一、以Thioflavin T螢光分析藥物對Trx-His6-Aβ42蛋白的影響
Thioflavin T螢光結合量在20 μM congo red與10 μM curcumin處裡 時分別下降至40% (P = 0.000)與60% (P = 0.005)，故congo red 與 curcumin 皆是良好的正控制組。而後選擇5 ~ 20 μM curcumin作為藥 物測試的正控制組，以便與細胞模式搭配比較。
NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6與NC009-7 5種化合物都 是 吲 哚 類 衍 生 物 ， 可 推 測 出 此 一 系 列 化 合 物 之 結 構 可 以 鑲 嵌 入 β-structure中並阻斷聚集的產生。於細胞實驗能更進一步分析上述這 些化合物是否能抑制Aβ42胜肽不正常的聚集或改善Aβ42胜肽之結 構，未來還可探討不同修飾之化合物對於細胞的毒性之降低以及對於 抑制聚集能力之提高的相關性。
二、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株建立
圖六中 Aβ42 序列後之 Linker 可以反映 Aβ42 之結構而影響 GFP 之構造，並以螢光亮度反映聚集之程度。於前人研究中已將此技術運 用於試管中之藥物檢測(Wurth et al., 2002)，而本實驗將建立細胞模式
28 測出 oligomers 或 fibril 之蛋白拖尾現象(Grönwall et al., 2007)，或滯
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One et al., 2004; Abdenour et al., 2011)。此外，congo red (Lorenzo and Yankner, 1994; Frid et al., 2007; Lendel et al., 2010)、吲哚類衍生物 (Cohen et al., 2006)、多酚類(Porat et al., 2006)也於前人研究中指出皆 能抑制Aβ胜肽之聚集。以上之化合物，主要與抗氧化與抗發炎相關 (Reddy and Lokesh, 1992; Sreejayan and Rao, 1994; Pan et al., 2000;
Malgorzata et al., 2001)。
於結構上，congo red可以抑制insulin fibril的形成，insulin fibril主 要 是 藉 由β-structure 所 形 成， 而 Aβ 蛋 白也 是 以anti-parallel β-sheet structure所聚集而成(Petkova et al., 2002)，而congo red可以藉由本身多 酚且扁平的結構與β-structure作用，使congo red介於兩個聚集蛋白之 間(Porat et al., 2006)，進而阻斷β-sheet structure。與congo red相似結構 的多酚類 curcumin、resveratrol、tannic acid 等皆被報導出能抑制Aβ 胜肽聚集，其主要原因也是透過其結構與以阻斷Aβ胜肽的聚集(Ono
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et al., 2004a, 2004b; Porat et al., 2006)。
Chaperones對於Aβ的聚集與毒性的影響方面，於前人研究中提及 heat-shock proteins 如 Hsp70/Hsp40(+ATP) (Yoshiike et al., 2008) 或 Hsp90可以抑制Aβ oligomers (Evans et al., 2006)形成，但無法解開 fibrils。此外，亦有研究指出 small heat-shock proteins 如Hsp20、Hsp27 與 αB-crystallin 會與Aβ (D-Aβ1-40和Aβ1-42)結合，並抑制Aβ的聚集以 及減低其毒性(Wilhelmus et al., 2006; Yoshiike et al., 2008)。Hsp27也於 前人研究中指出能與tau蛋白結合，並降低高度磷酸化tau蛋白量並增 強細胞存活率(Shimura et al., 2004)；而Hsp20於SH-SY5Y細胞中亦能 抑制Aβ的聚集並降低毒性(Lee et al., 2006)。再者，於過度表現Aβ42 之Caenorhabiditis elegans動物模式中，down-regulater heat-shock factor 1表現，會增加Aβ的蛋白聚集(Cohen et al., 2006)。由以上文獻中可以 了解到，heat-shock反應於防止Aβ聚集與毒性占有決定性之角色。
本研究以curcumin、congo red、吲哚類衍生物、多酚類以及中草 藥作為藥物篩檢的對象，其主要考量其抗氧化、活化Chaperones (Chiu and Ko, 2004)以及從藥物結構上抑制聚集(Chemical chaperones)的效 果。
四、誘導表現Aβ42-GFP細胞株之藥物篩檢
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以curcumin作為正控制組藥物，並能提高螢光亮度20%左右，此 結果與前人研究指出curcumin能從結構上與Aβ42結合且活化抗氧化 能力，從而抑制Aβ42蛋白聚集有相似之結果(Frautschy et al., 2001;
Kayed et al., 2003; Matsubara et al., 2003; One et al., 2004; Yang F et al., 2005; Sato T et al., 2006; Abdenour et al., 2011)。圖九B、C實驗中篩選 出7種候選植物萃取物與合成化合物能顯著提升Aβ42-GFP細胞之螢 (epicatechin) 、 swietemacrophyllanin (phenylpropanoid-substituted catechin) (Roy and Saraf, 2006; Falah S et al., 2008; Liu et al., 2012)，其 中兒茶素、表兒茶素與swietemacrophyllanin皆有良好的抗氧化能力 (Falah S et al., 2008)，且以swietemacrophyllanin為最佳；此外，檸檬 苦素衍生物具有抗癌症、瘧疾、細菌、HIV等能力(Roy and Saraf, 2006)。因此本實驗中大葉桃花心的莖萃取物可能含有檸檬苦素衍生 物 以 及 兒 茶 素 衍 生 物 ， 其 可 能 提 升 細 胞 抗 氧 化 能 力 ， 進 而 改 善
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Aβ42-GFP之螢光量。
綜 合 Thioflavin T 與 Aβ42-GFP 細 胞 藥 物 篩 檢 結 果 可 以 推 論 ， NC009-1、NC009-2、NC009-6三種吲哚類衍生物可能直接與Aβ42胜 肽作用或結合，藉以抑制Aβ42胜肽不正常的聚集或改善Aβ42胜肽之 結構使之無法形成oligmers或fibrils。
五、候選藥物處理與Chaperone之活化
圖 十 實 驗 中 ， 加 入 NTNU-043 、 NTNU-057 、 NTNU-059 、 NTNU-071、NC009-1、NC009-2、NC009-6能使Aβ42-GFP細胞螢光 亮度顯著提升之候選藥物處理後，其中NTNU-043、NTNU-057、
NTNU-059、NTNU-071、NC009-1以及NC009-2藥物能顯著增加Hsp27 蛋白表現量。
於前人研究中亦指出Hsp27會與Aβ (D-Aβ1-40和Aβ1-42)結合藉以降 低Aβ的聚集以及減低其毒性(Wilhelmus et al., 2006; Yoshiike et al.,
2008)，亦可藉由其anti-apoptotic activity活化Akt/PKB (Rane et al., 2003)或抑制pro-death JNK pathway (Schepers et al., 2005)增加細胞存 活率。
由本實驗與前人研究可以推論，Aβ42-GFP細胞加入NTNU-043、
NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1、NC009-2能顯著增
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加Hsp27蛋白表現量，可能藉由Hsp27蛋白chaperone的活性，幫助 Aβ42-GFP蛋白折疊更加良好而改善構形，使linker後之GFP蛋白結構 回復正常而提升螢光亮度。
六、候選藥物處理與Aβ42-GFP表現
於圖十D實驗中Aβ42-GFP細胞經藥物NTNU-043、NTNU-057、
NTNU-059、NTNU-071處理後，相較於誘導Aβ42-GFP表現組別GFP 抗體呈色有顯著增加。導致Aβ42-GFP細胞模式Aβ42-GFP表現量增加 原因可能為：(1)西方轉漬分析中EGFP抗體訊號增加是因為蛋白質摺 疊較正常而導致EGFP抗體雜合能力提升；(2)因藥物活性導致RNA轉 錄提升；(3)因藥物活性導致蛋白質轉譯增加；(4)蛋白質因摺疊正常 而減低不良蛋白分解的量。
未來可以以候選植物萃取物與合成化合物處理Aβ42-GFP細胞模 式，並以cDNA 微陣列以及2D電泳分析化合物之作用目標基因或蛋 白，藉以釐清其作用機制及目標。
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