2.1 研究背景與目的
本研究首先以饋料批次操作改變 S. zooepidemicus ATCC 39920 細胞比生長速率，討論 比生長速率對玻尿酸生產的效應，實驗結果如Fig. 3-1 所示，在相同的溫度下，玻尿酸的比
產率(Yp/x)與鏈球菌比生長速率關聯性並不高。由此可以推論，批次醱酵乃是醱酵生產玻尿
酸的最佳醱酵模式。然而，批次醱酵每次操作後需要耗費時間在處理請洗設備、管線滅菌 與培養基備料，無形中降低了醱酵設備的利用率。為了提高玻尿酸產率，本研究在第一年 的工作中建立以半連續式醱酵生產玻尿酸的操作方法，同時探討半連續式醱酵操作的限制 與改良策略。
Fig. 3-1 比生長速率對玻尿酸比產率之影響(▲, 30°C; ■, 33°C; ●, 37°C)。
一般而言，高菌體濃度醱酵是提高批次操作體積產率最直接的方式，但對於多醣類的 高黏度醱酵系統來說，多醣產物濃度的增加將提高醱酵液黏度，降低氧氣與養分的質傳阻 力，因而往往無法維持細胞生產產物的能力，亦即比產率反而隨養分濃度提高而下降。為 了滿足產程開發的需求，探討高菌體濃度醱酵生產玻尿酸的方法以及放大設計參數，是建 立玻尿酸製程不可或缺的研究工作。
2.2 研究方法
2.2-1 菌株與培養基
本研究計畫所使用之菌株為 Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920，購買自食品工 業發展研究所。Tryptic Soy Broth (TSB 培養基，成分見 Table 2-1)用於菌種保存以及前培養，
Specific growth rate (h-1)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
Specific productivity YP/X (g HA/g cell) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Table 2-1 TSB 培養基組成
Composition Concentration (g/L)
Pancreatic digest of casein 17.0 Enzymatic digest of soybean meal 3.0
Glucose 2.5
K2HPO4 2.5
NaCl 5.0
Agar* 15.0
*於製作平板培養基時添加
Table 4 醱酵培養基組成
Composition Concentration (g/L) Glucose 20.0 Yeast extract 10.0
K2HPO4 2.5
NaCl 2.0 MgSO4⋅7H2O 1.5
2.2-2 批次醱酵
從活化後之培養皿上取單一菌落移植於裝有100 mL TSB 培養基之 500 mL 三角燒瓶，
在迴轉式恆溫振盪培養箱內，經過12 h 前培養(溫度 37°C、轉速 150 rpm)後，將前培養液 接種至2.5 L 醱酵槽(mini Jar-fermenter M-100,Eyela, Japan)，以工作體積 1.5 L 進行批次培 養。醱酵槽操作標準條件為37°C、pH 7.0、攪拌軸轉速 600 rpm，透過通氣量之調整，使溶 氧量保持在10%飽和度以上。
2.2-3 半連續式醱酵
當批次醱酵操作進行至對數期末期或停滯期時，取出固定體積醱酵液，再以定量幫浦 添加等體積的新鮮培養液至醱酵槽，新鮮培養基組成與批次醱酵所用的培養基完全相同，
操作條件與工作體積也完全一致。探討項目包括：比較不同的培養基置換時機、置換的時 間間隔、置換的體積，藉以了解半連續醱酵的操作條件，以及長時間操作的醱酵策略。
2.2-4 分析方法
菌體濃度的分析將根據濁度法，以十二烷基硫酸鈉(SDS)處理 5 min 後的醱酵液經過離
儀測其濁度。對照菌體乾菌重檢量線，即可求出菌體濃度(g dry cell mass/L)。玻尿酸濃度測 定將根據carbazole 法(Bitter and Muir, 1962)。葡萄糖濃度將採用還原糖法(Miller, 1959)測定 之。混合時間(mixing time)之估計是加入鹽酸，產生一個脈衝變化，並以 pH 計量測 pH 回
Fig. 2-2 Effect of specific growth rate on HA fermentation. Symbols: closed diamonds:
μ
= 0.58 h-1; closed circles:μ
= 0.32 h-1, closed squares:μ
= 0.19 h-1; closed triangles:μ
= 0.01 h-1. Open symbols in panel (a) represent residual glucose in the fermentation broth.Dry cell mass (g cell)
0
Hyaluronic acid (g HA)
0
Fig. 2-3 Effect of specific growth rate on the volumetric productivity of HA at a fermentation temperature of 37°C.
2.4 以半連續式醱酵生產玻尿酸
半連續式醱酵操作的關鍵在於培養基的置換時機與培養基置換體積。如 Fig. 2-4 所
示，在以醱酵槽工作體積之1/3 作為置換體積，置換時機為細胞生長停滯期初期的條件下，
雖然細胞濃度可以回復至培養基置換前的水準，但是玻尿酸產量卻從 2.0 g/L 下降至 1.3 g/L。van de Rijn 與 Kessler (1980)曾發現進入生長停滯的鏈球菌細胞膜將失去合成玻尿酸的 能力，從實驗數據來看，停滯期並不是半連續醱酵合適的培養基置換時機。
Fig. 2-4 Fill-and-draw culture of S. zooepidemicus with an exchange of 500 ml of medium starting at the onset of stationary phase.
Specific growth rate (h-1)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Volumetric productivity of HA (g HA l-1 h-1) 0.0
如果把置換時機提前1 小時，亦即對數增殖期末期，則可發現(Fig. 2-5)在置換次數在 6 次以內，菌體濃度與玻尿酸的生產能力均能回復到置換前的水準，此時的體積產率為 0.105 g HA L-1 h-1。如果提高置換體積為工作體積之2/3，菌體濃度與玻尿酸的生產能力仍能回復 到置換前的水準，此時的體積產率為0.059 g HA L-1 h-1 (Fig. 2-6)。
Fig. 2-5 Fill-and-draw culture of S. zooepidemicus with an exchange of 500 ml of medium starting at the late exponential growth phase.
Fig. 2-6 Fill-and-draw culture of S. zooepidemicus with an exchange of 1000 ml of medium starting at the late exponential growth phase.
Cell concentration (g/l)
從半連續式醱酵的實驗結果可進一步推測，鏈球菌在進入生長停滯期之後有可能釋出 醱酵液中可能釋出不利於玻尿酸合成的物質，另一種可能性則是出現不具玻尿酸生產能力 的變異株(Blank et al., 2005)，目前確實從醱酵液中分離出菌落表面平滑，不具生產能力的 鏈球菌，單一細菌的外觀型態仍須以電子顯微鏡觀測。若要避免抑制物質的累積與變異株 的出現，更好的醱酵方法是取出大部分的醱酵液後，注入同體積的新鮮培養基，亦即重複 式批次醱酵。如Fig. 3-7 所示，每次留下 3%的細胞作為菌源，可以重複操作 6 次，細胞最 高比生長速率比產率皆可以維持不變，與批次醱酵相比較，體積產率可以從0.24 g HA L-1 h-1 增加為0.60 g HA L-1 h-1。
Fig. 2-7 HA production by repeated batch culture where the amount of cell seeded was 3%. (Huang et al., 2008)
2.5 高菌體濃度醱酵生產玻尿酸
提高醱酵槽內的菌體濃度也是提高體積產率的策略之一，提高菌體濃度最簡單的方法 包括調整培養基組成，以及使用濃縮培養基進行醱酵。Table 3-1 顯示，以葡萄糖 20 g/L 與 大豆水解蛋白0.3 g/L 為基準，在玻尿酸生產培養基中額外添加 tryptone，並且改變 tryptone 與yeast extract 的比例。結果可以得到最高的比產率為 1.28 根據實驗結果，後續實驗的培 養基組成採用：葡萄糖20 g/L、大豆水解蛋白 0.3 g/L、tryptone 11.5 g/L、yeast extract 0.9 g/L、
K2HPO4 2.5g/L、NaCl 2.0 g/L、MgSO4⋅7H2O 1.5 g/L。並且在鹽類濃度不變的前提下，提高 碳源與氮源的濃度作為濃縮培養基。
一般而言，高黏度醱酵系統造成的質傳阻力可以藉由提高攪拌速率而克服，為了評估 醱酵槽內流體的均勻性，混合時間是單元操作最常使用的評估指標。為了了解使用濃縮培
養基提高批次醱酵體積產率的可行性，同時尋找放大設計的準則，本研究使用 2 種不同的
攪拌葉片：六葉渦輪攪拌葉片(six-blade turbine)與閘式攪拌葉片(gate impeller)，並且用不同 的攪拌速率，獲得不同的混合時間，探討混合時間對於鏈球菌生產玻尿酸之影響。實驗首 先選用2 倍濃度培養基，混合時間對細胞生長與破尿酸產量結果如 Fig. 2-8 所示，當混合時
間大於30 s 以上，即使細胞最高濃度不受影響，但是鏈球菌生產玻尿酸的能力卻明顯地隨
混合時間增加而下降。換言之，混和時間30 s 可以作為一個放大參數，若要在濃縮倍率更
高的培養基下生產玻尿酸，必須提高攪拌速率，使醱酵槽的混合時間維持在30 s 以內。
Table 3-1 Effect of tryptone/yeast extract ratio on HA production.
Round Tryptone
* DCW: The maximum cell concentration in terms of dry cell weight.
# μm: The maximum specific growth rate.
Fig. 3-8 Effect of mixing time on HA production in the two-fold enriched fermentation medium.
Cell concentration (g/L) HA yield (g/L) 0
Working vol.: 1.5 L, 300 rpm with gate impeller Working vol.: 1.5 L, 500 rpm with two turbines Working vol.: 1.5 L, 300 rpm with gate impeller Working vol.: 1.0 L, 400 rpm with one turbine Working vol.: 1.5 L, 400 rpm with two turbines
Mixing time (s)
2.6 結論
本研究釐清了獸疫鏈球菌(S. zooepidemicus ATCC39920)醱酵生產玻尿酸的生理特性，
確立了醱酵生產玻尿酸的法則。比生長速率對玻尿酸比產率的影響並不顯著，不需要使用 饋料批次或連續式醱酵生產玻尿酸，若要提高批次醱酵的效能，可以採取半連續式或重複 批次操作。如果要進一步提高體積產率，可以提高培養基基質濃度；不過，基質濃度增加 時，玻尿酸累積造成的高黏度效應，必須藉由提高攪拌速率而克服，否則細胞無法維持生 產能力。研究顯示，適當地提高攪拌速率，是維持高菌體濃度醱酵不可或缺的必要條件，
混合時間可作為評估醱酵液均勻性的指標，以及製程放大的參數。