1993; Radaeva et al., 1997)。但是，動物組織一直很難擺脫病毒殘留的疑慮，特別是禽流感 病毒的威脅，所以，藥粧品市場對微生物醱酵之玻尿酸的需求日益增加。另一方面，從動 物組織萃取玻尿酸需要使用大量的丙酮、氯仿等危害性有機溶劑，在重視清潔生產的時代，
以微生物生產玻尿酸還兼具有分離純化程序簡單且低污染的優點。
有鑑於玻尿酸醱酵與純化程序可參考文獻與專利並不多，計畫執行團隊首先發現，對 於耐氧性厭氣菌 S. zooepidemicus ATCC 39920 而言，玻尿酸的生產既不受攪拌速率也不受 通氣量之影響，真正影響玻尿酸產量的因素乃是溶氧量(Huang et al., 2006)；好氣醱酵有助 於提高玻尿酸產量，原因可能是鏈球菌以莢膜阻擋氧氣，避免氧氣進入細胞產生過氧化氫 而傷害細胞。研究數據指出只要溶氧量保持在10% saturation 以上，即可以維持鏈球菌生產 玻尿酸的能力；此一結論不僅說明，氧氣在玻尿酸醱酵的角色則是刺激玻尿酸生產的因子，
也提供了玻尿酸醱酵製程放大設計的準則。
設計醱酵程序必須先了解微生物代謝物質屬於一次代謝產物，或是二次代謝產物。本 研究由顯微鏡觀察得知：鏈球菌在對數增值期，細胞外圍有明顯的莢膜，但進入停滯期之 後，莢膜將逐漸脫落(Fig. 1-2)，由此觀之玻尿酸係屬於一次代謝產物。對於一次代謝產物 而言，釐清比生長速率對產物生產之影響，乃是設計醱酵策略的重要關鍵。如果玻尿酸的 產量或產率與比生長速率有關，則可選擇饋料批次或連續式培養控制細胞的比生長速率，
讓鏈球菌在最適比生長速率下生產玻尿酸；如果比生長速率對鏈球菌生產玻尿酸的效率沒 有顯著的影響，批次醱酵即是最佳的醱酵方法。
(a) 3 h (b) 5 h (c) 7 h
(d) 8 h (e) 9 h (f) 10 h
Fig. 1-2 在不同生長期下，鏈球菌型態與莢膜變化。(細胞於第 9 h 進入停滯期)。
玻尿酸成品的價格取決於純度，事實上量產玻尿酸的瓶頸即主要在於純化程序的放 大。傳統上，玻尿酸的回收是利用長鏈烷基陽離子化合物容易與陰離子型高分子形成錯合 物的特性(此機制稱為 complex coacervation)，添加四級銨(quaternary ammonium)化合物，例 如 氯 化 十 六 烷 基 砒 啶(cetylpyridium chloride, CPC) 或 是 溴 化 十 六 烷 基 三 甲 基 銨 (hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)作為沈澱劑，得到 HA-四級銨錯合物沈澱 (Cleland and Sherblom, 1977)，將沈澱物溶解於氯化鈉水溶液，可使錯合物解離(Lago et al., 2005)，再加入 3 倍體積的醇類則可得玻尿酸沈澱物，此時即可移除溶解於上清液的四級銨 (Brown et al., 1994; Nimrod et al., 1988; Radaeva et al., 1997)，沈澱物可再藉由管柱層析或反 覆醇類沈澱處理提高玻尿酸純度。上述回收過程需要耗費大量醇類，不論從操作成本或是 工安的角度來考量，純化程序仍有很大的改善空間。
薄膜分離技術是純化玻尿酸的另一選擇(Elllwood et al., 1996; Prescott, 2002)，但這些專 利僅利用超過濾回收玻尿酸並去除小分子物質，並沒有將薄膜分離技術的功能完全發揮。
Zhou 等人(2006)提出的改善方法是以微過濾(microfiltration, MF)與超過濾(ultrafiltration, UF) 所組合之兩階段掃流(tangential flow)程序純化玻尿酸，並分別使用 0.45 μm 的 MF 膜以及 MWCO 100 kD 的 UF 膜，在適當的操作條件下可回收 77%的玻尿酸，純化倍數則為 1000。
以超過濾回收醱酵產物的主要困難在於需要克服過濾速率下降，濾速下降的原因來自 濃度極化(concentration polarization)以及薄膜結垢現象(membrane fouling)，濃度極化致使薄
形成膠層，明顯降低過濾速率。伴隨濃度極化而來的則是結垢現象，包括：溶質分子吸附 在薄膜表面或孔隙結構內、溶質分子或微粒阻塞孔隙等。雖然濃度極化可藉由掃流操作與 提高掃流速率而減輕，但效果不僅有限，超過濾模組也無法承受過高的掃流速率。顯而易 見，欲利用超過濾操作處理高黏度的醱酵液，將面臨嚴重的濃度極化問題，但目前為止仍 沒有文獻提出解決之道。
採用兩相流動超過濾，將氣體通入超過濾裝置是克服濃度極化現象的有效策略，利用 通氣對濃度邊界層產生擾動作用，以及空氣在流經薄膜表面時產生高的剪應力，可以把累 積在薄膜表面的溶質帶走，減緩濃度極化與結垢現象(Cheng, 2002; Cui and Taha, 2003; Cui and Wright, 1996; Lee et al., 1993; Um et al., 2001)。另外，申請人參與的研究團隊曾提出油/
水兩相流動超過濾法(Wang et al., 2004)，利用正十六烷的黏滯係數比空氣大，所造成的剪 應力和薄膜表面的攪動比空氣氣泡產生的效應更強，降低濃度極化的效果更勝於通氣超過 濾。
針對玻尿酸醱酵與純化技術的發展現況與瓶頸，本計畫提出兩大目標：
(一)、 以半連續式醱酵方法提高批次醱酵操作的效能，探討半連續操作的最佳策略。另一 方面，在提高批次醱酵的體積產率的目標下，討論高菌體濃度生產玻尿酸的醱酵策 略以及放大設計參數。
(二)、 提出純化玻尿酸的新穎方法：包括以兩相流動降低超過濾濃度極化、回收玻尿酸並 且移除蛋白質的操作方式，以及利用磁性粒子回收玻尿酸。