一、 pH 值對螢光的影響
在 文 獻[1,18]中 大 都 以 酸 性 的 條 件 作 為 最 佳 的 分 離 酸 鹼 度 ， 在 本實驗中先混合不同比例的磷酸、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉，測 試不同的 pH 值對 ofloxacin 的螢光強度及分離的影響。如 Fig. 7，
使用波長 292 nm 激發，在高 pH 值時，ofloxacin 的最大放射波 長約位於 450 nm 左右，隨著 pH 值降低，放射波長產生了紅位移
（red shift），最大放射波長移到了約 507 nm，但螢光強度變得較 弱，因為 ofloxacin 的 pKa 為 6.0 和 8.0，Fig. 7 (c)的 pH 為 6.47 恰好介於這兩個 pH 值之間，導致(c)的圖形為兩個最大吸收波長 的波形重疊。本實驗是為了分離 ofloxacin 異構物，故希望能使 EOF 值較小，讓樣品有足夠的時間與 HP-β-CD 反應。pH 值越高，
分離時間越快，停留在管柱的時間就越短，也使得 ofloxacin 與 對掌選擇劑反應的時間不夠長，導致分離效果變差，所以為了降 低 EOF，延長停留在管柱裡的時間，故選擇酸性的 pH 值，為了 使緩衝溶液有較好的緩衝性，故本實驗採用以 1：1 的磷酸和磷 酸二氫鈉混合而成的緩衝溶液，緩衝溶液最佳化的條件為 50 mM 的磷酸緩衝溶液（pH 2.30），此時的 EOF 值幾近於 0，螢光偵測
器的激發波長設定為 292 nm，放射波長設定為 493 nm 作為最佳 實驗條件。
二、 HP-β-CD 濃度對分離度的影響
對掌異構物的差異只在光學活性的不同，其分子量和帶電量 都相同，使用單純的 CZE 無法分離，故需添加對掌選擇劑，本 研究選擇 HP-β-CD 作為對掌選擇劑，在此討論 HP-β-CD 的濃度 對分離度以及對 ofloxacin 螢光強度的影響，在 50 mM 磷酸緩衝 溶液（pH 2.30）中添加不同濃度的 HP-β-CD 的實驗結果為 Fig. 8，
由圖中可知添加的 HP-β-CD 濃度越高，分離效果越好，但遷移時 間也會隨之增長，HP-β-CD 濃度為 40 mM 時，分離度就可以達 到 2.0，濃度對分離度的結果呈現於 Fig. 9。且由 Fig. 8 發現添加 不同濃度的 HP-β-CD 後，ofloxacin 的峰高及面積有變大的趨勢。
為了驗證 HP-β-CD 是否可以增強 ofloxacin 的螢光強度，本 實驗固定 ofloxacin 的濃度添加不同濃度的 HP-β-CD 測試其螢光 強度的變化及增強的百分率，結果呈現於 Fig. 10。發現 HP-β-CD 的濃度從 0 mM 增加到 40 mM 時，螢光強度可以增加約 20 %，
但到了 40 mM 以後，螢光增強的幅度就漸趨緩慢，見 Fig. 11，
HP-β-CD 濃度為 60 mM 和 80 mM 時，螢光分別增強 22 %和 27
%，證實了添加 HP-β-CD 在緩衝溶液中不但可以作為對掌選擇劑 分離 ofloxacin，也可作為螢光增強劑，文獻[23]中也有以 HP-β-CD
增強其他樣品的探討，但對使用毛細管電泳分離 ofloxacin 這方 HP-β-CD 的最佳條件對溶解在純水中的 levofloxacin 最低偵測極 限可達 10-8 M。
式如 Fig. 6，本身也如 HP-β-CD 一樣是個多分子聚合物，但為直 線型聚合。因為幾丁聚醣與 HP-β-CD 在單體結構上相似，故想測 試直線型幾丁聚醣對於對掌異構物是否同樣具有分離的效果，以 此開發新的對掌選擇劑。故嘗試將幾丁聚醣添加在緩衝溶液中，
測試對分離 ofloxacin 是否有與 HP-β-CD 相同的結果。因為幾丁 聚醣需在酸性的條件下才有較好的溶解度，添加大量的幾丁聚醣 會使得 pH 值變化過大，所以在 50 mM 緩衝溶液（pH 2.30）中 固定 5 mM HP-β-CD 濃度，添加少量的幾丁聚醣，測試對分離度 的影響。電泳結果呈現於 Fig. 12。可以發現添加了幾丁聚醣後，
遷移時間變長，但是沒有一個很好的規律性，這也可能是因為實 驗誤差或因為幾丁聚醣添加在緩衝溶液後改變了 pH 值，由圖中 可發現分離度皆無較佳的改變，反而添加的濃度越大，分離度越 差。各分離度及 pH 變化整理在 Table 2。
可能是因為其為線形聚合物，無法與 ofloxacin 形成完整的 錯合物，因此想利用加入金屬離子與幾丁聚醣結合使其變得較為 剛性而有利於與 ofloxacin 結合。所以，固定 5 mM 的 HP-β-CD 及幾丁聚醣為 5×10-7 (w/v)測試添加不同濃度與不同的金屬離子 於緩衝溶液中，測試的結果見 Fig. 13，分離度整理在 Table 3。
除了 Cu2+以外，添加 Zn2+及 Co3+對分離度沒有正面的幫助，反而 使得分離度變差。添加微量的 Cu2+對分離有正面的幫助，但改變 的幅度也不大。因為幾丁聚醣與金屬離子結合的最佳 pH 值為 6，
推測可能是因為 pH 值導致幾丁聚醣未與金屬離子發生錯合反應 或是錯合反應未完全，因此無法作為有效的光學選擇劑。也可能 是 ofloxacin 對幾丁聚醣與金屬離子形成的錯合物不會結合，導 致對分離度沒有大幅度的改善。由此實驗結果可知，幾丁聚醣對 分離如 ofloxacin 之類的異構物沒有良好的助益。
四、 定量
由以上的實驗結果得知最佳的實驗條件為 50 mM 磷酸緩衝 溶 液 （pH 2.30 ） 添 加 60 mM HP-β-CD 。 以 此 實 驗 條 件 對 levofloxacin 定量。對溶在純水中的 levofloxacin 標準樣品，線性 範圍可從 1×10-7 M~5×10-3 M，R2=0.9989。levofloxacin 添加在尿 液中的定量範圍可從 5×10-6 M ~ 5×10-3 M，R2=0.9943。最低偵測 極限在 S/N 比大於 3 的狀態下分別達到 1×10-8 M 和 1×10-7 M，
最低定量極限（在線性定量範圍的最低濃度）分別為 1×10-7 M 和 5×10-6 M。總整理見 Table 4。
相較於Ouyang 和 Baeyens[18]的團隊提出毛細管電泳連接UV 偵測器的分析方法，使用 70 mM phosphate buffer（pH 2.16）添 加 40 mM HP-β-CD 為實驗條件分離 ofloxacin 及其他有對掌異構 物的藥物，對 ofloxacin 的線性範圍為 7~105 μg/mL（1.94×10-5 M~2.91×10-4 M），最低偵測極限為 7 μg/mL（約 1.94×10-5 M）。
因為本研究使用螢光偵測器，因此所測得的偵測極限值遠比此文
獻中的偵測極限值要低 2000 倍，同時線性範圍也較廣。文獻中 只檢驗溶在純水中的標準品，而本實驗除了檢測在水中及尿液中 的標準品外，還測試真實藥物及服用藥物病人的尿液，所以文獻 中 HP-β-CD 的濃度只需添加 40 mM 就足夠，但本研究卻因此需 要添加至 60 mM，才能在極大量的左旋異構物中分離出右旋異構 物。
五、 應用
(一)
藥物的不純度
levofloxacin 目 前 已 是 應 用 在 醫 療 上 的 成 藥 -可 樂 必 妥 (cravit) 的主成分，將應用本研究所得之分析條件檢測該藥 物 的 純 度 ， 是 否 真 的 只 含 有 levofloxacin 及 一 顆 藥 錠 中 levofloxacin 的真實含量為多少，實驗結果為 Fig. 14。Fig. 14
（a）為將樣品加純水稀釋 10 倍直接進行實驗所得之結果，
可以發現在高濃度的 levofloxacin 旁邊有一個小小的峰形。
Fig. 14（b）為添加了 5×10-5 M ofloxacin 於樣品中，兩電泳 圖比較後可以發現在高濃度的 levofloxacin 旁邊存在著微量 的右旋異構物。經由面積的比例得到藥物中 R(+)-ofloxacin 對 S(-)-ofloxacin (levofloxacin)的比率約為 0.1：99.9。藥物 包裝上寫內含 100 mg/錠的 levofloxacin，經由實驗測得的 levofloxacin 含量約為 93 mg。
(二)
病人尿液中藥品定量
Fig. 15（a）的電泳圖是應用此分析方法的條件檢測添 加 levofloxacin 於未服用藥物，25 歲健康女性的尿液，可從 圖中發現此分析方法應用在尿液的偵測上，基線平穩不會產 生基質干擾效應，因此尿液樣品不需經過複雜的前處理，可 稀釋後直接應用此方法作檢測。
Fig. 15（b）為未經過前處理，只以純水稀釋 10 倍的病 人尿液直接進行實驗得到的電泳圖，可知此條件應用在病人 的 尿 液 分 析 中 不 會 因 為 病 人 服 藥 或 生 理 狀 況 的 不 同 而 有 其 他的干擾發生。從圖中可以看到在 levofloxacin 旁邊依舊有 一個小小的峰形存在，經由 Fig. 15（c）添加了 5×10-5 M ofloxacin 比較後，可以確認此峰為右旋異構物，因此在病 人 尿 液 中 也 存 在 著 微 量 R(+)-ofloxacin， 且 對 levofloxacin 的比率約為 99.35：0.65。左右旋藥物的比率和藥物的比率 略有不同，推測可能是在經過人體的代謝後，有些左旋的藥 物被轉換成了右旋或左右旋藥物的代謝速率不同，導致尿液 中的比率有所差異。使用標準添加法，在稀釋 100 倍的病人 尿液中分別加入不同體積的 levofloxacin 標準品，使得最後 添 加 的 濃 度 為 0 、 1×10-5 M 、 2×10-5 M 和 5×10-5 M 的 levofloxacin，以面積對添加的 levofloxacin 濃度作圖，見 Fig.
16，得到 y=257226x+147579，R2=0.9996，測定出尿液中的
levofloxacin 含量約為 5.7×10-4 M，使用校正曲線得到的數 據是 8.6×10-4 M。由校正曲線得到的數值略高於標準添加法 所得之數值，可能是因為每個人的飲食及生活習慣的差異，
尿液基質中還是有一些成份的差異存在，導致校正曲線法所 得的數據略高於標準添加法之數據，因為在標準添加法中每 個樣品都有一樣的基質干擾，因此所得的數據較具可信度。
一般成人每日的排尿量約 1~1.5 L，依照其代謝的數據，假 設此病人服用的藥物在一天內以尿液排出 80 %，平均含量 約為 4.40×10-4 M~2.96×10-4 M，實驗的樣品是在服藥後的 3~4 小時內收集，故此樣品的濃度略高於平均濃度應該是屬 於 可 接 受 的 ， 證 明 此 方 法 對 於 測 定 病 人 尿 液 中 的 levofloxacin 的含量是有效且合理的，對監控病人的服藥量 及尋找藥物的代謝途徑提供一個簡便的方法。