Table 5. The analysis conditions collected from reference papers 60 Table 6. Optimum conditions for capillary electrophoresis experiment 88 Table 7. The linear range, LOD, LOQ and linear range of the proposed method 89 Table 8. Recovery values of pesticides in different water sample 90
圖目錄
第一部分 以毛細管電泳分析尿液中的 ofloxacin
Fig. 1. Structure of ofloxacin. 1
Fig. 2. Cravit that we used in this study is the pastille type. 2 Fig. 3. Development of the electroosmotic flow. 12 Fig. 4. Separation mechanism of capillary zone electrophoresis. 14 Fig. 5. (a) two-dimensional (b) three-dimensional structure of HP-β-CD 15
Fig. 6. Structure of chitosan 21
Fig. 7. Fluorescence intensity of ofloxacin at various pH value of the phosphate buffer.
34
Fig. 8. Enantioseparation of ofloxacin in various concentration of HP-β-CD and phosphate buffer（50 mM）at pH 2.30.
35
Fig. 9. Effect of HP-β-CD at different concentrations on resolution of racemic ofloxacin.
36
Fig. 10. Fluorescence intensity of ofloxacin at different concentration of HP-β-CD.
37
Fig. 11. Fluorescence intensity of ofloxacin at different concentration of HP-β-CD.
38
Fig. 12. Electropherograms of racemic ofloxacin in 50 mM phosphate with different concentration of chitosan.
39
Fig. 13. Electropherograms of racemic ofloaxacin 50 mM phosphate buffer with 40
5 mM HP-β-CD , 5×10-7 (w/v) chitosan and various metal ions.
Fig. 14. Electropherograms of the commercial drug. 41 Fig. 15. Electrograms of (a) urine from a healthy person; (b) urine from a patient
diluted 10 times; (c) urine from a patient diluted 10 times and spiked with 5×10-5 M ofloxacin .
42
Fig. 16. The Standard addition method used to determinate the concentration of levofloxacin in patient’s urine.
43
第二部分 以毛細管電泳分析疑似環境荷爾蒙之農藥
Fig. 17. Structure of carbaryl. 45
Fig. 18. The metabolism pathway of carbaryl. 46
Fig. 19. Structure of carbendazim. 48
Fig. 20. Structure of thiabendazole. 49
Fig. 21. The metabolism pathway of thiabendazole. 50
Fig. 22. Structure of 1-naphthylacetamide 52
Fig. 23. Structure of 1-naphthylacetic acid 52
Fig. 24. The EOF of MEKC 66
Fig. 25. Structure of cationic surfactants 67
Fig. 26. Electropherograms of the four pesticides in 15 mM phosphate buffer with 15 mM TTAB and 10 % n-propanol at various pH value.
91
Fig. 27. The fluorescence intensity of pesticides in 15 mM phosphate buffer (pH 6.47) .
92
Fig. 28. Electropherograms of the four pesticides in 15 mM phosphate buffer 93
(pH 6.47) with different surfactant and 10 % n-propanol.
Fig. 29. Electropherograms of the four pesticides in 15 mM phosphate buffer (pH 6.47) with different concentrations of CTAB and 10 %
n-propanol.
94
Fig. 30. Electropherograms of the four pesticides in (a)5 mM; (b)15 mM; (c)20 mM; (d)30 mM; (e)45 mM phosphate buffer (pH 6.47) containing 15 mM CTAB and 10 % n-propanol.
95
Fig. 31. Electropherograms of the four pesticides in 15mM phosphate buffer (pH 6.47) with 15 mM CTAB and 10 % (a) methanol ; (b) ethanol ; (c) n-propanol ; (d) iso-propanol ; (e) ACN.
96
Fig. 32. Electropherograms of the four pesticides in 15 mM phosphate buffer (pH 6.47) with 15 mM CTAB and (a) 0 %; (b) 2 % ; (c) 6 % ; (d) 10
% ; (e)12 % n-propanol.
97
Fig. 33. Electropherograms of the four pesticides in 15 mM phosphate buffer (pH 6.47) with 15 mM CTAB and 10 % n-propanol.
98
Fig. 34. Electropherograms of the five pesticides in 15 mM phosphate buffer (pH 6.47) with 15 mM CTAB, 10 % n-propanol, and (a) no HP-β-CD in sample and buffer; (b) 5 mM HP-β-CD in sample and no HP-β-CD in buffer; (c) 10 mM HP-β-CD in buffer and no HP-β-CD in sample;
(d) 5 mM HP-β-CD in sample and 10 mM HP-β-CD in buffer.
99
Fig. 35. Electropherograms of the five pesticides in 15 mM phosphate buffer (pH 6.47) with 15 mM CTAB and 10 % n-propanol, addition (a) 0 mM; (b) 5 mM; (c) 10 mM; (d) 15 mM; (e) 20 mM HP-β-CD.
100
Fig. 36. Electropherograms of the five pesticides in 15 mM phosphate buffer 101
(pH 6.47) with 15 mM CTAB, 10 mM HP-β-CD and 10 % n-propanol, (a) 0 mM; (b)5 mM; (c)10 mM; (d) 15mM HP-β-CD in sample.
Fig. 37. Electropherograms of the (a) blank; (b) five pesticides spiked in tap water.
102
Fig. 38. Electropherograms of the (a) blank; (b) five pesticides spiked in water sample 1.
103
Fig. 39. Electropherograms of the (a) blank; (b) five pesticides spiked in water sample 2.
104
Fig. 40. Electropherograms of the (a) blank; (b) five pesticides spiked in water sample 3.
105
Fig. 41. Electropherograms of the (a) blank; (b) five pesticides spiked in water sample 4.
106
Fig. 42. Electropherograms of the (a) blank; (b) five pesticides spiked in water sample 5.
107
Fig. 43. The commercial sample of carbaryl. 108
Fig. 44. Electropherograms of the commercial smple dissolved in (a) distilled water (b) methanol.
109
縮寫全文對照
ACN acetonitrile
BAL bronchoalveolar lavage
CAB carbendazim CAR carbaryl CD cyclodextrin
CE capillary electrophoresis
CEKC capillary electrokinetic chromatography
CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide
CZE capillary zone electrophoresis
DAD diode array detector
DNA deoxyribonucleic acid
DTAB dodecyltrimethylammonium bromide
ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
EOF electroosmotic flow
ESI electronspray ionization
FI flow injection
FL fluorescence
GC gas chromatography
HP-β-CD hydroxylpropyl-β-cyclodextrin
HPLC high performance liquid chromatography HPTLC high performance thin layer chromatography
IT ion trap
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LD50 lethal dose, 50 percent kill
LLE liquid-liquid extraction
LOD limited of detection LOQ limited of quantification
MAE microwave-assisted extraction
MEKC micellar electrokinetic chromatography
MS mass spectroscopy
MS/MS tandem MS
NAA 1-naphthylacetic acid
NAD 1-naphthylacetamide
PAD photodiode array detector
Ref. reference SFE supercritical fluid extraction SDS sodium dodecyl sulfate
SPE solid phase extraction
TBAA tetrabutylammonium acetate
TBZ thiabendazole TEA triethylamine
TTAB trimethyl(tetradecyl)ammonium bromide UV ultraviolet
第一部份
偵測藥物
-以毛細管電泳分析尿液中的
ofloxacin
第一章 緒論
一、 前言
Ofloxacin 是 氟 化 奎 林 酮 類
（ fluoroquinolones ） 的 一 種 ， IUPAC（The International Union of Pure and Applied Chemistry）命名 為
9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-7-oxo-7
H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazine-6-carboxylic acid hemihydrate，結構如Fig. 1，有光學異構物存在，”＊”處為其
對掌光學中心。氟化奎林酮類是人工合成的抗生素，主要抗菌機 制是抑制細菌的DNA gyrase及type IV topoisomerase，使細菌無法 進行DNA的轉錄及轉譯，抗菌範圍包括革蘭氏陽性菌及陰性菌。
ofloxacin常用於治療呼吸道、尿道、皮膚及全身性感染。研究顯 示ofloxacin的左旋異構物levofloxacin具有較高的抗菌活性，是右 旋的8-128倍[1]，目前已有成藥”可樂必妥”在市面上販賣，見Fig.
2。
Fig. 2. Cravit that we used in this study is the pastille type. The diameter is about 0.81cm and each tablet contains 100 mg levofloxacin.
ofloxacin經由口服能快速的被人體吸收，人體中只能代謝很 少量的ofloxacin，大約有87 %服入的藥物在48小時內會恢復為原 來的形式從尿液中排泄，少於4 %的藥物會在72小時內從糞便中 排出，只有少於5 %的藥物會代謝成desmethyl和 N-oxide代謝物 從尿液中排出[2]。
二、 文獻回顧
文 獻 中 偵 測 levofloxacin 以 高 效 能 液 相 層 析 方 法 （ high performance liquid chromatography, HPLC）居多。Wong 等人提 出以單一步驟液相萃取（liquid-liquid extraction, LLE）人類尿液 及血漿中的levofloxacin，再以Inertsil C18管柱採用逆相HPLC-UV 偵測及定量levofloxacin，線性範圍（linear range）分別為0.08~5.18 μg/mL（血漿），23~1464 μg/mL（尿液）。並可使用ligand-exchange
操 作 模 式 將 細 胞 液 中ofloxacin的 異 構 物 分 離[3]。Wright等 人 使 用 逆 相HPLC-UV 可 在 生 長 基 質 （ growth media ） 中 偵 測 到 包 含 ofloxacin 的 三 種 奎 林 酮 類 抗 生 素 ， 線 性 範 圍 為 0.0625~20 μg/mL[4]。Böttcher實驗團隊則是利用逆相HPLC-FL分析偵測軟組 織、骨頭和血清中的levofloxacin，線性範圍為0.1~40 μg/mL，偵 測極限（limited of detection, LOD）為1 ng/mL（血清與膽汁）[5]。 Tsai 等 人 使 用 微 透 析 和 HPLC 偵 測 老 鼠 血 液 和 膽 汁 中 的 levofloxacin，線性範圍為0.1~5 μg/mL ，偵測極限為50 ng/mL[6]。 Stewart實驗團隊提出使用固相萃取（solid phase extraction, SPE）
及HPLC 的 方 法 分 離 人 類 血 漿 中 包 含 levofloxacin 的 氟 化 奎 林 酮 類，levofloxacin的線性範圍為 51.2~5069 ng/mL，偵測極限為25 ng/mL ， 定 量 極 限 （ limited of quantification, LOQ ） 為 51.2 ng/mL[7]。Sowinski等使用HPLC連接UV和螢光偵測器分離血漿中 的包含levofloxacin的六種氟化奎林酮類，levofloxacin在血漿中的 線性範圍分別為50~10000 ng/mL（UV），20~5000 ng/mL（FL）[8]。 Mayer實 驗 室 提 出 以 逆 相 HPLC連 接 螢 光 偵 測 器 偵 測 血 漿 中 的 氟 化奎林酮類，並與微透析萃取方法比較。levofloxacin的線性範圍 分別為0.0156~5 μg/mL (微透析)，0.02~12.5 μg/mL（血漿），偵測 極限分別為0.01 μg/mL (微透析)和0.0125 μg/mL（血漿）[9]。Breilh 等 則 提 出 偵 測 血 漿 、 脊 髓 液 和 骨 頭 組 織 中 的levofloxacin 的 HPLC-UV方 法 ， 線 性 範 圍 分 別 為 0.25~25 μg/mL （ 血 漿 ）、 1~6
μg/mL （脊髓液）和0.5~10 μg/g（骨頭組織），偵測極限分別為 0.050 μg/mL（血漿）、0.10 μg/mL(脊髓液)和0.20 μg/g（骨頭組 織）[10]。Greelet實驗團隊使用column-switching HPLC-螢光偵測 血 清 中 三 種 氟 化 奎 林 酮 類 ，levofloxacin 線 性 範 圍 為 125~4000 ng/mL ， 偵 測 極 限 為 60 ng/mL[11]。 Santoro 實 驗 團 隊 則 使 用 HPLC-UV定 量 藥 錠 中 的 四 種 氟 化 奎 林 酮 類 ， levofloxacin線 性 範 圍 為4.0~24.0 μg/mL， 偵 測 極 限 為 0.15 μg/mL， 定 量 極 限 為 0.46 μg/mL[12]。
Mochón提出另一種偵測藥錠、尿液及血清中levofloxacin的 螢光發光法，在pH 4的醋酸緩衝液時，可偵測到20~3000 ng/mL 的levofloxacin，在pH 5的醋酸緩衝溶液中添加 6 mM SDS可增強 螢光，偵測極限分別為5 μg/mL（血清）與420 μg/mL（尿液）[13]。 Du 實 驗 室 提 出 利 用 電 子 轉 移 形 成 錯 合 物 而 產 生 的 螢 光 偵 測 levofloxacin、ofloxacin等四種奎林酮類，線性範圍分別是0.02~1.0 μg/mL(ofloxacin)、0.04~1.2 μg/mL (levofloxacin)，偵測極限分別 為0.006 μg/mL (ofloxacin)、0.012 μg/mL (levofloxacin)，可應用在 藥錠、膠囊、尿液和血漿中[14]。El-Sherif等提出使用玻璃碳電極 以方波伏安法偵測levofloxacin，線性範圍為6×10-9 M~5×10-7 M，
偵 測 極 限 為10-9 M，可應用在稀釋後的病人尿液偵測上[2]。Radi 等人利用DNA與levofloxacin的反應，以玻璃碳電極使用循環伏安 法偵測，線性範圍為5×10-7 M~5×10-6 M，偵測極限為1×10-7 M，
應 用 在 尿 液 偵 測 中 ， 偵 測 極 限 可 達25 μg/mL[15]。Sursh實驗團隊 提 出 利 用 高 效 能 薄 層 分 析 （ high-performance thin layer chromatography, HPTLC），線性範圍為0.8~3.0 μg/mL，偵測極限 為0.08 μg，定量極限為 0.3 μg[16]。
在毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）方面，有三篇 關 於 分 離ofloxacin 異 構 物 的 文 獻 。 Horimai[17]的 團 隊 提 出 使 用 γ-CD-Zn(II)-D-phenyl -alanine 錯 合 物 分 離 數 種 氟 化 奎 林 酮 類 藥 物 的 異 構 物 ， 利 用Zn(Ⅱ) 和D-phenyl 與 氟 化 奎 林 酮 類 作 用 產 生 ligand-exchange ， γ-CD 與 氟 化 奎 林 酮 類 產 生 host-guest interaction，使其異構物分離。Boer[1]的實驗團隊則是採用毛細管 電動層析（capillary electrokinetic chromatography, CEKC）系統 連接UV偵測器在50 mM phosphate buffer（pH 2.5）中添加了0.35 mM sulfated β-cyclodextrin，可在五分鐘內分離ofloxacin異構物，
在 未 經 前 處 理 的 尿 液 中 對R-(+)-ofloxacin 最 低 偵 測 極 限 為 2 μg/mL （ 5.5×10-6 M）。 Ouyang和 Baeyens[18]的 團 隊 提 出 毛 細 管 電 泳 連 接UV 偵 測 器 使 用 70 mM phosphate buffer 添 加 40 mM HP-β-CD 使 用 不 同 的 pH 值 分 離 lomefloxacin 、 gatifloxacin 、 pazufloxacin 及 ofloxacin ， 對 所 有 的 異 構 物 線 性 範 圍 都 為 7~105 μg/mL，最低偵測極限皆為7 μg/mL（約1.94×10-5 M），以上文獻 實驗條件及結果整理在Table 1。
Table 1. The analysis conditions collected from reference papers
1. High performance liquid chromatography (HPLC)
Sample Matrix Preparat-
ion
Condition Detector Linear range LOD Ref.
ofloxacin plasma,
containing L-isoleucine (10 mM)/methanol (87.5:12.5,v/v) Flow rate: 1.0 mL/min
UV
- Mobile phase: pH 3.0, phosphate buffer with SDS and
TEA –ACN (65 %: 35 %) Flow rate: 1.75 mL/min
UV
- Mobile phase: pH 3.0, phosphate buffer/methanol/triethylamine
（750:250:4, v/v/v）
Flow rate: 1.5 mL/min
FL
bile 1-octanesulfonic acid（ 40:60）
plasma SPE Mobile phase: 25 mM phosphate buffer, 0.1% trifluoroacetic acid (pH 2.4)/ACN (86:14,v/v) Flow rate: 1.5 mL/min
UV
UV: 50~10000 ng/mL FL: 20~10000 ng/mL
- [8]
levofloxacin, ciprofloxacin
plasma - Mobile phase: 0.11%
orthophosphoric acid and 1.5%
ACN (pH 3.0) Flow rate: 0.4 mL/min
FL
triethylamine (pH 3.0) /ACN (83:17, v/v).
Flow rate: 1.2 mL/min
UV
bone 10 mM phosphate buffer (pH 2.5), 12 % ACN
2. Capillary electrophoresis（CE）
Sample Matrix Condition Detector Linear range LOD Ref.
quinolone drug - 10 mM γ-CD, 10 mM ZnSO4, 10 mM
D-phenylalanine, 10 mM ammonium acetate (pH 6.5)
UV (295 nm, 300 nm)
- - [17]
ofloxacin urine 50 mM phosphate buffer (pH 2.5), 0.35 mM sulfated β-cyclodextrin
UV (291 nm)
2~12 μg/mL 2 μg/mL [1]
lomefloxacin, gatifloxacin, urine 70 mM phosphate buffer (pH 2.16), 40 UV 7~105 μg/mL 7 μg/mL [18]
pazufloxacin, ofloxacin mM HP-β-cyclodextrin (254 nm)
3. Other methods
Sample Matrix Condition Linear range LOD Ref.
charge transfer complexes formation 7,7,8,8-tetracynaoquinodimethane
cyclic and square-wave voltammetry at glassy carbon electrode
levofloxacin - high-performance thin layer chromatography Mobile phase: water/methanol/n-butanol/ammonia
solution (25 %) (5:5:5:0.4, v/v)
0.8~3.0 μg/mL 0.08 μg LOQ:
0.3 μg
[16]
三、毛細管電泳簡介
電泳的定義是帶電離子受到電場作用而產生的不同速率運動，最 早是用來分離蛋白質等大分子，主要的分離機制是分子質量的差異。
使用高電壓進行電泳會產生熱擴散和對流的問題，所以需要在膠體
（gel）這類的物質中進行實驗，解決對流的問題，也不能使用過高的 電壓，避免焦耳熱過大，但因此導致分離時間長，效率低。直到1980 年，使用內徑為75 μm 的毛細管電泳實驗首次被提出，毛細管因為大 表面積/體積比及細小的管柱內徑克服了熱擴散和對流的問題，也因此 可以使用更高的電壓，使得分離速率變快、分離效率更高，且可在毛 細管中使用水相進行電泳實驗，提供了多樣化的操作模式，可以分離 更多種類的樣品，而不再只是侷限在大分子或帶電物質的分離上，開 啟了毛細管電泳的時代。以下簡單介紹毛細管電泳分離的理論。
（一）電淌度
電泳是以帶電物質在電場中的不同速率作為分離基礎，帶 電離子的遷移速率可以下式來表示：
v=μeE （1）
v=離子遷移速度，μe＝電泳淌度，E＝電場強度。μe為該離子的 物理常數，從標準表中可以査到物質的電泳淌度，這是假設物質 在帶最大電荷時所得之常數，但在不同 pH 值的緩衝溶液中，還 是會有不同的淌度，稱為有效淌度。電泳淌度會與離子在毛細管
內受到的電場力 F 成正比和摩擦力 f 成反比，電場力又可寫成：
（二）電滲流（electroosmotic flow, EOF）
除了物質自己本身的電泳淌度之外，管柱內的溶液受到電場
O‐ O‐ O‐ O- O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐ O‐
Fig. 3. Development of the electroosmotic flow:
(a) negatively charged fused silica surfance.
(b) hydrated cations accumulating near surfance.
(c) bulk flow towards the cathode upon application of electric field.
EOF (a)
(b)
(c)
－
+
電滲流可以用下面這個式子表示：
E vEOF
η
= εξ 或
η μEOF = εξ
vEOF為速度，μEOF為電滲淌度，ξ 為 zeta 電位，ε 為介電常數。
電滲流會因為溶液的pH 值而影響其大小。
一般由壓力進行分離的分析技術，靠近管壁的液體會有較大 的摩擦力，導致管柱內的流速產生差異，形成層流，這就會使得 樣品的波峰變寬。而電滲流因為是由靠近管壁的液體帶動流動，
就不會產生流速的差異導致樣品峰的擴散。
電滲流的另一個優點是可以使所有的離子往同一方向移 動，不論其所帶的電荷為何。在帶負電荷的毛細管壁狀態下，電 滲流是由正極往負極移動，帶正電荷的離子因與電滲流同方向，
電滲流的另一個優點是可以使所有的離子往同一方向移 動，不論其所帶的電荷為何。在帶負電荷的毛細管壁狀態下，電 滲流是由正極往負極移動，帶正電荷的離子因與電滲流同方向，