以吸附法回收玻尿酸

利用共沈澱法合成之氧化鐵形貌如Fig. 3-9 所示，由穿透式電子顯微鏡可以發現粒子 直徑約介於 10-20 nm，由電子繞射圖計算之面間距可確認合成之產物為 Fe3O4；由超導量 子干涉磁量儀(SQUID Magnetometer)量測其磁滯曲線(hysteresis curve)得知，產物屬於超順 磁性(superparamagnetic)材料。磁性二氧化矽奈米粒子影像如 Fig. 3-10 所示，可以清楚地看 出，Fe3O4被二氧化矽所包覆，一個二氧化矽包覆數個Fe3O4粒子。

Fig. 3-9 TEM image of the iron oxide nanoparticles

Fig. 3-10 Image of magnetic silica particles.

二氧化矽層的厚度可以藉由調整TEOS 濃度而改變(Fig. 3-11)。本研究選擇直徑為 800 nm 的磁性二氧化矽進行表面修飾改質，以不同溶劑進行 glycidyltrimethylammonium chloride (GAC)改質後材料表面之 FTIR 光譜顯示於 Fig. 3-12。由 C-N 鍵的吸收峰可初步判定改質成 功。

Fig. 3-11 Effect of TEOS concentration on the particle size of magnetic silica. (a) TEOS, 0.12M; (b) TEOS 0.35M; (c) TEOS 0.58M; (d) TEOS 0.81M

Fig. 3-11 FTIR spectrum of GAC modified magnetic silica

以GAC 修飾之磁性粒子回收玻尿酸的吸附曲線如 Fig. 3-12 所示，沒有表面修飾的磁 性二氧化矽的吸附量極微，而GAC 修飾的粒子在 30°C 下，可吸附 28 mg HA/g particle。將 吸附玻尿酸的磁性粒子浸泡於1.0 M NaCl 溶液，可以脫附玻尿酸，磁性粒子得以回收再使 用。在吸附與脫附的過程，磁性粒子可以利用強力磁鐵回收，不需要使用傳統的離心進行 固液分離，可以省卻電能的消耗，更有利於大規模操作回收玻尿酸。

Fig. 3-12 Time course of HA concentration during adsorption to 1.0 g of GAC-modified magnetic silica at pH 5 and 30°C。Symbols: (z), GAC-modified magnetic silica; ({), unmodified magnetic silica.

3.6 結論

玻尿酸價格取決於分子量與純度，主要的雜質來自於醱酵液中的蛋白質。利用超過濾 或載體吸附法回收純化玻尿酸，可以減少鹽類以及乙醇的使用量，是符合環保要求的綠色

Time (min)

0 10 20 30 40 50 60 70

Hyaluronic acid concentration (mg/mL)

0 10 20 30 40 50 60

製程。本單元中第一部份提出的氣液兩相流動操作方式，可以降低濃度極化現象，提高超 過濾的操作效能。第二部份討論的超過濾透析，可以同時回收玻尿酸並且移除大部分的蛋 白質。在第三部分的工作，成功地開發以四級銨表面修飾的磁性粒子回收玻尿酸，

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計畫成果自評

玻尿酸是一種高單價的多醣類特用化學品，量產玻尿酸必須有產率高的醱酵方法，以 及競爭力強的綠色純化製程。本計畫成果在醱酵製程部分，建立半連續式醱酵生產玻尿酸 的方法，其次，玻尿酸是一種高黏度的醱酵系統，利用混合時間可以量化評估攪拌的均勻 度，藉此可確立混合時間可作為高菌體濃度醱酵放大設計的參數，以上成果都是國內外首 見，計畫預期目標完全達成，且已發表學術論文。在純化部分，本計畫建立兩種綠色純化 程序：超過濾透析與磁性粒子吸附，這兩種方法不需要使用危害有機溶劑。超過濾透析使

用去離子水，可以回收 80%以上的玻尿酸，在導電度下降時析出蛋白質，達成同時回收玻

尿酸與去除蛋白質的目標。磁性粒子可直接從醱酵液回收玻尿酸，吸附產物後的粒子可以 強力磁鐵進行固液分離，不需要使用高電力消耗的離心程序，而且吸附載體可以重複使用，

上述成果可進行技術轉移。超過濾研究已達成計畫預期目標，磁性粒子吸附程序則是在計 畫進行過程中，新增加的研究項目，純化部分的成果正積極尋求技術轉移的廠商。

可供推廣之研發成果資料表(1)

□ 可申請專利 ■ 可技術移轉 日期：2010 年 1 月 30 日

國科會補助計畫

計畫名稱：玻尿酸批次醱酵與純化程序效能之提升 計畫主持人：陳樹人

計畫編號：NSC 96−2221−E−151−043−MY2 學門領域：化學工程 技術/創作名稱 高體積產率玻尿酸醱酵程序

The improvement on batch production of hyaluronic acid (HA) production by Streptococcus zooepidemicus was disclosed. HA production could be performed with a fill-and-draw culture starting by displacing the fermentation broth with fresh medium just before the stationary phase. The maximum volumetric productivity was 2.5-fold compared with typical batch culture. Production of HA in a high-cell-density culture could be performed using concentrated medium. The mixing time (less than 30 s) is a critical point for ensuring the homogeneity of broth and maintaining the productivity of streptococcal cells.

可供推廣之研發成果資料表(2)

□ 可申請專利 ■ 可技術移轉 日期：2010 年 1 月 30 日

國科會補助計畫

計畫名稱：玻尿酸批次醱酵與純化程序效能之提升 計畫主持人：陳樹人

計畫編號：NSC 96−2221−E−151−043−MY2 學門領域：化學工程 技術/創作名稱 以磁性粒子純化玻尿酸

發明人/創作人 陳樹人、黃怡琳

本技術可製備表面以四級銨修飾之超順磁性二氧化矽粒子並用以 吸附回收玻尿酸，粒子吸附容量為28 mg HA/g particle。利用磁性 粒子可直接自醱酵液吸附純化玻尿酸，不需使用沈澱劑與危害性有

機溶劑，將粒子浸泡於 NaCl 溶液即可脫附玻尿酸，磁性粒子可回

收重新使用。此操作程序成本低且絕對符合環保法規要求，具有應 用於製備醫藥級玻尿酸之潛力。

技術說明 The superparamagnetic silica particles modified with quaternary ammonium were prepared for adsorbing hyaluronic acid (HA). The capacity for adsorbing HA is 28 mg HA/g particle. Surface modified magnetic particles could recover HA from fermentation broth directly with precipitate and organic solvents. The desorption of HA could accomplished by incubating the absorbents in NaCl solution. The reusable magnetic silica could recover by external magnet. The clean process is promising for preparing medical-grade HA.

可利用之產業

出席國際學術會議心得報告(第一年)

計畫編號 NSC 96−2221−E−151−043−MY2

計畫名稱 玻尿酸批次醱酵與純化程序效能之提升

會議名稱 The 13th Symposium of Young Asia Biochemical Engineers’ Community 發表論文題目 A Fermentation Strategy for Maintaining the Plasmid Stability in

Recombinant Protein Production 一、參加會議經過

亞洲青年生化工程會議(YABEC)係於1995年由遠東地區臺灣、南韓、日本與中國 四個國家的生化工程學者共同發起，力排各種政治干擾，自1995年起在四個國家每年輪 流舉辦，至今已成為亞洲地區生化工程學術交流盛事，近年也有越南與印度學者開始參 與。第十三屆亞洲青年生化工程會議是由南韓化學工程學會生化工程分會(Division of Biochemical Engineering and Biotechnology, Korean Institute of Chemical Engineers)以及 高麗大學綠色化學工程研究所(Institute of Green Chemical Engineering System, Korea University)主辦，與會人數共有來自亞洲地區約200名學者代表參加。

大會活動於11月21日上午8時50分開始，分別由大 會主席Moo Hwan Cho與地主代表Kwan Young Lee致 詞。大會演講由南韓先進科學技術院(KAIST) Jak-Sung

用於生物技術的新穎奈米材料。

筆者在此次發表的論文主題為：「A Fermentation Strategy for Maintaining the Plasmid Stability in Recombinant Protein Production」，研究經費部分來自國立高雄應用 科技大學的補助。維持基因重組微生物外來基因質體安定性的傳統方法是培養基添加抗

三、建議

歷年來YABEC經費籌措不易，各地區參加的人數均有上限，不過國內仍有數位碩 博士生在國科會或指導教授的贊助下主動參加。整體來看國內碩博士生的語文溝通確實 進步很多，可見得國科會近年來推動的各項研究生參與國際交流補助已有明顯成效。略 為可惜的是，本次主辦單位沒有沿襲前一屆在義守大學(YABEC 2006)舉辦的議程，安 排各國博士生論文發表的場次。如果國內舉辦類似的國際學術研討會，在經費預算允許 下排定各國博士生論文發表的議程，邀請參與國家推薦年輕研究生參加，不僅能促進各 國研究生彼此觀摩與交流，更能國內激勵的碩博士生參與國際交流的勇氣；若能持續長 久推動，必能使國際年輕學者對臺灣留下深刻的印象，並鞏固臺灣在國際學術界的地位。

出席國際學術會議心得報告(第二年)

計畫編號 NSC 96−2221−E−151−043−MY2

計畫名稱 玻尿酸批次醱酵與純化程序效能之提升

日本東京芝浦工業大學(Shibaura Institute of Technology)

會議名稱 The 14th Symposium of Young Asia Biochemical Engineers’ Community 發表論文題目 Fermentation method for producing high concentration hyaluronic acid by

Streptococcus zooepidemicus ATCC39920

一、參加會議經過

第十四屆亞洲青年生化工程會議由日本東京芝浦工業大學負責籌辦，與會人員主 要來自臺灣日本南韓與中國 ，約200名學者參加。

大會活動於11月30日上午8時30分開始，由大會主 席千葉大學關實教授致歡迎詞。大會演講由神戶大學近 藤昭彦教授發表「Production of bio-fuels and chemicals from biomass by cell surface engineered yeast strains」，近 藤教授鑽研酵母菌細胞表面表現系統多年，成功地將多 場 講 題 為 「Anti-biofouling materials of zwitterions polysulfobetaine studied by surface plasma resonance」，

由中原大學張雍教授教授主講，介紹以新穎材料製備抗 生物污垢薄膜的應用與可行性，該研究成果可應用於改 良生醫材料；第二場講題為「Nanoscale biomemory device composed of self-assembled recombinant protein」，由南 韓西江大學Jeong-Woo Choi教授發表；第三場演講由日 本大阪府立大學荻野博康教授報告綠色化學製程相關的 主題「Development of organic solvent-stable enzymes」；

第四場講題為「Bioreactor technology for pharmaceutical production from hairy roots」，由北京中國科學院過程工

程研究所劉春朝博士主講。

程研究所劉春朝博士主講。