以amyloid-β 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 以 amyloid-β 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略 Therapeutic strategies targeting amyloid-β aggregation for Alzheimer's disease. 研究生：黃鉦翔 Chen-Hsiang Huang. 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen. 中華民國 102 年 1 月.

(2) 誌謝轉眼間於師大的時光已快速飛逝，過程中學習到許多專業知識及技能，托許多人的福能如期完成學業及論文。本篇論文的完成主要感謝恩師李桂楨老師，在兩年的研究中指導邏輯思考、實驗設計、實驗技巧以及論文寫作，而讓我能完成這篇著作。此外，也非常感謝口委謝秀梅老師與廖永豐老師在研究及論文寫作上的建議與指導，使研究成果更為完善。再者，很感激李琦玫老師於我出國期間能持續我的研究主題，並能互相討論實驗的設計與結果，激盪出不一樣的想法。在 D311 的日子裡，受到許多人的照顧與協助，謝謝麗卿學姊、志信學長、怡辰學姊、婉玲學姊、可蓁學姊、于婷學姊、芷英學姊、德嫻學姊、文騰學長、允麟學長、修嘉學長在實驗上提供的指導與建議，讓我能更快熟悉實驗室的環境。而在這繁重的實驗生活中，感謝品睿、逸琦、奕澂在生活中的互相勉勵，實驗中互相打氣；也特別感謝炫江學弟、均如學妹、映伶學妹、雅婷學妹、雅貞學妹在實驗室的陪伴，尤其是常常和我腦力激盪討論實驗的炫江以及貴重儀器室助理映伶學妹技術上的幫忙，沒有各位的幫忙就沒有這篇論文的產出，真是非常感謝大家。於 Missouri University of Science and Technology 進修期間，感謝.

(3) 生命科學系系主任 Dr. Robert S. Aronstam 對在當地的照顧，以及黃郁文老師在生活上的幫忙與支持，更是感謝 Dr. Katie Shannon 在實驗室中耐心的教導，讓我在實驗技巧與思考方面更上一層樓。此外，也很謝謝 Daniel S. Cox、Ying-Se Iris Cox、秀仁學姊、裕溥學長、穎超學長、立婕學姊、於恆學長、季恆學長在美國時的幫助，讓我在異鄉求學時能有像家人一樣的感覺，讓我在美國不覺得孤單。也要感謝在背後默默支持我的爸媽、哥哥和姐姐，雖然很少回家相聚，但是常常受到你們的關心與愛護成為我讀研究所的支柱。最後要謝謝育婷總是在我實驗不順利時給予安慰與共勉，這幾年來的陪伴與扶持是我完成學業不可或缺的一大力量。一路走來要感謝的人實在太多，如有未提及之處，敬請見諒。我相信在這兩年實驗室的訓練，可以讓我在未來人生的磨練上有一定的基礎，常言道：「師父領進門，修行在個人」碩士的文憑只是職場的入場卷，進入後便是看個人努力了，盼共勉之。.

(4) 目錄. 目錄........................................................................................................ I 中文摘要 .............................................................................................. III Abstract ............................................................................................... IV 壹、緒論 ................................................................................................. 1 一、阿茲海默氏症 ........................................................................... 1 二、β-amyloid 蛋白........................................................................ 2 二、藥物篩檢之方向與模式 ........................................................... 3 貳、研究目的 ......................................................................................... 6 參、研究材料與方法 ............................................................................. 7 一、pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42、pcDNA5/FRT/TO/Aβ42GFP 重組質體之構築 ............................................................................ 7 (一) pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體 .............................. 7 (二) pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體........................... 7 二、重組質體的選殖 ....................................................................... 8 (一)轉型勝任細胞的製備與保存 .............................................. 8 (二) DNA 片段純化與接合反應 ............................................... 9 (三)細菌電穿孔轉型作用 .......................................................... 9 (四)質體 DNA 小量製備 ......................................................... 10 I.

(5) (五)質體 DNA 大量製備 ......................................................... 11 三、融合蛋白於細菌中表現與純化 ............................................. 12 四、Thioflavin T 螢光分析 ........................................................... 13 五、細胞培養、轉染與分析 ......................................................... 14 (一)細胞株繼代培養 ............................................................... 14 (二)基因轉染 ........................................................................... 15 (三)細胞影像分析 ................................................................... 15 (四)蛋白質萃取與西方轉漬分析 ............................................ 16 (二) RNA 萃取......................................................................... 18 (三)反轉錄 PCR ...................................................................... 18 (四)同步定量 PCR .................................................................. 19 六、Aβ42-GFP 細胞株之候選藥物篩檢 ...................................... 19 肆、結果 ............................................................................................... 21 一、Trx-His6-Aβ42 重組質體的確認 ........................................... 21 二、Trx-His6-Aβ42 蛋白的表現 ................................................... 21 三、Thioflavin T 螢光分析 Trx-His6-Aβ42 蛋白聚集情況 ......... 21 四、Doxycycline 誘導表現 Aβ42-GFP 細胞之建立 .................... 23 五、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株之藥物篩檢.............................. 24 六、候選藥物處理 Aβ42-GFP 細胞株活化 Chaperone 之情況.. 25 II.

(6) 伍、討論 ............................................................................................... 27 一、以 Thioflavin T 螢光分析藥物對 Trx-His6-Aβ42 蛋白的影響 ........................................................................................................ 27 二、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株建立 ......................................... 27 三、以藥物結構、抗氧化與 Chaperones 探討藥物與疾病的關係 ........................................................................................................ 29 四、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株之藥物篩檢.............................. 30 五、候選藥物處理與 Chaperone 之活化 ..................................... 32 六、候選藥物處理與 Aβ42-GFP 表現 ......................................... 33 陸、參考文獻 ....................................................................................... 34 柒、附錄圖表 ....................................................................................... 43. III.

(7) 中文摘要阿茲海默氏症是最常見的老年癡呆症，主要臨床症狀包括 Aβ 胜肽聚集而成的細胞外澱粉樣蛋白斑與 tau 蛋白形成的細胞內神經纖維糾結。Aβ 胜肽與 tau 蛋白的聚集往往是基於 β-結構互相堆疊而形成。由於藉由破壞蛋白之間的氫鍵可能抑制蛋白聚集，故可能可以從吲哚、多酚類及其衍生物和中藥材篩選出潛在的 Aβ 胜肽聚集抑制劑。為了達成以上目的，本實驗利用 thioflavin T 分析法篩選人工合成之化合物。此外，於細胞層面上將 Aβ42 胜肽與 GFP 螢光蛋白的 N 端融合，用於反映 Aβ42 聚集之程度，並建立於 SH-SY5Y 細胞和 293 細胞中，篩選出 Tet-On SH-SY5Y 細胞與 Tet-On 293 細胞。Tet-On 293 細胞被用來測試植物萃取物與天然或人工合成化合物，藉由綠色螢光訊號區別可延緩或抑制 Aβ42 聚集之抑制劑。本實驗使用 Tet-On 293 阿茲海默氏症細胞模式於高通量分析系統，並結合自動顯微鏡與圖像分析自動測試化合物的有效濃度。本實驗分析出 10 種植物萃取物與人工合成化合物，能提升 Aβ42-GFP 綠螢光之訊號，其中 NTNU-043、 NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1 以及 NC009-2 等較具潛力，能增加 Hsp27 蛋白表現，幫助抑制 Aβ42 聚集。關鍵字：阿茲海默氏症、老年癡呆症、澱粉樣蛋白斑、β-結構、澱粉樣蛋白 42。 IV.

(8) Abstract Alzheimer's disease is the most common form of dementia that is pathologically characterized by the presence of extracellular amyloid plaques formed from Aβ peptide and intracellular neurofibrillary tangles formed from tau protein. Aggregation is often based on the formation of cross-β-structure and may be inhibited by disrupting the hydrogen bonds between sheets. Thus screening for indole, polyphenol derivatives and herbal medicines might find out potential inhibitors of Aβ peptide aggregation. To do this, thioflavin T assay was used to screen the synthetic compounds. Also, Aβ42 was fused to the N-terminus of GFP to couple the aggregation state with the fluorescence of GFP and used to generate Tet-On SH-SY5Y cell and 293 cell clones. Tet-On 293 cells were used to screen herbal extracts and natural or synthetic compounds. Inhibitors that retard or block Aβ42 aggregation can be distinguished by the increasing green fluorescent signal. The effective concentration of the tested herbs and compounds will be determined by using a high content analysis system that combines automated microscopy and automated image analysis in 293 AD model. In this study, 10 herbal extracts and synthetic compounds which could significantly increase green fluorescent signal were identified. Among the 10 compounds examined, NTNU-043, NTNU-057, NTNU-059, NTNU-071, NC009-1 and NC009-2 effectively increased green fluorescent signal and enhanced Hsp27 expression.. Key. words:. Alzheimer's. disease,. cross-β-structure, Aβ42. V. dementia,. amyloid. plaques,.

(9) 壹、緒論. 一、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease). 阿茲海默氏症(Alzheimer's disease，簡稱 AD)又稱為老人癡呆症，此症狀於 1907 年被正式發表(Alzheimer, 1907)。阿茲海默氏症的發病機制是複雜的，並沒有完全了解。目前有兩種主要的假說：其一是在嗅皮層、海馬和大腦皮層的神經細胞外出現澱粉樣蛋白斑(amyloid plaque，又稱 senile plaque) (Dickson, 1997; Wisniewski et al., 1997)，以及在神經細胞內發現神經元纖維糾結(neurofibrillary tangles，簡稱 NFTs)。Amyloid plaque 的成因主要是由 β-澱粉樣蛋白(β-amyloid，簡稱 Aβ)聚集(aggregation)形成(Selkoe, 1991; Selkoe, 2001)，神經元纖維糾結成因則是 tau 蛋白高度磷酸化後形成聚集，影響微管(microtubule) 形成細胞骨架而中斷胞內物質運送與細胞訊息之傳遞，導致神經細胞死亡(Grundke-Iqbal et al., 1986; Alonso et al., 1997)。阿茲海默氏症為漸進式發病，主要病徵包括混亂(confusion)、易怒(irritability)、具有攻擊性(aggression)、情緒不穩(mood swings)、語言障礙(trouble with language)以及長期記憶的喪失(long-term memory loss) (Tabert et al., 2005; Waldemar, 2007)，後期逐漸失去身體機能，如癲癇、吞嚥困難、無法控制排便與泌尿和皮膚感染等，而最終導致死亡 (National 1.

(10) Institute on Aging, 2012)。. 阿茲海默症主要分早發型(early onset)與晚發型(late onset)，早發型阿茲海默病較罕見，僅佔阿茲海默症病人中的 5%，主要發生於 30~60 歲之間，且和基因突變相關(Bertram and Tanzi, 2008)。研究指出第 21 對染色體上的澱粉樣前驅蛋白(amyloid precursor protein，簡稱 APP)基因 Val171Ile 突變(Goate et al., 1991)，或第 14 對染色體上的早老素 1 (presenilin-1，簡稱 PSEN1)基因 Glu318Gly 突變(Taddei et al., 2002)與第 1 對染色體上早老素 2 (presenilin 2，簡稱 PSEN2)基因 Asn141Ile 突變(Levy-Lahad et al., 1995)，皆可能導致早發型阿茲海默氏症之成因。晚發型阿茲海默症發生在 60 歲以後，目前為止還未發現特定的致病基因，但有一個位於第 19 號染色體上發現的易感性基因危險因子(predisposing genetic factor) apolipoprotein E ε4 (簡稱 APOE ε4)，會增加罹病的風險(Corder et al., 1993; Roses, 1996)。此外，環境危險因子，包括農藥、重金屬、頭部受傷、生活方式和飲食習慣皆與疾病風險的增加有相關(Migliore and Coppede, 2009)。. 二、β-amyloid 胜肽. Aβ 是一段 39 到 43 個胺基酸的胜肽，阿茲海默氏症中 amyloid 2.

(11) plaque 就是由 Aβ 聚集形成的(Selkoe, 1991; Selkoe, 2001; Laz-o et al., 2005)。Aβ 是澱粉樣蛋白前驅蛋白 APP 經由 β-與 γ-分泌酶(β-、 γ-secretase)蛋白水解後形成的。β-secretase 於 APP C99 位置切割後，再經由 γ-secretase 將 β-secretase 於切割後蛋白之 N 端 39 到 43 胺基酸進行水解產生 39 到 43 個胺基酸的 Aβ。Amyloid plaque 中組成之 Aβ 最常見是 40-mer 和 42-mer 兩種型態，其不同只有 42-mer 較 40-mer 於 C 端增加 Ile41 及 Ala42 兩個胺基酸殘基。雖然 Aβ42 蛋白產量較 Aβ40 低，但 Aβ42 更容易形成 amyloid plaque ( 即較強的 amyloidogenic)，也是 amyloid plaque 最主要的成分(Roher et al., 1993; Selkoe, 2001)，在阿茲海默氏症患者中 Aβ 濃度是正常人的 1000 至 10000 倍(Funato et al., 1998)。β-Amyloid 聚集之成因是由許多的 Aβ 單體(monomer)間，藉由 cross-β structure (Sunde et al., 1997)互相堆疊形成 amyloid fibrils 後，聚集成 amyloid plaque (Fandrich, 2007)。. 三、藥物篩檢之方向與模式. 阿茲海默氏症及多種類型的小腦萎縮症起因皆是不正常蛋白形成有毒的 β-sheet 構形聚集，進而干擾細胞正常功能。至今沒有有效的阿茲海默氏症治療方式，所有目前可用的治療方法是減緩疾病的進展。Aβ 有毒的構形轉變及形成聚集發生是在致病機制的早期，然而 3.

(12) oligomer (10 kDa ~100 kDa)之形成是較具毒性的構造(Sakono and Zako, 2010)，因此找尋聚集抑制物是一治療疾病的有效策略。前人研究指出剛果紅(congo red) (Lorenzo and Yankner, 1994; Frid et al., 2007; Lendel et al., 2010)、吲哚類衍生物(indole derivatives) (Cohen et al., 2006)、多酚類(polyphenols) (Porat et al., 2006)與 Arg-Arg-coumarin (Kawasaki and Kamijo, 2012)可以抑制 amyloid fibrils 形成，也有研究發展疫苗來抑制 amyloid fibrils 形成，但目前都尚未通過人體試驗(Ray and Lahiri, 2009)。此外，有一些中國傳統草藥配方，其活性成分已指出對抗發炎與抗氧化是有益的，可能對神經退化性疾病有治療的潛力 (Simmonds, 2003)。. 現今已有許多經由抑制聚集為目標的藥物篩檢模式，如 thioflavin T 螢光實驗，原理是藉由 thioflavin T 與聚集之蛋白結合而增強 thioflavin T 螢光的釋放量(emission)，測量其聚集的相對程度(Wong and Kwon, 2011 )，或是以 filter trap 試驗，其可藉由濾膜將聚集之蛋白留於濾膜表面，再以專一性抗體雜交與呈色，進而了解目標蛋白的聚集情況(Boyé-Harnasch and Cullin, 2006; Changa and Kure, 2008; Wong and Kwon, 2011)。亦有前人研究指出將 Aβ42 蛋白連接一段 12 胺基酸片段之 linker (GSAGSAAGSGEF)再連接 GFP，其 Aβ42 蛋白 4.

(13) 摺疊會藉由 linker 影響 GFP 之構形(Waldo et al., 1999; Wurth et al., 2002; Kim et al., 2006)，因為 GFP 要摺疊成自然的螢光結構(native fluorescent structure)是較緩慢的(Cubitt et al., 1995)，因此 Aβ42-GFP 螢光亮度會受到 Aβ42 的折疊與溶解度的影響。當 Aβ42 蛋白錯誤摺疊或聚集時，會使 linker 後之 GFP 蛋白也錯誤折疊而降低螢光亮度，當以不同藥物處理後如能將螢光亮度提升，其藥物便可能可以抑制 Aβ42 之錯誤摺疊或聚集(Kim et al., 2006)。. 5.

(14) 貳、研究目的. 現階段已知阿茲海默氏症中 Aβ42 會累積成 oilgomes，再進一步形成 amyloid fibrils，最後聚集成 amyloid plaque，目前的治療方式並無法有效抑制病程之進行。故本篇研究以抑制 Aβ 聚集為治療目標，建立試管內的 Aβ42 蛋白聚集之 thioflavin T 螢光實驗藥物篩檢平台，及 Flp-InTM T-REXTM SH-SY5Y 與 293 表現 Aβ42-GFP 的細胞層次藥物篩選平台，以高通量篩選系統快速篩選藥物，開發新穎且有潛能的治療藥物。. 6.

(15) 參、研究材料與方法. 一、pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42、pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體之構築. (一) pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體由 pGEX-5X3-Aβ42 質體(林志信博士製備)以 BstYI 及 NotI 雙切出 Aβ42 片段，置入 pET-32b(+)載體(Novagen)的 BamHI 與 NotI 切位中(圖一)。所構築的質體經酵素切割及 DNA 定序確認之(圖二)。. (二) pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體以 APP cDNA (中研院廖永豐教授提供)為模板，利用 PCR 增幅 Aβ42 序列，於 5'端引入起始密碼(ATG)，並於兩端分別引入 HindIII (AAGCTT)、BamHI (GGATCC)限制酶切位，選殖入 pGEM-T Easy 質體並定序確認序列無誤。包含 12 個胺基酸 GSAGSAAGSGEF 的 linker 序列係直接合成，並於兩端分別引入 BamHI (GGATCC)、EcoRI (GAATTC)限制酶切位。GFP 序列取自 pEGFP-N1 質體，利用 PCR 於 5’端引入 EcoRI (GAATTC)限制酶切位並移除起始密碼，增幅的 GFP 序列選殖入 pGEM-T Easy 質體並定序確認序列無誤。最後將 Aβ42 序列(HindIII-BamHI 片段)、linker 序列(BamHI-EcoRI 片段)、GFP 序 7.

(16) 列(EcoRI-NotI 片段)一起置入真核表現載體 pcDNA5/FRT/TO 供選殖置入的 HindIII、NotI 切位間(圖三)。. 二、重組質體的選殖. (一)轉型(transformation)勝任細胞(competent cell)的製備與保存於含有 25 mg/ml chloramphenicol LB 培養基中培養 BL21(DE3)pLysS (Novagen) ( 使用於蛋白大量表現 ) 或 12 μg/ml tetracycline LB 培養基中培養 XL2 (Stratagene) (使用於載體 DNA 大量表現)後，以滅菌後之牙籤挑選單一菌落於含抗生素(視不同菌株使用不同抗生素)之 5 ml LB 培養液，置於 37℃培養箱以 200 rpm 震盪培養一夜，而後將隔夜培養之菌液加入 1 L 含抗生素之 LB 培養液，並分裝於 4 個 500 ml 無菌錐形瓶中，於 37℃培養箱以 200 rpm 震盪培養至 OD600 = 0.7 ~ 1.0。而後將菌液於冰上冷卻 10 分鐘，以 4,000 rpm、 4℃離心 5 分鐘。除去上清液後以 4℃之二次水重新懸浮細菌，清洗殘餘之鹽類，並以 4,000 rpm、4℃離心 5 分鐘，並去除上清液，而後再重複清洗三次。加入 3 ml 10% glycerol 將細菌懸浮，並以每管 40 μl 的體積分裝於微量離心中，並保存於-80℃。. 8.

(17) (二) DNA 片段純化與接合反應 DNA 以欲使用之限制酶切割反應後，以洋菜電泳膠體分離 DNA 片段。將目標 DNA 片段於洋菜膠中切出後以 Gel extraction kit (Viogene)純化。將膠體加入 0.5 ml GEX buffer 於 65℃乾浴機加熱 10 分鐘或至洋菜膠體完全溶解，而後將溶解之膠體置於純化用之管柱中，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘。去除廢液後加入 0.5 ml WN wash buffer，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘。再去除廢液後加入 0.5 ml WS wash buffer，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘。去除廢液後再以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，並將管柱置換於新的 1.5 ml 離心管中，並加入 25 μl Nuclease free water 靜置於室溫 20 分鐘，最後再以 13,000 rpm 離心 1 分鐘。取 2 μl 純化後 DNA 進行洋菜電泳檢查。接著取適當比例與濃度的 DNA 與載體於 1X ligation buffer (300 mM Tris-HCl pH7.8 - 100 mM MgCl2 100 mM DTT - 10 mM ATP)中，且加入 T4 DNA ligase 置於 16℃的水浴槽中進行接合反應至隔天。. (三)細菌電穿孔(electroporation)轉型作用(transformation) 將保存於-80℃的轉型勝任細胞放置於冰上解凍，取 2 μl 完成接合作用(ligation)的重組質體 DNA 與 20 μl 勝任細胞均勻混合，接著以 1.25 kV、25 μF、200 Ω 進行電穿孔(electroporation) (BIO-RAD, GENE 9.

(18) PULSER II)，將質體送入細菌內。加入 400 μl LB 培養液並置於 37℃ 水浴槽中回溫 30 分鐘。最後取適量的菌液塗於含有抗生素的 LB 培養基上(視載體而定，本研究皆為 50 μl/ml 青黴素)，並置於 37℃培養箱中培養 16 ~ 20 小時。. (四)質體 DNA 的小量製備以滅過菌的牙籤挑出 LB 培養基上之單一菌株，畫在含抗生素之 LB 培養基(視載體而定，本研究皆為 50 μl/ml 青黴素)中保留菌株，同時以 1.5 ml 離心管加入 1 ml 含有 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養液，培養所挑出的菌株，於 37℃、250 rpm 震盪培養 12 ~ 16 小時或隔夜。將培養隔夜之 1.5 ml 離心管，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液。加入 70 μl solution I (50 mM glucose - 25 mM Tris-HCl pH8.0 - 10 mM EDTA pH8.0)，並充分震盪使細菌懸浮，再加入 140 μl solution II (1% SDS - 0.2 N NaOH)，翻轉 20 下。接著加入 105 μl solution III (3M potassium acetate)，翻轉 20 下，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，將上清液移到新的 1.5 ml 離心管，加入 270 μl 的異丙醇沉澱質體 DNA，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘。去除上清液後加入 200 μl 的 70%酒精以清洗鹽類，13,000 rpm 離心 5 分鐘去除上清液。在室溫中風乾 30 分鐘，加入 10 ~ 20 μl 含 10 μg/ml RNase 的二次水。最後取 2 μl 質體 DNA， 10.

(19) 進行洋菜膠體電泳分析質體 DNA 的大小，取 100 ng 的質體 DNA，以限制酶切割確認 DNA 片段大小。. (五)質體 DNA 的大量製備以滅過菌的牙籤挑出 LB 培養基上之單一菌株，加入 1 ml 含有 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養液中以 37℃、250 rpm 培養 2 小時，再將 1 ml 菌液移置 65 ml 含 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養液中，以 37℃、250 rpm 的培養箱中震盪培養 18 ~ 24 小時。以 4℃、8,000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液。使用 Geneaid plasmid midi Kit 抽取質體 DNA。沉澱之細菌加入 4 ml PM1 溶液(未開封的 PM1 應加入 RNase A 並保存於 4 ℃冰箱中)，震盪懸浮細菌，之後加入 4 ml PM2，翻轉 20~30 次後靜置 2 分鐘，加入 4 ml PM3，翻轉 20~30 次後，以 4℃、20,000 g 離心 15 分鐘。將純化用管柱取出以 5 ml PEQ 潤洗後，將離心後的上清液到入管柱中(須避免白色漂浮物掉入管柱中)，待上清液完全通過管柱後，加入 12 ml PW 清洗，將管柱放於含有 6 ml 異丙醇的 50 ml 離心管上，接著加入 8 ml PEL 於管住中將 DNA 溶出，並將溶液混合均勻使 DNA 析出沉澱，以 4℃、20,000 g 離心 30 分鐘，移除上清液後，分別加入 63 μl 的 ddH2O，上下震盪後將離心管置於 37℃水浴槽中 10 分鐘，並將 DNA 合併為兩管，加入 16 μl (1/20 V) 5 M 的 NaCl，並 11.

(20) 加入 1 ml 的 99.5%的酒精，離心 13,000 rpm、1 分鐘，再加入 500 μl 70% 酒精清洗鹽類，離心 13,000 rpm、1 分鐘，在室溫下風乾。最後加入 100 μl 的 Nuclease free water 回溶質體 DNA，以 NanoDrop ND-1000 測量質體 DNA 濃度，並取 100 ng 的 DNA 以限制酶切割確認，並保存於-20℃冰箱。. 三、融合蛋白於細菌中表現與純化. 將載體 pET-32b(+)與所構築完成之 pET-32b(+)-His6-Trx-Aβ42 重組質體分別轉型入表現勝任細胞 BL21(DE3)pLysS 菌株內。挑選單一菌落以 1 ml 含有 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養液中以 37℃、250 rpm 培養隔夜。將隔夜培養之菌液加入 50 ml LB 培養液中以 250 ml 錐形瓶培養至. OD600. = 0.6 ~ 0.8 後，加入. IPTG. (Isopropyl. β-D-1-thiogalactopyranoside)至 0.4 μM 進行蛋白質誘導表現 2 小時，而後離心 6,000 g、20 分鐘收集細菌，存於-20℃冰箱備用。使用 His Bind Kits (Novagen)純化目標蛋白。加入 8 ml binding buffer (20 mM NaH2PO4 - 500 mM NaCl - 30 mM imidazole pH8.0)至離心後之細菌，並重新懸浮以超音波震盪器將細菌打破使蛋白釋出，接著以 20,000 g、4℃、20 分鐘。未使用純化管住先以 8 ml 滅菌二次水清洗後，以 12 ml charge buffer 填充鎳離子，再加入 8 ml binding buffer 12.

(21) 清洗。將離心後之上清液，以 0.22 μM 濾膜過濾後注入管柱中。待管柱中液體的滴定完成後，加入 30 ml wash buffer (20 mM NaH2PO4 500 mM NaCl - 30 mM imidazole pH8.0)清洗管柱，而後加入 4 ml elute buffer (20 mM NaH2PO4 - 500 mM NaCl - 500 mM imidazole pH7.4)將目標蛋白析出，再將其蛋白利用 Bio-Rad Protein Assay 定量後，存於 4℃備用。. 四、Thioflavin T 螢光分析. 將純化後 Trx-His6-Aβ42 蛋白稀釋於 reaction buffer (150 mM NaCl - 20 mM Tris-HCl pH 8.0) (Rangachari et al., 2007)中，使最後總體積為 100 μl、10 μM Trx-His6-Aβ42 蛋白濃度，於 37℃反應 0 至 48 小時後，加入 10 μM thioflavin T (Sigma)反應 5 分鐘，使用螢光儀(Microplate Fluorescence reader FLx800)選取 excitation 420/50 nm 與 emission 485/20 nm 來讀取螢光值，測試其聚集情形。正控制組藥物測試實驗中，分別取 congo red 0.2 ~ 20 μM、 curcumin 0.1 ~ 20 μM (溶於 1% DMSO)待測之化合物，加入 10 μM 之 Trx-His6-Aβ42，置於不透光 96 孔盤，於 37℃反應 48 小時後，加入 10 μM thioflavin T 反應 5 分鐘，使用螢光儀測試聚集情形。藥物篩檢實驗中，以 10 μM Trx-His6-Aβ42 蛋白分別加入 curcumin 13.

(22) 5 μM、10 μM、20 μM 與本校化學系姚清發教授提供之化合物(表一) NC001 系列(包括 1、2、3、4、5、6、7、13)、NC002 系列(包括 5、 6)、NC004 系列(包括 1、2、3)與 NC009 系列(包括 1、2、3、4、6、 7、8、9、10) (Janreddy et al., 2011)，濃度分別為 5 μM、10 μM、20 μM，並以 10 μM Trx-His6-His6 為負控制組，於 37℃反應 48 小時後，加入 10 μM thioflavin T 反應 5 分鐘，選取 excitation 420/50 nm 與 emission 485/20 nm 來讀取螢光值。. 五、細胞培養、轉染與分析. (一)細胞株繼代培養本研究使用SH-SY5Y Flp-In宿主細胞(李麗卿博士，林志信博士製備)與293 Flp-In宿主細胞(Invitrogen)，於37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。Flp-In宿主細胞使用含10% FBS、1 mM sodium pyruvate、1.5 g/L sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin之 DMEM/F12 (SH-SY5Y細胞)或DMEM (293細胞)，調整PH值為7.2 ~ 7.4 後，加入含有抗生素 5 μg/ml blasticidin S 與 200 μg/ml G418 (SH-SY5Y細胞)或100 μg/ml zeocin (293細胞)於培養液中，待細胞至8 分滿，以稀釋5倍(SH-SY5Y細胞)或10倍(293細胞)進行繼代培養。. 14.

(23) (二)基因轉染(transfection) 接種 5×105 個細胞於 6 孔細胞培養盤中，隔天代其完全貼附後進行基因轉染。其方法為：準備 250 μl OptiMEM 培養液(Gibco)，加入 5 μl T-Pro (Invitrogen)均勻混合。另外再準備 250 μl OptiMEM 培養液後，取重組質體 0.5 μg pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 與 4.5 μg pOG44，加入其中均勻混合，等待反應 5 分鐘。將已作用 5 分鐘之 T-Pro OptiMEM 混合液與 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP - pOG44 - OptiMEM 混合液混合並反應 20 分鐘。後將上述 500 μl 的混合液，加到 6 孔細胞培養盤中，再加入 500 μl 不含血清與抗生素之 DMEM (293 細胞) 或 DEME/F12 (SH-SY5Y 細胞)培養 6 小時。而後除去細胞培養液，加入不含抗生素之 10% FBS 之 DMEM (293 細胞)或 DEME/F12 (SH-SY5Y 細胞 )培養液培養 2 天待細胞恢復。而後使用含篩選 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 質體之抗生素 100 μg/ml hygromycin B、5 μg/ml blasticidin S 培養液，進行細胞株之篩選。待篩選完成後，將細胞培養在 10% FBS、100 μg/ml hygromycin B、5 μg/ml blasticidin S、 100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin 之 DMEM (293 細胞)或 DEME/F12 (SH-SY5Y 細胞)培養液中。. (三)細胞影像分析 15.

(24) 使用 10 μg/ml doxycycline 誘導 Aβ42-GFP 表現 2 天，待要觀察細胞前 30 分鐘加入 100 ng/ml hochest 33342 (Molecular Probes)於 37℃、 5% CO2 細胞培養箱中反應 30 分鐘，利用活細胞影像儀或高通量(high content)活細胞影像儀觀察 Aβ42-GFP 蛋白的表現情況。加藥處理 2 天後，待要觀察細胞前 30 分鐘加入 100 ng/ml hochest 33342 於 37℃、5% CO2 細胞培養箱中反應 30 分鐘，利用高通量活細胞影像儀，進行拍照分析。. (四)蛋白質萃取與西方轉漬分析以 1,000 g 離心收集細胞，且以 PBS 清洗 3 次。加入 50 μl RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH7.4 - 150 mM NaCl - 1 mM PMSF - 1 mM EDTA - 5 μg/ml aprotinin - 5 μg/ml leupeptin - 1% Triton X-100 - 1% sodium deoxycholate - 0.1% SDS)，置於冰上作用 30 分鐘。細胞以超音波震盪 25 下，以 4℃、14,000 g 離心 30 分鐘。取上清液至新的 1.5 ml 微量離心管，上清液之蛋白以 Bio-Rad Protein Assay 進行蛋白質定量。取 20 µg 的蛋白質加入 sample buffer (50 mM Tris pH6.8 - 2% SDS - 10% glycerol - 2.5% β-mercaptoethanol - 0.005% bromophenolblue)後以 100℃熱水煮 5 分鐘。接著進行 SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)，而後使用 XCell IITM Blot Module (Invitrogen)加入 transfer buffer (25 16.

(25) mM Tris - 0.2 M glycine - 20% methanol)，以 200 mA、120 分鐘將蛋白質轉漬到硝化纖維膜(nitrocellulose transfer membrane, Whatman，200 mA，120 分鐘)上。轉漬完成後將硝化纖維膜浸泡於 blocking buffer (10% skim milk in PBS)，於 4℃冰箱反應至隔天或室溫 2 小時。將硝化纖維膜以 1X wash buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween 20) 清洗硝化纖維膜三次，每次約 15 分鐘。而後加入一級抗體 anti-His (1:1000 稀釋，Acris)、anti-GFP (1:500 稀釋，Santa cruz)、anti-GAPDH (1:1000 稀釋，MDBio)、anti-β-actin (1:5000 稀釋，Novus)、anti-Hsp27 (1:200 稀釋，Santa cruz)、anti-HSPA5 (GRP78) (1:200 稀釋，Santa cruz)、(1:200 稀釋，Santa cruz)、anti-HSPA1A (HSP70) (1:200 稀釋， Santa cruz)於室溫下作用 2 小時，以 wash buffer 清洗三次，每次約 15 分鐘，第二次使用含 1% skim milk 之 wash buffer。而後加入 horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit IgG (1:5000 稀釋，Gene Tex)或 horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-mouse IgG (1:5000 稀釋，Gene Tex) 或 horseradish peroxidase (HRP) conjugated dog anti-goat IgG (1:5000 稀釋，Gene Tex)之二級抗體，於室溫作用 1.5 小時，之後以 wash buffer 清洗三次，第二次使用含 1% skim milk 之 wash buffer，每次 15 分鐘。最後加入冷光呈色試劑(Millipore)呈色，並使用 ImagerReader LAS-4000 機器與軟體偵測蛋白表現。 17.

(26) (五) RNA 萃取將 6 孔細胞培養盤取出，以 1X PBS 清洗細胞，加入 250 μl TRIzol 將細胞在培養盤中沖散，並收集至 1.5 ml 的微量離心管，上下翻轉後放置於冰上 5 分鐘，再加入 1/5 倍體積的 chloroform 混合，上下翻轉，使之混合均勻，並放置於冰上作用 5 分鐘，而後以 4℃、13,000 rpm 離心 15 分鐘，分離蛋白質。吸取上清液移至新的離心管，並取 0.8 倍體異丙醇混合均勻，放置於-20℃冰箱作用至少 1 小時，以 4℃、 13,000 rpm 離心 10 分鐘，沉澱 RNA 及去除上清液，加入 70%酒精 (DEPC-ddH2O 稀釋) 400 μl 清洗，並以 7,000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液後，在重複酒精清洗步驟一次。置於室溫中風乾，再以 40 μl DEPC-ddH2O 將 RNA 回溶。取 2 μl 的 RNA 進行 0.8%的洋菜膠體電泳，確認由細胞中抽出的 RNA 品質，並以 NanoDrop ND-1000 測定 RNA 濃度，於-80℃冰箱保存。. (六)反轉錄 PCR (Reverse transcription PCR；簡稱 RT-PCR) 取 6.25 μg 的 RNA，加入 RNase-free DNase 0.5 U (TaqMan)去除樣品中的 DNA，並以 DEPC-ddH2O 補足至 25 μl，置於以 37℃反應 30 分鐘，再以 65℃反應 15 分鐘去除酵素活性。利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)進行反轉錄作 18.

(27) 用。樣品取 1.5 μl RNA、0.6 μl 25Χ dNTPs、1.5 μl 10X random primers、 1.5 μL 10X reverse transcription buffer、4.65 μl nuclease-free H2O、0.75 μl MultiScribeTM reverse transcriptase，於 25℃反應 10 分鐘、37℃反應 2 小時、85℃反應 5 分鐘，反應完成後的 cDNA 樣品，放置於-20℃ 冰箱中保存。. (七)同步定量 PCR (Real-time PCR；簡稱 qPCR) 同步定量 PCR 使用 EGFP 的螢光探針 PN4331348 (Applied Biosystems)偵測誘導表現 Aβ42-GFP 基因的表現量，並使用 HuHPRT 的螢光探針 4326321E (Applied Biosystems)作為控制組，反應溶液配置如下：取 100 ng cDNA、7.5 μl 2X master mix 包含有 MgCl2 溶液和預混的 SYBR green 染料、0.75 μl 20X probe、1.75 μl ddH2O，將樣品放入 ABI Real-time PCR system 作反應，同步偵測及定量 PCR 產物。. 六、Aβ42-GFP 細胞株之候選藥物篩檢藥物篩檢流程於圖九 A 中表示，接種 0.8 × 104 個細胞於 96 孔盤，於 24 小時後以 1 μM、2.5 μM、5 μM 之 curcumin 前處理，8 小時後加入 doxycycline 誘導表現 Aβ42-GFP 蛋白的表現，於第 96 小時以 hochest33342 染核經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。待測植物萃取物與合成化合物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 19.

(28) 誘導表現 Aβ42-GFP 蛋白的表現，於 3 天後以 hochest33342 染核經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。. 20.

(29) 肆、結果. 一、Trx-His6-Aβ42 重組質體的確認. pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體，圖二 A 顯示選殖入 pET-32b(+)的 Aβ42 序列。將所構築的重組質體以 BstYI 及 NotI 雙切，經洋菜膠體電泳分析可得到 163 bp 之 Aβ42 片段(圖二 B)。. 二、Trx-His6-Aβ42 蛋白的表現. pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體經由轉型作用進入表現宿主 BL21(DE3)pLysS 細胞，以 0.4 μM IPTG 誘導 3 小時後，以親和性管住進行純化目標蛋白，而後利用 Coomassie Blue 染色觀察誘導與純化之結果。如圖三 A，23 kDa 之 Trx-His6-Aβ42 融合蛋白在誘導後表現量明顯增加，其純化效果也很顯著。將相同之蛋白以西方轉漬分析並以 anti-His 抗體進行雜合呈色，可得知所誘導與純化之蛋白確實為目標蛋白 Trx-His6-Aβ42 (圖三 B)。. 三、Thioflavin T 螢光分析 Trx-His6-Aβ42 蛋白聚集情況. 使用圖三純化後之蛋白，以 10 μM Trx-His6-Aβ42 蛋白濃度於 37 21.

(30) ℃反應 0 至 48 小時後，加入 10 μM thioflavin T 反應 5 分鐘，選取 excitation 420/50 nm 與 emission 485/20 nm 來讀取螢光值，可觀察出 Trx-His6-Aβ42 蛋白隨著 0 小時、24 小時、48 小時螢光強度從 250、 292 至 315，且於 48 小時達到顯著差異(P = 0.003) (圖四 A)。於抑制 Trx-His6-Aβ42 蛋白聚集正控制組實驗圖四 B 中，以 1% DMSO做為控制組，可以觀察到當我們處理congo red (0.2 ~ 20 μM)、 curcumin (0.1 ~ 10 μM)時，在20 μM congo red與10 μM curcumin時分別下降至40% (P = 0.000)與60% (P = 0.005)，故congo red與curcumin 可作為本篩選平台之正控制組之藥物，且curcumin作用濃度較低。圖五中取10 μM Trx-His6-Aβ42蛋白與20 μM、10 μM、5 μM之 curcumin以及合成化合物，NC001系列(1、2、3、4、5、6、7、13)、 NC002系列(5、6)、NC004系列(1、2、3)與NC009系列(1、2、3、4、 6、7、8、9、10)共同反應，並以10 μM Trx-His6-His6蛋白為控制組。當反映2天後加入10 μM thioflavin T反應5分鐘後觀察化合物對Aβ42 抑制聚集生成的影響。數據呈現Trx-His6-Aβ42蛋白在經由curcumin (20 μM、10 μM、5 μM) 處理之正控制組抑制Aβ42聚集至54% (P = 0.000)、68% (P = 0.000)、 76% (P = 0.005)。而在Trx-His6-His6蛋白於2天內並無特別明顯之聚集，並且與Trx-His6-Aβ42蛋白螢光值相差約四倍。在測試合成化合物 22.

(31) 方面，NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6與NC009-7 5種化合物於濃度20 μM時，分別能使蛋白質聚集降至79% (P = 0.010)、70% (P = 0.011)、78% (P = 0.022)、71% (P = 0.000)、84% (P = 0.004)，但未較curcumin更好抑制Aβ42聚集的能力。. 四、Doxycycline 誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株之建立. pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體，圖六 A 顯示選殖入 pcDNA5/FRT/TO 的 Aβ42 序列。將所構築的重組質體以 HindIII 及 NotI 雙切，經洋菜膠體電泳分析可得到 890 bp 之 Aβ42-GFP 片段(圖六 C)。將 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體(圖六)，以 Flp-In T-Rex 系統進行. 293. 及. SH-SY5Y. 細胞株之建立。將. pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 及 pOG44 質體(包含 Flp recombinase)共轉入 Flp-In 宿主細胞中，而後利用 hygromycin 與 blasticidin 進行成功轉染細胞之篩選(圖七)。並建立 Flp-In GFP 細胞，作為對照。. 上述成功建立之細胞株，加入 doxycycline 誘導 GFP、Aβ42-GFP 表現 2 天後，進行活細胞影像系統觀察，可觀察到螢光訊號之產生(圖八 A)。螢光定量後，293 細胞及 SH-SY5Y 細胞 Aβ42-GFP 誘導後螢光量分別為 GFP 螢光量 5.1% (P = 0.001)、5.7% (P < 0.001)，皆達到 23.

(32) 顯著差異(圖八 B)。檢測 293 Aβ42-GFP 與 SH-SY5Y Aβ42-GFP 細胞經 doxycycline 誘導二天 Aβ42-GFP 基因表現 RNA (圖八 C)。293 GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 30 倍，293 Aβ42-GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 25 倍，SH-SY5Y Aβ42-GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 28 倍， SH-SY5Y Aβ42-GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 25 倍，各細胞間 RNA 誘導表現相差不遠。於圖八 D 西方轉漬分析之結果可看出 Aβ42-GFP 表現量相較於 GFP 低。但將相同量之蛋白分別呈色後 (圖八 E)，仍可偵測到 Aβ42-GFP (曝光 30 秒)蛋白的誘導表現，但相對曝光時間較 GFP (曝光 10 秒)長 20 秒。. 五、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株之藥物篩檢. 利用高通量影像分析 293 Aβ42-GFP 細胞抑制聚集螢光亮度檢測。藥物篩檢流程於圖九 A 中表示，293 Aβ42-GFP 細胞以 1 μM、2.5 μM、5 μM 之 curcumin 前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 Aβ42-GFP 蛋白的表現，於 3 天後以 hochest33342 染核經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。於圖九 B、C 中，以 DMSO 處理的組別當控制組，經 1 μM、2.5 μM、5 μM curcumin 處理後分別可提升 24.

(33) Aβ42-GFP 蛋白之螢光亮度至 109% (P = 0.022)、114% (P = 0.007)、 122% (P = 0.005)。圖九 B、C 中，以 curcumin 處理為正控制組，待測植物萃取物與合成化合物溶於 DMSO 中，最後作用濃度為 0.1% DMSO，觀察蛋白聚集的螢光狀況後，以 DMSO 處理之組別螢光亮度為 100%，其中以 3 μM 之 NC009-1、NC009-2、NC009-6 與 1 μg/ml 之 NTNU-043、 NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071，分別可將螢光量提升至 147% (P = 0.004)、124% (P = 0.034)、118% (P = 0.000)、120% (P = 0.004)、121% (P = 0.017)、123% (P = 0.010)、132% (P = 0.001)。. 六、候選藥物處理 Aβ42-GFP 細胞株活化 Chaperone 之情況. 利用西方轉漬法分析 293 Aβ42-GFP 細胞經 curcumin 以及 NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1、NC009-2、 NC009-6藥物處理後，活化不同chaperones之情況。如圖十B所示誘導 Aβ42-GFP蛋白表現後，Hsp27蛋白表現量下降至64% (P = 0.012)，而藥物NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1、 NC009-2處理後有顯著增加，分別提升至91% (P = 0.027)、99% (P = 0.015)、82% (P = 0.026)、83% (P = 0.028)、89% (P = 0.034)以及83% (P = 0.028)；然而HSPA1A (圖十A)與HSPA5 (圖十C)於誘導後與加藥處 25.

(34) 理並無顯著差別。於圖十D中以誘導Aβ42-GFP表現組為100%，經藥物NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071處理後，相較於誘導Aβ42-GFP表現組有顯著的增加，分別提升至158%、178%、 186%、174%且達到顯著差異(P < 0.05)。. 26.

(35) 伍、討論. 一、以Thioflavin T螢光分析藥物對Trx-His6-Aβ42蛋白的影響. Thioflavin T螢光結合量在20 μM congo red與10 μM curcumin處裡時分別下降至40% (P = 0.000)與60% (P = 0.005)，故congo red 與 curcumin 皆是良好的正控制組。而後選擇5 ~ 20 μM curcumin作為藥物測試的正控制組，以便與細胞模式搭配比較。 NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6與NC009-7 5種化合物都是吲哚類衍生物，可推測出此一系列化合物之結構可以鑲嵌入 β-structure中並阻斷聚集的產生。於細胞實驗能更進一步分析上述這些化合物是否能抑制Aβ42胜肽不正常的聚集或改善Aβ42胜肽之結構，未來還可探討不同修飾之化合物對於細胞的毒性之降低以及對於抑制聚集能力之提高的相關性。. 二、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株建立. 圖六中 Aβ42 序列後之 Linker 可以反映 Aβ42 之結構而影響 GFP 之構造，並以螢光亮度反映聚集之程度。於前人研究中已將此技術運用於試管中之藥物檢測(Wurth et al., 2002)，而本實驗將建立細胞模式 27.

(36) 進行藥物篩檢。從圖八中 293 Aβ42-GFP 與 SH-SY5Y Aβ42-GFP 可看出經 doxycycline 誘導 2 天後其螢光亮度只有些微的增加，以高通量螢光分析 293 細胞及 SH-SY5Y 細胞 Aβ42-GFP 誘導後螢光量分別為 GFP 螢光量 5.1% (P = 0.001)、5.7% (P < 0.001)。然而除了蛋白結構會影響螢光亮度外，其他包括 RNA 表現與蛋白表現量皆會影響。因此本實驗檢測 293 與 SH-SY5Y 之 Aβ42-GFP 與 GFP 細胞株，其 RNA 誘導表現相差不遠(圖八 C)。而在蛋白表現的結果圖八 D 中， GFP 細胞株所誘導的蛋白訊號較強，而 Aβ42-GFP 所雜交的訊號較弱。其原因可能為 GFP 抗體對於結構正常的 GFP 蛋白結合力較強，相對的 Aβ42-GFP 蛋白由於 Aβ42 胜肽結構影響，導致 GFP 抗體辨識能力降低；抑或是 Aβ42-GFP 蛋白對於細胞而言是有害的蛋白，對於此蛋白細胞可能會將 Aβ42-GFP 予以清除，故在圖八 D 並無法看出與圖八 C 之 RNA 表現量有相同的誘導倍率，但可從圖八 E 中檢測出蛋白是有表現的。本 AD 模式細胞因為 Aβ42 帶有一 27 kDa GFP 蛋白，可能會影響 Aβ42 聚集成 oligomers 之過程，故 AD 模式細胞主要是以初期 Aβ42 聚集成 oligomers 階段為模型，因此於圖八 D 並無法於分離膠體中檢測出 oligomers 或 fibril 之蛋白拖尾現象(Grönwall et al., 2007)，或滯 28.

(37) 留於膠體上方。. 三、以藥物結構、抗氧化與 Chaperones 探討藥物與疾病的關係. 目前研究指出curcumin是一種具有抗氧化、抗發炎的多酚類，於不同的研究中皆指出在阿茲海默氏症模式中，curcumin可以減少與抑制Aβ胜肽之聚集以及形成(Frautschy et al., 2001; Kayed et al., 2003; One et al., 2004; Abdenour et al., 2011)。此外，congo red (Lorenzo and Yankner, 1994; Frid et al., 2007; Lendel et al., 2010)、吲哚類衍生物 (Cohen et al., 2006)、多酚類(Porat et al., 2006)也於前人研究中指出皆能抑制Aβ胜肽之聚集。以上之化合物，主要與抗氧化與抗發炎相關 (Reddy and Lokesh, 1992; Sreejayan and Rao, 1994; Pan et al., 2000; Malgorzata et al., 2001)。於結構上，congo red可以抑制insulin fibril的形成，insulin fibril主要是藉由 β-structure 所形成，而 Aβ 蛋白也是以 anti-parallel β-sheet structure所聚集而成(Petkova et al., 2002)，而congo red可以藉由本身多酚且扁平的結構與β-structure作用，使congo red介於兩個聚集蛋白之間(Porat et al., 2006)，進而阻斷β-sheet structure。與congo red相似結構的多酚類 curcumin、resveratrol、tannic acid 等皆被報導出能抑制Aβ 胜肽聚集，其主要原因也是透過其結構與以阻斷Aβ胜肽的聚集(Ono 29.

(38) et al., 2004a, 2004b; Porat et al., 2006)。 Chaperones對於Aβ的聚集與毒性的影響方面，於前人研究中提及 heat-shock proteins 如 Hsp70/Hsp40(+ATP) (Yoshiike et al., 2008) 或 Hsp90可以抑制Aβ oligomers (Evans et al., 2006)形成，但無法解開 fibrils。此外，亦有研究指出 small heat-shock proteins 如Hsp20、Hsp27 與 αB-crystallin 會與Aβ (D-Aβ1-40和Aβ1-42)結合，並抑制Aβ的聚集以及減低其毒性(Wilhelmus et al., 2006; Yoshiike et al., 2008)。Hsp27也於前人研究中指出能與tau蛋白結合，並降低高度磷酸化tau蛋白量並增強細胞存活率(Shimura et al., 2004)；而Hsp20於SH-SY5Y細胞中亦能抑制Aβ的聚集並降低毒性(Lee et al., 2006)。再者，於過度表現Aβ42 之Caenorhabiditis elegans動物模式中，down-regulater heat-shock factor 1表現，會增加Aβ的蛋白聚集(Cohen et al., 2006)。由以上文獻中可以了解到，heat-shock反應於防止Aβ聚集與毒性占有決定性之角色。本研究以curcumin、congo red、吲哚類衍生物、多酚類以及中草藥作為藥物篩檢的對象，其主要考量其抗氧化、活化Chaperones (Chiu and Ko, 2004)以及從藥物結構上抑制聚集(Chemical chaperones)的效果。. 四、誘導表現Aβ42-GFP細胞株之藥物篩檢 30.

(39) 以curcumin作為正控制組藥物，並能提高螢光亮度20%左右，此結果與前人研究指出curcumin能從結構上與Aβ42結合且活化抗氧化能力，從而抑制Aβ42蛋白聚集有相似之結果(Frautschy et al., 2001; Kayed et al., 2003; Matsubara et al., 2003; One et al., 2004; Yang F et al., 2005; Sato T et al., 2006; Abdenour et al., 2011)。圖九B、C實驗中篩選出7種候選植物萃取物與合成化合物能顯著提升Aβ42-GFP細胞之螢光表現量，其中NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071屬於工研院植物萃取物，而NC009-1、NC009-2、NC009-6為本校化學系姚清發教授所合成之吲哚類衍生物。 NTNU-071 是大葉桃花心 (Swietenia macrophylla King) 的莖萃取物，於文獻中大葉桃花心之枝條、葉片及樹皮含有檸檬苦素衍生物 (limonoids) 以及兒茶素 (catechin) 以及其衍生物表兒茶素 (epicatechin) 、 swietemacrophyllanin. (phenylpropanoid-substituted. catechin) (Roy and Saraf, 2006; Falah S et al., 2008; Liu et al., 2012)，其中兒茶素、表兒茶素與swietemacrophyllanin皆有良好的抗氧化能力 (Falah S et al., 2008)，且以swietemacrophyllanin為最佳；此外，檸檬苦素衍生物具有抗癌症、瘧疾、細菌、HIV等能力(Roy and Saraf, 2006)。因此本實驗中大葉桃花心的莖萃取物可能含有檸檬苦素衍生物以及兒茶素衍生物，其可能提升細胞抗氧化能力，進而改善 31.

(40) Aβ42-GFP之螢光量。綜合 Thioflavin T 與 Aβ42-GFP 細胞藥物篩檢結果可以推論， NC009-1、NC009-2、NC009-6三種吲哚類衍生物可能直接與Aβ42胜肽作用或結合，藉以抑制Aβ42胜肽不正常的聚集或改善Aβ42胜肽之結構使之無法形成oligmers或fibrils。. 五、候選藥物處理與Chaperone之活化. 圖十實驗中，加入 NTNU-043 、 NTNU-057 、 NTNU-059 、 NTNU-071、NC009-1、NC009-2、NC009-6能使Aβ42-GFP細胞螢光亮度顯著提升之候選藥物處理後，其中NTNU-043、NTNU-057、 NTNU-059、NTNU-071、NC009-1以及NC009-2藥物能顯著增加Hsp27 蛋白表現量。於前人研究中亦指出Hsp27會與Aβ (D-Aβ1-40和Aβ1-42)結合藉以降低Aβ的聚集以及減低其毒性(Wilhelmus et al., 2006; Yoshiike et al., 2008)，亦可藉由其anti-apoptotic activity活化Akt/PKB (Rane et al., 2003)或抑制pro-death JNK pathway (Schepers et al., 2005)增加細胞存活率。由本實驗與前人研究可以推論，Aβ42-GFP細胞加入NTNU-043、 NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1、NC009-2能顯著增 32.

(41) 加Hsp27蛋白表現量，可能藉由Hsp27蛋白chaperone的活性，幫助 Aβ42-GFP蛋白折疊更加良好而改善構形，使linker後之GFP蛋白結構回復正常而提升螢光亮度。. 六、候選藥物處理與Aβ42-GFP表現. 於圖十D實驗中Aβ42-GFP細胞經藥物NTNU-043、NTNU-057、 NTNU-059、NTNU-071處理後，相較於誘導Aβ42-GFP表現組別GFP 抗體呈色有顯著增加。導致Aβ42-GFP細胞模式Aβ42-GFP表現量增加原因可能為：(1)西方轉漬分析中EGFP抗體訊號增加是因為蛋白質摺疊較正常而導致EGFP抗體雜合能力提升；(2)因藥物活性導致RNA轉錄提升；(3)因藥物活性導致蛋白質轉譯增加；(4)蛋白質因摺疊正常而減低不良蛋白分解的量。未來可以以候選植物萃取物與合成化合物處理Aβ42-GFP細胞模式，並以cDNA 微陣列以及2D電泳分析化合物之作用目標基因或蛋白，藉以釐清其作用機制及目標。. 33.

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(51) 柒、附錄圖表. 圖一、pET-32b(+)載體輿圖。(A)載體 pET-32b(+)。圖上標記出接上 Aβ42 片段的 BamHI 與 NotI 切位。(B) pET-32b(+)的 Tag 及 MCS。帶有組胺酸標記(His-Tag)可使用親和性管柱純化目標蛋白，硫氧還蛋白標記(Trx-Tag)可增加目標蛋白溶解度。 43.

(52) 圖二、pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體。(A) pGEX-5X-3 重組質體上包含 Aβ42 序列及其兩端的 BstYI、NotI 限制酶切位共 163 bp 序列。 (B) pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體限制酶切割圖譜。以 NotI、 BstYI 限制酶雙切載體(lane 1)及重組質體(lane 2)後，以 1.0%洋菜膠體電泳確認切出包含 Aβ42 的 163 bp 片段。Lanes M1 (1kb marker)、M2 包含片段大小標記。. 44.

(53) 圖三、Trx-His6-Aβ42 融合蛋白的誘導表現及純化。Lane 1 包含經 IPTG 誘導表現、金屬離子親和層析法純化的 Trx-His6-Aβ42 融合蛋白，lane 2、lane 3 則分別包含未純化的誘導表現、未誘導表現蛋白。(A)為 coomassie blue 染色、(B)為 His 抗體染色結果。. 45.

(54) 圖四、Trx-His6-Aβ42 融合蛋白聚集情況與正控制組之測試。 (A) Trx-His6-Aβ42 融合蛋白於 37 ℃、 0 ~ 48 小時之聚集情況。(B) Trx-His6-Aβ42 融合蛋白分別以 congo red (0.2 ~ 20 μM)、curcumin (0.1 ~ 10 μM)處理後以 10 μM thioflavin T 測量其螢光讀值。. 46.

(55) 圖五、以 Trx-His6-Aβ42 與 Thioflavin T 螢光結合量來分析 20 μM、 10 μM 與 5 μM 濃度之合成化合物抑制聚集產生之情形。負控制組為 Trx-His6-His6 (Trx-His6)蛋白於 0 ~ 2 天之螢光結合量。*為 P < 0.05， **為 P < 0.01，***為 P < 0.001。. 47.

(56) 圖六、pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體。(A) Aβ42 序列兩端包含 HindIII、BamHI 限制酶切位，linker 序列兩端包含 BamHI、EcoRI 限制酶切位，GFP 序列(部分)兩端包含 EcoRI、NotI 限制酶切位序列。 (B) pcDNA5/FRT/TO 載體及供選殖置入的 HindIII、NotI 切位。(C) pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體的限制酶切割圖譜。HindIII、 NotI 雙切載體(lane 1)及重組質體(lane 2)後，以 1.0%洋菜膠體電泳確認切出包含 Aβ42-GFP 的 890 bp 片段。Lane M 包含片段大小標記。. 48.

(57) 圖七、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞建立流程圖。(A) Flp-In 293 宿主細胞染色體上有 FRT 序列及 Tet repressor (TetR)基因，及 Zeocin、blasticidin S 抗生素篩選基因。(B)共轉 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP、pOG44 質體入宿主細胞。(C)藉同源性重組將 Aβ42-GFP 融合基因置入宿主細胞染色體上。成功轉染之細胞可使用 doxycycline 誘導 Aβ42-GFP 表現。(D)以 Flp-In SH-SY5Y 為宿主細胞，FRT 序列後帶有抗 neomycin 篩選基因。 49.

(58) 50.

(59) 圖八、Aβ42-GFP 細胞株之誘導 Aβ42-GFP 表現分析。(A) Aβ42-GFP 之 293 Flp-In 細胞與 SH-SY5Y Flp-In 細胞，未誘導(-Dox)或以 doxycycline 誘導(+Dox) Aβ42-GFP 表現 2 天後，進行活細胞影像觀察，以相位差(phase-contrast)顯微鏡及螢光(fluorescent)顯微鏡觀察的影像圖。(B)高通量螢光分析。(C)經由 Real-time 定量之 RNA 表現。 (D)西方墨點法分析蛋白表現。(E)為將 Aβ42-GFP 與 GFP 細胞株之西方墨點法分開呈色，Aβ42-GFP 為 standard 30 秒，GFP 為 standard 10 秒。. 51.

(60) 圖九、293 Aβ42-GFP 細胞株藥物篩選。(A)實驗流程圖，接種 0.8 x 104 個細胞於 96 孔盤，於 24 小時加入植物萃取物或合成化合物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導，並於第 96 小時進行高通量分析。(B)篩選圖五實驗所分析出之具有潛力的合成化合物。(C)篩選來自工研院之植物萃取物。以 Untr. (untreated)為 100 %，*為 P < 0.05，**為 P < 0.01， ***為 P < 0.001。 52.

(61) 圖十、293 Aβ42-GFP 細胞處理植物萃取物與合成化合物之 chaperones 檢測。接種 2x105 個細胞於 6 孔盤，於 24 小時加入植物萃取物或合成化合物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導，並於第 96 小時進行西方轉 53.

(62) 漬分析。(A) HSPA1A 蛋白表現與定量分析，以-Dox 組為 100 %。(B) Hsp27 蛋白表現與定量分析，以-Dox 組為 100 %。(C) HSPA5 蛋白表現與定量分析，以-Dox 組為 100 %。(D) Aβ42-GFP 蛋白表現與定量分析，以+Dox 組為 100 %。*為 P < 0.05，**為 P < 0.01，***為 P < 0.001。. 54.

(63) 表一、合成化合物資料表(Janreddy et al., 2011) Polyphenol. Thiophene M.W.. M.W.. M.W.. M.W.. NC001-1. 185.22 NC009-1. 318.12 NC002-5. 378.92 NC004-1. 296.30. NC001-2. 215.24 NC009-2. 332.13 NC002-6. 276.91 NC004-2. 312.30. NC001-3. 213.27 NC009-3. 394.15. NC004-3. 312.30. NC001-4. 245.27 NC009-4. 396.03. NC001-5. 243.30 NC009-6. 346.15. NC001-6. 292.17 NC009-7. 270.13. NC001-7. 249.26 NC009-8. 346.16. NC001-13 296.27 NC009-9. 348.04. NC009-10 298.16. 55.

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