………28 三、Him gene enhancer 同源序列之分析……………........….....……29 四、EMSA…………………..............................................................…30 五、Him 基因的 enhancer 在果蠅心臟表現之研究…………….……30 陸、討論一、 Him enhancer 序列具有高度保守性………….…………...........32 二、 Him enhancer 直接受 tin 的調控………………………….....…33 三、 Him 在 pathway 上所扮演的角色……….……………......……34 柒、參考文獻………………………………………………………..…37 捌、附圖……………………………………………………………..…41. 2.

(3) Abstract The homeobox containing gene, tinman (tin) plays an important role in heart development as well as cardiac function of Drosophila. Loss of tin function during embryogenesis, leads to the abolishment of heart precursor cells and the mature heart. However, depleting the function of tin at late embryogenesis, the heart formed initially, but lack of various cardial cell types. Thus, the heart can not perform normal physiological function. This suggests that tin is required early for the specification of cardial precursors, lately for the diversification of cardial cell and function. It is believed that tin can not act alone in all aspects of developing heart. It has been proposed that tin exerts its function by activating down-stream genes or acting synergistically with other genes to fulfill its role for the formation of functional heart in Drosophila. In this study, we have identified a cardiogenic gene, Him, that may act downstream of tin. Like tin, Him exhibits pan-mesodermal expression pattern but its expression is later than that of tin. Later, the expressions of tin and Him are restrict in cardiac cells and pericardial cells. Comparing the dynamic expression patterns of both tin and Him, we hypothesized that Him is a downstream target of tin. Furthermore, we have found that down-regulation of Him by RNA interference promotes cardial cell fates. By contrast, mesodermally specific expression of Him suppresses cardial cell fate. This suggests that Him functions as a cardial cell suppressor. Since the both expression patterns of tin and Him are overlapped, we believed that Him may be a directed target of tin. The cardial specific enhancer of Him has been identified. Sequence analysis revealed that three tin consensus binding sites are present in the enhancer regions. The 3.

(4) enhancer activity was down regulated in tin mutant background or when dominant negative allele of tin are co-expressed. By contrast, ectopic tin activates Him cardial enhancer. In addition, Tin can binds to the consensus binding sites in vitro. Thus, we concluded that tin is a direct upstream regulator of Him.. 4.

(5) 壹、中文摘要：果蠅的基因 tinman (tin)與脊椎動物之 Nkx2-5 為同源基因，扮演著果蠅的心臟發育與維持功能的樞紐角色。胚胎發育時，如果 tin 的功能缺失，原本將形成心臟的先驅細胞亦會跟著缺失，導致心臟無法發育成熟；可是在胚胎發育晚期，tin 的功能缺失卻只導致各式心臟細胞的型態異常，而使心臟無法發揮正常功能。這表示 tin 在胚胎發育早期是心臟先驅細胞進行特化所需，而在晚期則專司功能之分化。普遍相信，tin 應非單獨直接作用在心臟的細胞，而是籍由活化許多下游基因，或與其他轉錄因子協同合作以達到健全果蠅心臟形態與功能之目的。在本研究中，我們發現了一個受 tin 調控，並且跟心臟生成相關的基因—Ｈim。Ｈim 基因在中胚層之表現，類似但稍晚於 tin，並在胚胎發育末期，tin 與 Him 共同表現於心臟與圍心細胞之中。比較 tin 與 Him 基因表現的樣式，我們提出一個假設：Ｈim 是受 tin 所活化而影響的下游基因。我們發現藉由 RNAi 降低 Him 之表現量會促進心臟細胞之生成；相反的，在中胚層專一提高 Him 基因的表現量，卻會抑制心臟細胞的生成。既然 tin 與 Him 兩者的表現位置互相重疊，我們認為 Him 可能是 tin 下游的直接標的。有關 Him 與心臟相關的專一性加強子已被鑑定出來，序列分析比對發現三個 tin 的認知結合序列存在 Him 的加強子區域中。在 tin 的突變株遺傳背景底下，或. 5.

(6) 者共轉一 tin 競爭型抑制基因，皆會降低 Him 強化子的活性。反之，異位表現 tin 卻能活化 Him 與心臟相關的強化子。另外，分生實驗證明 tin 能與 Him 強化子上具保守性的認知序列接合。因此，我們推斷 tin 是 Him 的上游調控者。. 6.

(7) 貳、緒論一、. 先天性心臟病. 心臟位於胸腔，是動物體血液循環的幫浦。在胚胎發育過程中，只要稍有差錯，就會導致心臟型態與功能上的缺失，一般稱為先天性心臟病，換句話說，也就是胎兒心臟形成受阻、發育不正常所導致。根據現有資料顯示，世界各地先天性心臟病的罹病率皆非常相近，大多為千分之 6.25 至千分之 10.45。在死產兒的報告中，先天性心臟病的罹病率約為 3.2 至 3.4％ (Chiu I.S., 1988 #85)。而 1976 年就新莊地區國中小學童 10,321 人及隨機抽樣台北市民 9,425 人作調查，發現約每 1,000 名學童患有先天性心臟病者 2.4 人；每 1,000 名住民中有 2.5 人，無男女差別 (Lue H.C., 1976 #84) 。呂,孟,沈等台大醫院等十個醫院小兒心臟醫師於 1986 至 1989 年就台北市國小、國中及高中學生做全面的心臟篩檢，所獲罹病率為千分之 3.9 至 5.1 (Lue H.C., 1986 #86)。先天性心臟病的原因是包羅萬象的集合，綜合環境和遺傳的因素造成的，包括藥物、荷爾蒙、輻射線、病原體感染及母親的飲食習慣等環境因子；遺傳方面例如基因或染色體的異常，相當複雜。但先天性心臟病跟遺傳變異或基因的調控缺失有絕對的關聯。受限於無法直接以人體作為實驗材料，以往研究人類心臟發育的遺傳或基因調控，只能藉由臨床的病理研究，但基因體時代的來臨讓我們有了新的. 7.

(8) 發展─許多親緣關係看似很遠的物種，例如：人、小鼠、非洲蟾蜍、果蠅、斑馬魚、乃至於線蟲等，在許多重要的調控基因上皆有著相當程度的保守性，這些基因被稱為 Homeobox genes。以其他物種來研究基因的調控早已被廣泛使用，而果蠅被作為模式動物的歷史更是悠久，此物種幾乎是近代遺傳學的礎石，由於果蠅容易繁殖、生活史短、突變株眾多、前人開發出相當完整的遺傳操作技術，加上果蠅基因體計畫的完成，再再顯示果蠅在遺傳研究方面當模式動物的長處，而果蠅的心臟發育的調控基因已被證實與脊椎動物具有一定的保守性 (Ryan, 2007 #12) ，在型態發生上果蠅與脊椎動物的心臟也有許多類似之處(Cripps, 2002 #34) 。. 二、. 果蠅的心臟發育過程：中胚層在胚胎發育的過程中扮演特別的角色，母系基因轉錄. 因子 Dorsal 直接活化 twist 和 snail 在整個中胚層表現，因此中胚層細胞得以在 gastrulation 時內陷並往兩側分佈，形成和外胚層並列的單層細胞。之後，twist 會表現模組化的條紋（strip）區域，每一節有高度表現的 twist 區及低度表現的 twist 區域，量低的部分未來會發育成內臟肌肉和脂肪體，而量高的部分未來會發育成心臟和體壁肌肉 (Baylies, 1996 #27) 。將來要發育成背血管的心臟先驅細胞會有計畫. 8.

(9) 的由胚胎兩側移動到背部中線，在這個背部癒合的過程稱之為 dorsal closure (Stage 17)，這個過程因基因網絡的活化使許多細胞特化成心肌細胞和圍心細胞，共同組成背管（dorsal vessel），功能近似於哺乳類的心臟及主動脈。背管每一體節由兩排各六個心肌細胞構成， A1-A7 七節的六個心臟細胞都會表現轉錄因子 ─ ─ Myocyte enhancer factor 2（Mef2）；但其中卻只有四個表現 tinman（tin），剩下兩個則表現 seven-up (svp）。四個表現 tin 的細胞中，有兩個細胞也會表現 homeobox gene ladybird（lb）(Cripps, 2002 #34)。在成熟的背管這兩列（左右各二）細胞相互接觸融合成為果蠅的心臟，因此脊椎動物心臟發育的前期基本上與果蠅有類似的過程── 均是由中胚層的兩側形成並於中線部分癒合成管狀，不過果蠅形成的心臟靠背側，而脊椎動物心臟靠腹側，但是到後期脊椎動物還會有進一步捲曲、形成腔室而有所不同。並且，在心臟收縮的功能上，果蠅與脊椎動物的心臟都是單核的心肌細胞。因此，無論是就功能上、型態上、器官發育的過程，果蠅都是很好研究心臟發育的模式動物 (Bier, 2004 #8; Cripps, 2002 #34) 。. 三、. 研究果蠅心臟發育的重要性. 比較果蠅和脊椎動物的心臟發育之分子遺傳路徑，許多控制心臟. 9.

(10) 細胞形成和心肌細胞特化的分子和機制是相連或平行的，許多果蠅和脊椎動物的心臟發育基因具有相同的功能，例如影響果蠅心臟發育的 tinman 基因與影響脊椎動物心臟發育的 Nkx2-5 系列基因，兩者為同源基因，在序列上、心臟表現模式上以及功能上皆有很高的相似度。 GATA factors 是一群轉錄因子，彼此之間藉由高度保守的 zinc-finger DNA binding domain 交互作用，在果蠅上的同源基因為 pannier (pnr)。實驗證明，將脊椎動物的同源基因 Nkx2-5 和 GATA4 基因轉殖到相對的果蠅同源基因突變株 tin 和 pnr 之突變果蠅身上，可以使突變果蠅恢復正常。因此，研究果蠅心臟發育相有助於對脊椎動物心臟發育的瞭解，進一步針對人類先天性心臟病作研究，以期未來能藉由心臟病早期治療促進人類的健康。. 四、. 研究背景. tinman 參與果蠅心臟發育形成：所有心臟細胞的特化都需要tin，tin 轉錄出一種 homeodomain 轉錄因子，tin 的表現最早能在 gastrulation 時被偵測到，而在果蠅胚胎發育stage 4 ，stage 5 廣泛的分佈於中胚層(mesoderm)，stage 9 漸漸局部表現於背側中胚層(dorsal mesoderm)，此處細胞將來發育成為心臟。若失去tin gene的功能則會導致背血管先驅細胞(dorsal vessel. 10.

(11) precursor) 缺失，midgut musculature不發育，連背側肌肉也無法形成，但鄰近的somatic mesoderm及fat body卻不受影響，tin突變株會於胚胎發育的末期死去，可能是因為胚胎缺乏心臟之發育而喪失循環功能的緣故，這顯示tin的功能對於果蠅的背側中胚層組織發育是必須的 (如：心臟)，但tin不像果蠅眼睛發育的關鍵基因eyeless，異位表現 (ectopic expression) 時到處長出眼睛，如果單獨異位表現 tin並不會任意產生心臟，由此可見tin的表現在心臟發育是必須的，但心臟發育的過程並不是只有tin單獨作用，需要有其他基因的參與協同作用，欲了解心臟發育的基因網絡，則解開tin之上下游基因網絡關聯性變成為十分有趣的問題(Lockwood, 2002 #66)。早在胚胎stage 8 時期，tin mRNA 局限於dorsal mesoderm，而dorsal mesoderm將來會發育為cardiac、 visceral muscle，此時的tin受到Decapentaptegic (dpp)（為BMP家族成員之ㄧ）的間接活化，dpp為一分泌性蛋白，從dorsal ectoderm分泌的 Dpp，其功能可能是讓心臟特化表現在中胚層的背側位置，此時tin的表現亦會受到tin自身的調控，tin的表現亦受到dpp的維持，且在 visceral mesoderm 的一些細胞， tin 活化了 bagpipe 促使了 visceral mesoderm fate的分化 (Yin, 1998 #23; Lockwood, 2002 #47; Reim, 2005 #35)。另一同為分泌性蛋白質wingless(wg)(與脊椎動物的wnts類似)，亦從ectoderm分泌，缺乏wg 就沒有dorsal vessel產生，在中胚層. 11.

(12) 裡，wg的功能是促成背血管的特化，表現在外胚層的wg卻與心臟形成的決定有關，wg與之前提及的dpp可能透過相同的方式促成果蠅背血管的產生，在stage 9~11 時，Dpp、Wg兩者依序的表現在外胚層，其重疊區域下的中胚層為tin表現之所在，為共同促進tin於中胚層的表現，間接使心臟先驅特化；若異位表現tin於Wg、Dpp表現的外胚層，竟也促使外胚層細胞走向心臟的細胞命運，暗示Dpp與Wg此兩個分泌蛋白經由Tin讓心臟表現及特化在中胚層的位置 (Lockwood, 2002 #66; Bodmer, 1993 #7)。Tin 本身可認知並接合一段保守性的DNA認知序列：5’-TYAAGTG-3’，且同時兼具活化及抑制轉錄表現的功能，就目前而言共有四個Tin的目標基因已被鑑定出來：tin本身、pnr、 d-mef2 和構造基因β3-tubulin，總歸來說以上基因均有兩個Tin的結合位，且需要同時被兩個Tin協同結合這些enhancer才有作用(Reim, 2005 #35; Ryan, 2007 #12)。Tin的目標基因的功能均跟心臟的發育具有高度相關，如：Tin活化pnr. Pnr協同Tin活化d-mef2 促使心臟的分化；或是 β3-tubulin受Tin活化表現於成熟的心臟，這些基因除了受tin的直接調控外，它們亦協同tin去活化下游基因的表現，tin本身亦受自身的調控 (Gajewski, 2001 #33; Gajewski, 1999 #37; Gajewski, 1998 #36)。. pnr 參與果蠅背管形成. 12.

(13) pannier (pnr)在發育早期受到 dpp 的活化，但是在胚胎發育 stage 10 之後，pnr 反變成 dpp 的上游調控因子。pnr 功能在活化有關 dorsal closure 的表皮細胞內的 Dpp pathway，來影響胚胎 dorsal closure。Pnr 對於中胚層 tin 的啟動的特化也是必要的，Tin 和 Pnr 必須同時存在才能誘導心臟的專一特化 (Lockwood, 2002 #66)。在 pnr 突變果蠅胚胎中，Dpp 濃度降低，心臟細胞變多，但圍心細胞及其它由中胚層發育而來的組織變少了。據文獻指出，pnr 突變的胚胎 dorsal closure 有缺陷，在背板上會有一個洞。pnr 和 u-shaped（ush）的作用是息息相關的，在發育的過程中，Pnr 和 Ush 的功能在 GATA factor 的調控上是互相拮抗的。Friend of GATA (FOG) 蛋白負責調控 GATA factor 活化基因的轉錄，果蠅的 ush 和 fog 是同源基因。Ush 在胚胎時期要能正常調控眼睛、血球、心臟的發育需要 GATA factor 的幫忙，在果蠅 pnr 即是扮演這個 GATA factor 的角色 (Fromental-Ramain, 2008 #15)。. Mef-2 調控果蠅心臟肌肉之生成與分化影響心肌分化主要的轉錄因子是 D- Mef2，它在胚胎各種肌肉發育時扮演中心角色。D-Mef2 的表現在中胚層早期是 Twist 的目標基因(Taylor, 1995 #106)，稍微晚一點時，Dpp 訊息使它大量表現在背部中胚層，再來會被 Tin 活化。胚胎發生的最後，每個半節中有四 13.

(14) 個表現 Tin 的心臟細胞會持續活化 D-Mef2。如果缺少 D-Mef2 的功能，許多肌肉構造基因包括 Myosin heavy chain、Myosin light-chain alhali、Myosin light-chain 2、和 Actin57B 等無法表現，推測 D-Mef2 是透過這些基因來控制心臟的分化(Lilly, 1995 #30)。. Him 的研究背景 Him gene 的發現者為 Rebeiz ，於 2002 年使用軟體搜尋特定轉錄因子的 cis-regulatory modules 的方法，搜尋果蠅的 genome 中 Notch-regulated transcription factor— Suppressor of Hairless [Su(H)]的轉錄因子認知序列，找到一群基因中，有一未知片段位於名為 Her 的基因 5’端上游區域，有很密集的 Su(H) binding sites，但將 Her 5’ 包含 promoter 的上游區域以螢光基因做 enhancer assay，卻沒有綠螢光的表現，推論此段高度密集之 Su(H) binding site 序列，應該不是 Her 調控片段，於是往反方向找，發現一相鄰基因編號 CG15064，以同樣方式分析包含此段區域的 3’的 promoter 及上游部分的 enhancer assay 發現確有螢光表現，於是推斷此處調控著 CG15064，而非 Her，由於此基因尚未命名，於是命名為 Him (Rebeiz, 2002 #17)。詳細分析 Him 基因的 5’上游部分，除了確如 Rebeiz 所述有著密集的 Su(H) binding sites 及七個可能為轉錄因子 Twist binding sites，而 twist 基因為調控中胚層分化的關鍵，若 Him 的表現受到 twist 的調控，則 Him 14.

(15) 可能同樣為中胚層發育─果蠅的心臟及肌肉相關的基因。Rebeiz 所作綠螢光 enhancer assay，觀察到心臟細胞有螢光的表現，暗示 Him 基因在心臟發育扮演某種特定的角色，且 Rebeiz 在分析 Him 的序列時，發現 Him 蛋白的 C 端具有 WRPW 四個獨特的胺基酸序列，此段胺基酸被認為可與 Grocho (Gro) 的 WD 兩個特殊胺基酸結合成為 repressor，而產生抑制的功能，此外 WRPW 之胺基酸序列亦被公認為 Hairy family 所具有的特徵，屬於 Notch pathway 的成員 (Jennings, 2006 #127)。所以 Him 極可能是扮演抑制的角色，加上其 enhancer 上游端具有密集的 Su(H) binding site 序列，顯示其與 Notch pathway 的密切關聯。另一篇關於 Him 的文獻報導為 2007 年 Liotta 發現 Him 會與 d-mef2 共同參與肌肉形成的調節，並且互相拮抗，d-mef2 在中胚層肌肉細胞的調節佔有舉足輕重的地位，但若增加 Him 的表現，會使肌肉出現空洞化的現象，亦即 Him 會抑制肌肉的生成。這一點證實了 Him 為 repressor 的事實。Liotta 的研究更進一步發現 Him 的胺基酸序列當中具有一段 NLS 序列，使 Him 表現後會被運送至細胞核內。此外，將 WRPW 剔除掉後的 Him，會喪失與 Gro 結合的功能，且 repressor 的效果亦大打折扣。若在 Gro mutant background 底下大量表現 UAS-Him，同樣無法對肌肉合成有抑制的效果，因此，Him 必須有 WRPW 之功能片段並與 Gro 結合後，才能對肌肉的合成有所. 15.

(16) 抑制 (Liotta, 2007 #31)。. 參、研究目的 16.

(17) 由前人所建立的兩篇 Him 基因相關研究，Him 已被歸類為 supressor，並對肌肉細胞有抑制的效果。但在果蠅心臟發育方面，仍無人著手研究，而就 Him 序列的比對來看，控制果蠅心臟發育的基因 tin 及 pnr 與 dmef-2 皆有可能參與其中，Him 基因是否真的被這些基因所調控也尚未證明。因此，本研究將目標鎖定於，心臟細胞相關的轉錄因子 tin 及 pnr 與 dmef-2 對 Him 基因的調節為何?. 肆、材料與方法 17.

(18) 一、果蠅胚胎收集與固定將標的果蠅品系收集於籠子(cage)中，並以 3 %洋菜膠體收集果蠅胚胎於適當的發育時間內（0~16 hours），以 50 %漂白水脫殼兩分鐘，再以 1：1 體積的 heptane 及 4% formaldehyde/PBS Buffer 固定二十分鐘，去掉下層液體，加入等體積的 methanol，劇烈震盪三十秒，去除卵膜，將瓶中的溶液吸乾，留下瓶底已脫膜的胚胎，以 methanol 清洗，最後以 70% ethanol 保存至-20℃待進一步染色使用。. 二、果蠅胚胎原位雜合染色(in situ hybridization ) 1. Him-exon1 RNA probe 製作使用一對 Him exon 1 引子: 5’CTACAAGATACYGAAGCAGCAACG、 3’CCAGCTCCTCCTTATCCTTG ，以抽出之果蠅全基因體做聚合酶鏈連鎖反應(PCR)，反應條件為：94℃ 5 分，94℃ 30 秒、50℃ 30 秒、72℃ 30 秒進行 30 個循環，72℃ 2 分，放大產生一段全長為 215 bp的DNA片段，將此PCR產物以T7 promoter讀起為正股的方向插入質體PCR II – TOPO vector (Invitrogen)，使用限制酵素Not I 將質體切為線型，以SP6 RNA polymerase進行 In vitro Transcription ，並使用帶有labeled digoxigenin的UTP之NTP，產生的RNA 探針即帶有labeled. 18.

(19) digoxigenin，得到 20 μl的RNA探針，將所得產物加入 1 μl DNAse於 37℃反應 15 分，然後加入 30 μl RNAse free water將總體積加到 50 μl 加上 5 μl 5M ammonium acetate 混合加入 150 μl 100％ ethanol，於 -20℃靜置 30 分，再於 4℃ 14,000 rpm 離心 15 分，去掉上層液，加入 150 μl 70％ ethanol，於 4℃ 14,000 rpm離心 15 分，去掉上層液，真空乾燥，加入 30 μl RNAse free water，以光度計測定量濃度，並以 probe resuspension buffer (10ml含 5 ml formamide、0.5ml 10X TE pH7.4、4.4ml ddH2O 、0.1ml 10% Tween)將濃度調整為 25 μg/ml，作為 50 倍的stock，保存於-20℃。. 2. 果蠅胚胎的原位雜合染色將固定保存好的果蠅胚胎取出，去除 ethanol，以體積 3：1 (methanol：4% formaldehyde in PBS) 搖 2 分鐘，然後以體積. 1：3. (methanol：4% formaldehyde) 搖 5 分鐘，以 4 % formaldehyde 固定 10 分鐘，用 PBT 洗三次，加入 hybridization buffer 室溫下搖 1 小時，吸去 buffer，加入 hybridization buffer with dextran sulfate 及稀釋為一倍的探針於 60℃雜合過夜。加入少許wash buffer，待胚胎沉澱至底部，去除buffer，以體積 1： 1 (wash buffer：PBT) 於 60℃搖 30 分鐘，再於室溫中以PBT洗三次，. 19.

(20) 加入TAE buffer搖 5 分鐘，放入電泳槽電泳 50V 60 分鐘，將胚胎取出以PBT洗三次，加入 2% BSA (in PBT) blocking 1 小時，以稀釋比 1： 2000 anti-digoxigenin-AP 抗體於室溫下雜合兩小時，以PBT洗九次，加入AP buffer (5ml含 100μl 5M NaCl 250μl 1M MgCl2、500μl 1M Tris pH 9.5、25μl 20% Tween 、4.125 ml ddH2O ) 將胚胎潤濕兩次，以AP buffer搖 5 分鐘，加入含 0.9μl Nitro Blue Tetrazolium (NBT) 及 0.7μl Bromo-Chloro-Indolyl-Phosphatase(BCIP)並以AP buffer稀釋成總體積 200 μl之呈色液，置於 4℃避光至隔夜，待呈色完成以PBT洗三次，置入 30% glycerol保存或照相。. 三、基因轉植果蠅品系之建立 1. GAL4-UAS system GAL4-UAS system 是被用來在特定時間空間表現所需基因的設計產物，含酵母菌的轉錄因子”GAL4”之基因被插入果蠅的 genome 中，此基因的活化受到插入點附近的 enhancer 或人工置入特定組織專一性的 enhancer 所調控，而 UAS（upstream activation sequence）則是一段會受到 GAL4 蛋白質所接合的序列，接合後會活化表現 UAS 的下游基因，故選擇不同 GAL4 品系之果蠅來表現 GAL4 蛋白於特定組織或時空，再跟帶有不同 UAS 序列特定基因的果蠅品系交配所得下一代，就會於特定時空表現 GAL4 並且驅動 UAS 下游基因，達到異 20.

(21) 位表現(miss-expression)特定基因的效果。. 2. Him cDNA- pUAST vector construct 使用 primer Him cDNA 5’： GCCGCCACCATGGGCGTCATCTACAAGATA primer Him cDNA 3’： GCTCTAGACTACCAAGGTCGCCACA 以 Him cDNA 為模版進行 PCR 夾出一段 935 bp 之片段，將此 PCR 產物轉入 pCR II – TOPO vector (Invitrogen)，利用大腸桿菌之 Top 10 勝任細胞進行轉型作用，再用限制酵素 XhoI，檢查長度挑選一菌落其質體切出有一段為 460 bp 之菌落，挑出大量培養，並純化抽出其質體 DNA，使用 KpnI、XbaI 切割，挑出切下片段約 950 bp 的 DNA，接上同時以 KpnI、XbaI 切割的 pUAST 質體。完成之質體在 UAS 序列後為 Him 基因的 cDNA 序列，接著進行顯微注射，得到基因轉殖果蠅株，再與特定時空表現 GAL4 的果蠅株交配，即可讓 Him 基因表現於所想表現的特定時空。. 3. Him RNAi transgene fly 此亦是利用 miss-expression 原理，表現指定基因的片段，所不同的是所表現的基因訊息核醣核酸（mRNA)，會形成 dsRNA 進而產生 RNA interferon，使內生性的 mRNA 被破壞，導致該基因表現量下降。 21.

(22) 利用這種方式，便能在所選定的 GAL4 果蠅株，於特定時空減低基因的表現量，觀察指定基因的降低表現，對特定組織器官有何影響。. 4. 使用 pWIZ vector 此質體為一 pUAST 改造的 vector，其有兩個 MCS (Multiple cloning site)，中間隔著 white gene intron 2，將想要降低表現量的基因片段以相反的方向分別插入 white gene intron 2 的兩端(Lee, 2003 #119)，將 Him gene exon 1 片段以上述的方式，以限制酶相反的剪接至 pWIZ 質體中，成功接合的質體再以 SacI 確定方向，確定為成功插入反向 Him exon 1 的質體，再將此質體以顯微注射的方式得到轉殖果蠅株。. 四、果蠅胚胎的顯微注射收集 yw:. Δ2 − 3,Ubx 的果蠅胚胎於塗有 yeast的洋菜膠體上，於 TM3, Sb. pre-cellular blastoderm時期前，以 18℃馴養，收產卵後 1 個小時內之胚胎，以 50 %漂白水，脫殼兩分鐘，準備一無毒雙面膠黏附在載玻片上，並將脫殼完成的胚胎排列黏附於雙面膠上，於乾燥 2~3 分鐘後，蓋上Halocarbon oil。將抽取純化好的transgenic vector以injection buffer（5 mM KCl；0.1mM PO4 pH7.8）稀釋為 0.3 ~ 1.0 μg/μl，注入 22.

(23) 製備好的毛細管針尖端，裝置妥善於顯微注射器上，將DNA注射於胚胎後端（germ cells之所在），放置於 18℃培養箱兩天，收集孵化出的幼蟲、培養至成蟲，將每一隻羽化的成蟲分開，各別與異性的yw 果蠅株交配，待子代若有紅眼果蠅羽化，便得到轉殖成功之果蠅株。. 五、Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) 1. Topo clonning 將心臟發育上三個非常重要的轉錄因子：tin、pnr、dmef2，取得其 cDNA，以 LA Taq (proof reading Taq)進行 PCR 反應，並設計 primer 將整段 cDNA 放大，以洋菜膠電泳分離不同大小的 DNA 片段，選取 cDNA 全長大小的片段，挖下存有該片段之洋菜膠體，以 DNA/RNA Extraction Kit (Viogene) 將洋菜膠內的 PCR 產物萃取出來，進行 Topo cloning。將萃取之PCR產物 0.5 μl，加入ddH2O 0.5 μl、Dilute salt 0.25 μl、 pENTR/TEV/D TOPO vector 0.25 μl，室溫下靜置反應 30 分鐘，便可得到將PCR產物轉入pENTER/TEV/D的質體，隨即將質體以電穿孔 (electroporation)方式，轉型入大腸桿菌勝任細胞Top 10 內，以抗生素 Karnamycin篩選成功轉型的菌落，再以rTaq作PCR確認，無誤後大量養菌，並純化其質體DNA (pENTR/TEV/D-gene X)。. 23.

(24) 2. LR Clonase II reaction 將下列三項依指定濃度、體積混合： pENTR/TEV/-geneX 以 1X TE buffer 稀釋至 50 ng/μl 取 1.25μl；目的質體 (pTWF 或 pDEST-17)以 1X TE buffer 稀釋成 150 ng/μl 取 0.25μl；LR clonase II (震盪兩次) 取 0.5 μl；混合後於室溫下靜置反應 1~2 小時，加入 0.25 μl proteinase K 於 37℃下反應 10 分鐘以終止反應，便能得到標的質體 (pDEST17-gene X)。隨即以電穿孔方式將標的質體轉入 Top 10 勝任細胞中，以抗生素 Carbenicillin 篩選轉型成功之菌株，以 rTaq PCR 檢查再佐以 DNA 定序之方式，確認所轉入之 cDNA 序列正確無誤，以期能表現正確之轉錄因子蛋白 (Tin、Pnr、 Dmef-2)。確定無誤後，大量養菌並抽取質體 DNA，純化後以電穿孔方式將標的質體轉型入專司表現蛋白質之勝任細胞—BL21 (plyss)，準備表現蛋白質。. 3. 萃取 Tin、Pnr 及 Dmef2 等轉錄因子蛋白質將轉型成功之 BL21 細菌以千分之ㄧ Carbenicillin 抗生素之 LB 培養液共 10 c.c.作隔夜培養，隔天將菌液倒入 50 c.c.同樣含千分之ㄧ抗生素之培養液中，於 37℃培養至 O.D.600 約為 0.6~0.8 左右，加入 IPTG 至最後濃度為 1mM，放回 37℃搖 3.5 小時。取出後，將菌液倒 24.

(25) 入 50ml 離心管並以 4℃ 6,000 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，加入 2 ml 6xHis-Tag Binding buffer 劇烈震盪，加入 125 μl Protease Inhibitor Cocktail，以超音波震盪將細菌震碎，以 4℃ 14,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清液通樹酯管柱 (His-Tag Column)以純化蛋白。. 4. 純化 6xHis-Tag 之蛋白質準備好樹酯管柱，先以ddH2O洗一次後，加入Charge buffer靜置 10 分鐘，再以Binding buffer洗一次，便可準備純化蛋白。將離心好的上清液全數吸入樹酯管柱內，均勻混勻後，搖 4 小時~隔夜(4℃)，之後以Wash buffer洗兩次，加入 200~300μl之Elution buffer靜置 10 分鐘，以針筒將管柱內液體擠出，便得到純化完成之蛋白質，最後以 Bradfod試劑定量蛋白質，便可進行EMSA。. 5. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) 由 Him enhancer 的後半段 2.2 kb 為模板，以 tin、pnr、dmef-2 之轉錄因子接合認知序列搜尋，找到一個符合的認知序列，並向前後同時延長，取總長約 25 bp 的一段 DNA 如下： Tin-5’. ATTGTAACGCACTTGAAGTGCACTC. Tin-3’. GAGTGCACTTCAAGTGCGTTACAAT. Pnr-5’. CAAGCGAAGCGATAGGGAGACATAT. Pnr-3’. ATATGTCTCCCTATCGCTTCGCTTG 25.

(26) Dmef-2-5’. GTTATGTTTTATTTTTAATCCCACA. Dmef-2-3’. TGTGGGATTAAAAATAAAACATAAC. 將設計好的正反雙股序列加在一起升溫至 95℃，等 5 分鐘後，停止加熱並使其緩緩冷卻，兩互補股便會慢慢結合成雙股序列。將雙股 DNA 稀釋至 2.5μM 加入 Binding buffer（15mM HEPES-KOH pH 8.0, 40mM KCL, 1mM EDTA, 0.5mM DTT, 5% Glycerol）最後加入定量濃度的純化蛋白(Tin、Pnr、Dmef2-)總體積為 20 μl，室溫下靜置反應 30 分鐘，然後立即以 6% acrylamide Gel/0.5X TBE 以電壓 80V 先跑 10 分鐘後，再以 120V 跑至 60% ~ 70%，以千分之ㄧ濃度的 SYBR Green (染 DNA)染色 20 分鐘，用一次水洗 10 秒兩次，便可照相；或者染 SYPRO Ruby (染蛋白質)隔夜，再退染後以 Typhoon 照相 (Ryan, 2007 #12; Grove, 1998 #25; Jing, 2003 #128; Gajewski, 2001 #33; Stronach, 1999 #129)。. 六、Him 基因的 enhancer 在果蠅心臟表現之研究以 Posakony 所建立的 enhancer reporter— Him en2.2(Rebeiz, 2002 #17)為研究背景，研究三種轉錄因子(tin、pnr、dmef-2)對 Him en2.2 的螢光表現之影響，從而推斷三種轉錄因子對 Him 基因表現的影響。所使用的果蠅品系雜交如下：. 26.

(27) 1.. Ectopic gain of function a.en-Gal4 ╳ UAS-GFP. (Control). b. en-Gal4 ╳ UAS-tin；Him en2.2 c. en-Gal4；Him en2.2 ╳ UAS-pnr d.en-Gal4 ╳ W1118; P{EP}Mef2EP2002a/CyO；Him en2.2 e. en-Gal4；Him en2.2 ╳UAS-tin；UAS-pnr f. en-Gal4；Him en2.2 ╳UAS-tin, W1118;P{EP}Mef2EP2002a 2. Loss of function a.. twi；24B-Gal4 ╳ UAS-tinEnR；Him en2.2. b.. twi；24B-Gal4 ╳ UAS-pnrEnR；Him en2.2. c.. Adhfn23pr1cn1Mef222-21；Himen2.2 self cross STB. 於 25℃收集以上果蠅 4~16 小時之胚胎（stage 9~stage16），脫殼蓋上玻片於共軛焦顯微鏡上觀察其 eGFP 表現，並拍照保存。. 27.

(28) 伍、結果一、Him 為果蠅心臟發育所需本實驗室對 Him 的研究，由 Df(1)22622DL/ DP(1;3)JC153 此一品系果蠅，自交後產生 Df(1)22622DL/Df(1)22622DL (mutant) 、 Df(1)22622DL/DP(1;3)JC153 (wild type)、DP(1;3)JC153/ DP(1;3)JC153 (overexpression) ，三種基因型，以 anti-Dmef2 抗體染色的結果，發現有的胚胎心臟細胞有增加的現象；而有的胚胎心臟細胞則減少(Fig. 1)。再進一步以基因轉殖果蠅 UAS-Him (overexpression) 及 Him-pWIZ (loss of function)染 anti-Tin 及 anti-Dmef2 染色，在 overexpression 發現心臟細胞數目減少；而在 loss of function 發現心臟數目變多的情形 (Fig. 2)。此一情況與 Liotta 在肌肉所見相同，故 Him 在中胚層不論是心臟與肌肉，都扮演著 repressor 的角色 (Lin, 2004 #130)。. 二、果蠅胚胎原位雜合染色將 tin 與 Him 的基因表現情形做比較：胚胎早期 (stage 7~12) Him 的基因表現約略晚於 tin，但在胚胎發育晚期 (stage 15 以後)，兩者共同表現於心臟(Fig. 3)。在果蠅胚胎發育早期，Him 可能受 tin 的調控活化，故晚於 tin 表現；但在胚胎晚期 tin、Him 共同表現於心臟，代表兩者在心臟發育上都是相當重要的角色。 28.

(29) 三、Him gene enhancer 同源序列之分析利用生物資訊網站 National Center for Biotechnology Information (NCBI)，輸入 Him protein 之胺基酸序列，利用該網站 blast 的功能搜尋同源物種，結果搜尋到具有該基因同源蛋白質產物的物種如下： Drosophila melanogaster、Drosophila sechellia、Drosophila yakuba、 Drosophila erecta 、 Drosophila simulans 、 Drosophila persimilis 、 Drosophila. ananassae 、 Drosophila. willistoni 、 Drosophila. pseudoobscura、Drosophila mojavensis、Drosophila virilis、Drosophila grimshawi 等十二個果蠅品系，沒有其他果蠅以外的物種，表示 Him 是專屬於果蠅所特有的基因，故本實驗室挑了其中四個親緣關係差異較大的四個品系： D. melanogaster、 D. erecta、 D. pseudoobscura、 D. ananassae，將其 enhancer 的序列找出，並以生物資訊軟體 Vector NTI 做同源分析 (Fig. 4 )，將 D.. melanogaster 品系果蠅在 Him 基因. 上的 enhancer 序列分析出可能受 tin、pnr、d-mef2 所調控的認知序列，以轉錄起始點當作+1，標定出各個認知序列的位置，並與另三個品系作同源比對 (Fig. 5 ). 發現在-75 位置的 D-mef2 認知序列以及 -206 位置的 Tin 認知序列具有 100%的高度保守性。再往上游包括一. 29.

(30) 個 D-Mef2 (-1023)、二個 Tin (-1111、-1346) 以及二個 Pnr (-1645、-2323) 則隨親源關係越遠保守性越低。四、EMSA 純化三種轉錄因子蛋白，Tin、Pnr、D-mef2，與設計好含各轉錄因子認知序列之 Him enhancer 之片段 DNA，在結合反應之後跑膠，染 SYBR Green 果然有 band Shift 之現象。証明 Him enhancer 2.2 kb 上的確含有該三種轉錄因子的調控序列 (Fig. 6)，且 Tin、Pnr、D-mef2 的轉錄因子確實能結合在各含有該轉錄因子序列的 DNA 片段上。但以 D-mef2 最明顯而 Tin 的 band shift 最微弱，因此這個實驗或者需要再進一步加強，或者可以改用 S2 cell culture 做 Chromatin IP，來取代 EMSA。. 五、Him 基因的 enhancer 在果蠅心臟表現之研究 1. Control 以外胚層之特定表現基因 en-GAL4，於外胚層誘導 UAS-GFP 之表現，使外胚層中具有 en 基因表現的細胞發出綠螢光，作為 Him-en 2.2 過度表現圖像之標準 (Fig. 7A)。. 2.Overexpression 以外胚層之特定表現基因 en-GAL4，於外胚層誘導 tin 之表現，卻. 30.

(31) 能間接誘發 Him-en 2.2 reporter 於外胚層表現出綠螢光 (Fig. 7C)。此 ectopic expression 證明轉錄因子 Tin 能活化 Him en2.2 reporter 的表現。但是，同樣的異位表現 pnr 與 d-mef2 卻無法誘導 Him en2.2 reporter 於外胚層表現綠螢光 (Fig. 7D、E)。而共轉 tin, pnr 或共轉 tin, d-mef2 雖然也可看見綠螢光的異位表現，但無法進一步分析共轉與單獨的異位表現螢光是否有所差異。因此無法藉由此得知 pnr 或 d-mef2 與 tin 同時表現時，是否有協助 tin 的效果。. 3. Loss of function 以中胚層之特定表現基因 twist；24B-Gal4，於中胚層誘導 tin、pnr 之 dominant negative，皆間接導致心臟的 Him en2.2 reporter 綠螢光表現減少 (Fig. 8 B、C)，而 d-mef2 mutant 的遺傳背景下卻不見 Him en2.2 的螢光表現量減少 (Fig. 8D)。由於 tin 與 pnr 的競爭型抑制會造成果蠅胚胎的心臟發育缺失(Lockwood, 2002 #38)，故其 Him en2.2 螢光表現減少可能是由於心臟細胞消失所導致。此實驗結果可以證明，對於 Him en2.2，轉錄因子 tin 與其有直接的活化關係，而 pnr 則是必須不可或缺的但可能不是直接的活化者， d-mef2 則由此實驗並沒發現與 Him en2.2 有何關係。. 31.

(32) 陸、討論由 in situ 來看 Him 跟 tin 的 RNA 時空表現，在胚胎 9~12 時期 Him 的表現皆比 tin 稍晚，暗示 Him 在胚胎發育前期是受 tin 的活化；而在晚期 15、16 時期，Him 與 tin 則是共同侷限於心臟細胞，其餘外胚層僅剩零星的表現。由此可知，在胚胎晚期心臟即將發育成熟時， tin 與 Him 共同參與調節心臟發育的角色。. Him enhancer 序列具有高度保守性藉由基因體資料庫搜尋與軟體的分析 (Fig. 5)，我們發現 Him 上游區域 enhancer 2.2kb 的區域，密集的存在許多與心臟發育有關的轉錄因子認知序列，例如 Tin、Pnr、Mef2。並藉由 EMSA 的實驗結果，也證明了純化後的轉錄因子蛋白，確實會與設計好的 Him enhncer 片段序列結合 (Fig. 6)。然而作了四種不同品系果蠅的同源比對之後，在與 D.. melanogaster 親源關係較遠的 D. ananassae 仍然在 D-Mef2. (-75)與 Tin (-206)兩個位置的轉錄因子認知序列，有完全相同的保守性，而越往上游的認知序列，其保守性越低，可見 Him enhancer 受到調控的序列，應以靠近轉錄起始點 D-Mef2 (-75)與 Tin (-206)這一段最. 32.

(33) 為重要，次者為 D-Mef2(-1023)、Tin(-1111)，最後則為 Tin(-1346)以及二個 Pnr (-1645、-2323)。本實驗室將 Him-en 2.2 此段 enhancer，以 primer 做分段夾出，再重組成 enhancer reporter 並做成基因轉殖果蠅做分析(Lin, 2004 #130)，僅包含兩個 Pnr 認知序列片段的 enhancer (-2414~-1591)沒有任何螢光表現，若是只含有 D-mef2 (-75)及 Tin(-206) 的段落(-17~-619)，因為單獨的 Tin 不起作用，所以其螢光表現僅由單一 D-Mef2 所誘導，故其螢光也侷限表現於中胚層肌肉細胞與心臟細胞的 cardial cells ，圍心細胞 (pericardial cells)則無螢光表現。但若將(-1723~-17)此段 enhancer 擷取下來，其螢光表現就與原長 2.2 kb 的螢光表現類似，此實驗佐證了由親源關係上所得的推論 (Lin, 2004 #130) 。. Him enhancer 直接受 tin 的調控為了進一步探究各轉錄因子與 Him 表現的關係，藉由 Posakony 實驗室所發表的 Him en-2.2 reporter 為背景(Rebeiz, 2002 #17)，也因為其綠螢光表現與 in situ 或抗體表現非常接近(Liotta, 2007 #31)，可以用來作為 Him 基因表現的指標。藉由外胚層的單獨異位表現 tin、 pnr 與 d-mef2，只有 tin 能間接活化 Him en2.2 使其在外胚層出現綠營光，其他兩者則沒有像 tin 的情形。此現象表示 Him en2.2 在單獨三. 33.

(34) 種轉錄因子中，僅有 tin 能活化這一片段的表現，而其他兩者 pnr 與 d-mef2 則無法單獨活化 Him en2.2。若從 loss of function 來看，在中胚層分別單獨降低前述三種轉錄因子表現，只有 tin 和 pnr 的 dominant negative 皆會影響心臟細胞的綠螢光表現，使原本 Him en2.2 在心臟內所現的螢光，大幅降低，而無法藉由綠螢光觀察到完整的心臟，但 d-mef mutant 的遺傳背景下，還是可以觀察到正常的螢光表現。因此，總和以上的實驗結果作一個初步的推論，在 Him en2.2 中，tin 扮演主要的 activator，而 pnr 與 d-mef2 則扮演輔助性的角色，而缺乏 d-mef 的遺傳背景之下，Him en2.2 的螢光表現不受影響，只能說明 tin 與 pnr 所調控這段 enhancer 的能力是獨立於 d-mef2 之上的，因此即使在 d-mef2 null mutant 的情況下，僅僅靠 tin 與 pnr 便能活化 Him，但並不能說 d-mef2 對於 Him 是不重要的，由 Liotta 與本實驗的研究皆證明 Him 與 d-mef 彼此間具有交互作用的關係，且 Him 的 enhancer 上具有兩個保守性相當高的 Dmef2 認知序列，Him 與 d-mef 之間的關係必須要再由進一步的實驗來證明，例如進一步以 S2 cell culture 做 reporter assay。. Him 在 Notch pathway 上所扮演的角色由 Liotta 所發表的研究，認為 Him 的 C 端所具有的 WRPW 序列，能與 Gro 之 coprpressor 結合後才有抑制肌肉的作用，加上 Rebeiz 發 34.

(35) 現 Him 的 enhancer 上具有四個 Su(H ) binding sites，因此 Him 應為 Notch signal pathway 的成員之ㄧ，但 WRPW 這個 motif 會抓一個 Gro 並與一些 bHLH 及 repressor 共同作用，但 Him 的胺基酸序列本身並無 bHLH domain，也就是說 Him 本身並不直接與 DNA 結合。具有像果蠅 Him 這樣特性的基因也在脊椎動物中被發現，Ripply1 就是一個在 N 端具有 WRPW domain 但是本身又不具有 bHLH 序列的蛋白，他的角色很可能是結合 Gro 與 DNA binding repressor 形成一個大的 repressor complex 的中間者(Kawamura, 2005 #131)，因此 Him 的角色或許跟脊椎動物的 Ripply1 同屬於一個平行演化的地位 (Rebeiz, 2002 #17; Liotta, 2007 #31)。在本研究中，Him 的 enhancer 會受到 tin 的直接調控，在原本不表現 tin 與 Him 的外胚層，異位表現 tin 時，可以引發 Him en 2.2 的螢光，也就是說 Him 為 tin 的下游基因，直接受到 tin 的活化而表現基因產物。而 tin 屬於 Dpp 與 Wg 共同調控 pathway 的成員，果真如此，那便意味著 Him 可能為 Dpp-Wg 與 Notch 兩種截然不同的訊息傳遞路徑的交會點，是一個十字路口的關鍵角色。文獻指出，如果在缺乏 Notch 的影響下，藉由 Dpp-Wg pathway 成員的影響，細胞便朝向心臟專一的先驅細胞分化；相反的，若是 Notch 訊號影響之下，即會抑制心臟細胞走向特殊分化的命運，不論 Dpp or Wg 的訊息是否已存在都不影響。(Zaffran, 2002 #114) 換句話說，Him 所. 35.

(36) 在的十字路口，或許便由是否受到 Notch 的訊息調控，來扮演抑制心臟細胞生成的角色。心臟細胞的組成是透過不對稱的細胞分裂來分化不同命運的細胞，例如心肌細胞（myocardial cells）及圍心細胞 (pericardial cells) 的形成，是由一個心臟先驅細胞經由不對稱的細胞分裂分化為二，一個是將來分化為心臟細胞的先驅；而另一個則是將來走向為心細胞的命運。此作用的分子機轉為 Numb 在細胞內抑制 Notch 造成 Notch 分佈的不平均，在細胞分裂的過程即分裂為不同的細胞命運的兩個細胞 (Su, 1999 #83)，例如在 numb 的突變底下，odd-positive-pericardial cells 會變多，是因為 svp-myocardial cells 轉變導致 (Ward, 2000 #94)。本實驗中，Him 的過度表現與降低表現所導致的心臟細胞數目便少或增多，卻似乎無法觀察到不對稱分裂的現象，這跟已知的 Notch pathway 不相符，或許是，就我們使用的分子標誌來看，anti-D-Mef2 只能染到果蠅的心臟細胞，而 anti-Tin 包括心臟與圍心細胞都能染到，由這兩個心臟細胞的分子標誌，並無法清楚區別出果蠅的心臟與圍心細胞，所以使用更多的細胞標誌也許是個釐清的方式。此外，更進一步的做 reporter assay 與 Chromatin IP 也可以再進一步的分析，以上實驗所不足之處，這也是未來亟待進行的工作。. 36.

(37) 捌、參考文獻 Baylies, M. K. and Bate, M. (1996). twist: a myogenic switch in Drosophila. Science 272, 1481-4. Bier, E. and Bodmer, R. (2004). Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene 342, 1-11. Bodmer, R. (1993). The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development 118, 719-29. Chiu I.S., H. S. W., Wang J.K., Wu M.H., Chu S.H., Lue H.C., Hung C.R. (1988). Clinical implications of atrial isomerism. Br Heart J 60, 72-7. Cripps, R. M. and Olson, E. N. (2002). Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev Biol 246, 14-28. Fromental-Ramain, C., Vanolst, L., Delaporte, C. and Ramain, P. (2008). pannier encodes two structurally related isoforms that are differentially expressed during Drosophila development and display distinct functions during thorax patterning. Mech Dev 125, 43-57. Gajewski, K., Fossett, N., Molkentin, J. D. and Schulz, R. A. (1999). The zinc finger proteins Pannier and GATA4 function as cardiogenic factors in Drosophila. Development 126, 5679-88. Gajewski, K., Kim, Y., Choi, C. Y. and Schulz, R. A. (1998). Combinatorial control of Drosophila mef2 gene expression in cardiac and somatic muscle cell lineages. Dev Genes Evol 208, 382-92. 37.

(38) Gajewski, K., Zhang, Q., Choi, C. Y., Fossett, N., Dang, A., Kim, Y. H., Kim, Y. and Schulz, R. A. (2001). Pannier is a transcriptional target and partner of Tinman during Drosophila cardiogenesis. Dev Biol 233, 425-36. Grove, A., Galeone, A., Yu, E., Mayol, L. and Geiduschek, E. P. (1998). Affinity, stability and polarity of binding of the TATA binding protein governed by flexure at the TATA Box. J Mol Biol 282, 731-9. Jennings, B. H., Pickles, L. M., Wainwright, S. M., Roe, S. M., Pearl, L. H. and Ish-Horowicz, D. (2006). Molecular recognition of transcriptional repressor motifs by the WD domain of the Groucho/TLE corepressor. Mol Cell 22, 645-55. Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J. and Beechem, J. M. (2003). A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics 3, 1172-80. Kawamura, A., Koshida, S., Hijikata, H., Ohbayashi, A., Kondoh, H. and Takada, S. (2005). Groucho-associated transcriptional repressor ripply1 is required for proper transition from the presomitic mesoderm to somites. Dev Cell 9, 735-44. Lee, Y. S. and Carthew, R. W. (2003). Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods 30, 322-9. Lilly, B., Zhao, B., Ranganayakulu, G., Paterson, B. M., Schulz, R. A. and Olson, E. N. (1995). Requirement of MADS domain transcription factor D-MEF2 for muscle formation in Drosophila. Science 267, 688-93. Lin, Y.-S. (2004). Functional Characterization of a Novel gene, Him, in 38.

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(41) 陸、附圖：. A.. D.. B.. E.. C.. F.. Fig.1 Df(1)22622DL/DP(1;3)JC153 果蠅株自交所得果蠅胚胎 anti-D-mef2 免疫染色，(A、B)為 wild type 果蠅胚胎，(C、D)為肌肉缺失果蠅胚胎，(E、F)為心肌細胞增多果蠅胚胎，右邊均為頭部，左邊均為尾部 (Lin, 2004 #130) 。. 41.

(42) A.. D.. E.. B.. C.. F.. Fig. 2 (A ~C)為 anti-Tinman 抗體染色，(A)：wild type，(B)：twi-24B >Him-pWIZ，(C)：twi >UAS-Him，白色箭頭所指為心肌細胞。(D ~F) 為 anti-D-Mef2 抗體染色，(D)：wild type，(E)：tubulin > Him-pWIZ， (F)：twi>UAS-Him，黑色箭頭所指為心肌細胞 (Lin, 2004 #130) 。. 42.

(43) Fig. 3 為 tinman（左排）及 Him（右排）基因在 stage 7~stage 17 的 in situ hybridization 的基因表現情形（胚胎方向：前端向左，後端向右）（tinman 的圖源自 BDGP 網站查詢，依時期排列）。. 43.

(44) Fig. 4. 生物資訊網站 National Center for Biotechnology Information (NCBI)， blast 的 Him 的胺基酸序列搜尋同源物種。Score 代表與輸入之胺基酸序列親源關係的數值，由上而下依親源由近而遠排列。 44.

(45) Fig. 5. 為四種果蠅株 Drosophila melanogaster、Drosophila pseudoobscura、 Drosophila erecta、與 Drosophila ananassae 的 Him 基因的基因組上游 enhancer 的序列比對。標示顏色的為各個與心臟發育調控相關的轉錄因子之可能接合序列位置。Pannier：GATAGG、CTTATC，Tinman： CACTTGA、TCAAGTG，DMef2：CTATTTATAA、TTATTTTTAA。. 45.

(46) Pannier. Tinman. D-Mef2. +. +. +. Pannier. Pnr. DNA probe DNA probe. Tinman. Tinman. D-Mef2. DNA probe. DNA probe. DNA probe. D-Mef2 DNA probe. Fig. 6 Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) 利用 His-tag 純化之重組蛋白 Tinman、Pnr、D-mef2，可以與人工所設計含有該轉錄因子認知序列之 DNA 探針結合，而此段 DNA 序列之設計乃複製自 Him enhancer，可證明 Him enhancer 上的轉錄因子認知序列，確實會受到轉錄因子的結合而調控基因的表現。. 46.

(47) A. B.. C.. E.. F.. G.. en-GAL4>UAS-tin;UAS-mef2. D.. Fig. 7. 以 en-Gal4 於外胚層過度表現不同的轉錄因子，UAS-tin、 UAS-pnr 與 UAS-mef2 在 Him en2.2 的遺傳背景下，觀察果蠅心臟之綠螢光表現。(A)：於外胚層異位表現綠螢光作為正向對照組，(B)： Him en2.2 正常的情況之下的綠螢光情形，(C)：外胚層異位表現 tin 誘導 Him en2.2 綠螢光也於外胚層表現出 en 的圖像，(D、E)：同樣外胚層異位表現 pnr 與 d-mef2，卻沒有 en 的綠螢光圖像。(F、G)：則是分別在外胚層同時異位表現 Tin+Pnr，與 Tin+D-mef2，故其外胚層皆有表現 en 的圖像 (胚胎皆為 stage 16~17 時期，方向：前端向左，後端向右)。 47.

(48) A.. C.. B.. D.. Mef2mut;Him. Fig. 8. 再 Him en2.2 遺傳背景下，使 tin、pnr、d-mef2 loss of function. 來觀察果蠅胚胎心臟綠螢光的表現情形。(A)：單獨以 Him en2.2 之綠螢光表現為對照組，(B、C)：以 twi;24B-Gal4 於中胚層分別表現 tin 與 pnr 之 dominant negative 以達到競爭型抑制的效果，(D)：為 dmef2 突變株的遺傳背景之下，觀察 Him en2.2 的螢光表現 (胚胎皆為 stage 16~17 時期，方向：前端向左，後端向右)。. 48.

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