一、Him 為果蠅心臟發育所需
本實驗室對 Him 的研究，由 Df(1)22622DL/ DP(1;3)JC153 此一品
系 果 蠅 ， 自 交 後 產 生 Df(1)22622DL/Df(1)22622DL (mutant) 、 Df(1)22622DL/DP(1;3)JC153 (wild type)、DP(1;3)JC153/ DP(1;3)JC153 (overexpression) ，三種基因型，以 anti-Dmef2 抗體染色的結果，發 現有的胚胎心臟細胞有增加的現象；而有的胚胎心臟細胞則減少(Fig.
1)。再進一步以基因轉殖果蠅 UAS-Him (overexpression) 及 Him-pWIZ (loss of function)染 anti-Tin 及 anti-Dmef2 染色，在 overexpression 發
現心臟細胞數目減少；而在loss of function 發現心臟數目變多的情形 (Fig. 2)。此一情況與 Liotta 在肌肉所見相同，故 Him 在中胚層不論是 心臟與肌肉，都扮演著repressor 的角色 (Lin, 2004 #130)。
二、果蠅胚胎原位雜合染色
將 tin 與 Him 的基因表現情形做比較：胚胎早期 (stage 7~12) Him
的基因表現約略晚於tin，但在胚胎發育晚期 (stage 15 以後)，兩者共 同表現於心臟(Fig. 3)。在果蠅胚胎發育早期，Him 可能受 tin 的調控 活化，故晚於tin 表現；但在胚胎晚期 tin、Him 共同表現於心臟，代 表兩者在心臟發育上都是相當重要的角色。
三、Him gene enhancer 同源序列之分析
利用生物資訊網站 National Center for Biotechnology Information (NCBI)，輸入 Him protein 之胺基酸序列，利用該網站 blast 的功能搜 尋同源物種，結果搜尋到具有該基因同源蛋白質產物的物種如下：
Drosophila melanogaster、Drosophila sechellia、Drosophila yakuba、 Drosophila erecta、Drosophila simulans、Drosophila persimilis、 Drosophila ananassae 、 Drosophila willistoni 、 Drosophila pseudoobscura、Drosophila mojavensis、Drosophila virilis、Drosophila grimshawi 等十二個果蠅品系，沒有其他果蠅以外的物種，表示 Him
是專屬於果蠅所特有的基因，故本實驗室挑了其中四個親緣關係差異 較大的四個品系： D. melanogaster、 D. erecta、 D. pseudoobscura、 D. ananassae，將其 enhancer 的序列找出，並以生物資訊軟體 Vector
NTI 做同源分析 (Fig. 4 )，將 D. melanogaster 品系果蠅在 Him 基因
上的 enhancer 序列分析出可能受 tin、pnr、d-mef2 所調控的認知序 列，以轉錄起始點當作+1，標定出各個認知序列的位置，並與另三個 品系作同源比對 (Fig. 5 ). 發現在-75 位置的 D-mef2 認知序列以及 -206 位置的 Tin 認知序列具有 100%的高度保守性。再往上游包括一
個D-Mef2 (-1023)、二個 Tin (-1111、-1346) 以及二個 Pnr (-1645、-2323) 則隨親源關係越遠保守性越低。
四、EMSA
純化三種轉錄因子蛋白，Tin、Pnr、D-mef2，與設計好含各轉錄 因子認知序列之Him enhancer 之片段 DNA，在結合反應之後跑膠，
染SYBR Green 果然有 band Shift 之現象。証明 Him enhancer 2.2 kb 上的確含有該三種轉錄因子的調控序列 (Fig. 6)，且 Tin、Pnr、D-mef2 的轉錄因子確實能結合在各含有該轉錄因子序列的DNA 片段上。但 以D-mef2 最明顯而 Tin 的 band shift 最微弱，因此這個實驗或者需要 再進一步加強，或者可以改用S2 cell culture 做 Chromatin IP，來取代 EMSA。
五、Him 基因的 enhancer 在果蠅心臟表現之研究 1. Control
以外胚層之特定表現基因 en-GAL4，於外胚層誘導 UAS-GFP 之
表現，使外胚層中具有en 基因表現的細胞發出綠螢光，作為 Him-en 2.2 過度表現圖像之標準 (Fig. 7A)。
2.Overexpression
以外胚層之特定表現基因 en-GAL4，於外胚層誘導 tin 之表現，卻
能間接誘發Him-en 2.2 reporter 於外胚層表現出綠螢光 (Fig. 7C)。此 ectopic expression 證明轉錄因子 Tin 能活化 Him en2.2 reporter 的表
現。但是，同樣的異位表現 pnr 與 d-mef2 卻無法誘導 Him en2.2 reporter 於外胚層表現綠螢光 (Fig. 7D、E)。而共轉 tin, pnr 或共轉 tin, d-mef2 雖然也可看見綠螢光的異位表現，但無法進一步分析共轉與
單獨的異位表現螢光是否有所差異。因此無法藉由此得知 pnr 或 d-mef2 與 tin 同時表現時，是否有協助 tin 的效果。
3. Loss of function
以中胚層之特定表現基因 twist；24B-Gal4，於中胚層誘導 tin、pnr
之dominant negative，皆間接導致心臟的 Him en2.2 reporter 綠螢光表 現減少 (Fig. 8 B、C)，而 d-mef2 mutant 的遺傳背景下卻不見 Him en2.2 的螢光表現量減少 (Fig. 8D)。由於 tin 與 pnr 的競爭型抑制會造成果 蠅胚胎的心臟發育缺失(Lockwood, 2002 #38)，故其 Him en2.2 螢光表 現減少可能是由於心臟細胞消失所導致。
此實驗結果可以證明，對於 Him en2.2，轉錄因子 tin 與其有直接 的活化關係，而pnr 則是必須不可或缺的但可能不是直接的活化者，
d-mef2 則由此實驗並沒發現與 Him en2.2 有何關係。