一、Trx-His6-Aβ42 重組質體的確認
pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重 組 質 體 ， 圖 二 A 顯 示 選 殖 入 pET-32b(+)的 Aβ42 序列。將所構築的重組質體以 BstYI 及 NotI 雙切，
經洋菜膠體電泳分析可得到 163 bp 之 Aβ42 片段(圖二 B)。
二、Trx-His6-Aβ42 蛋白的表現
pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體經由轉型作用進入表現宿主 BL21(DE3)pLysS 細胞，以 0.4 μM IPTG 誘導 3 小時後，以親和性管 住進行純化目標蛋白，而後利用 Coomassie Blue 染色觀察誘導與純化 之結果。如圖三 A，23 kDa 之 Trx-His6-Aβ42 融合蛋白在誘導後表現 量明顯增加，其純化效果也很顯著。將相同之蛋白以西方轉漬分析並 以 anti-His 抗體進行雜合呈色，可得知所誘導與純化之蛋白確實為目 標蛋白 Trx-His6-Aβ42 (圖三 B)。
三、Thioflavin T 螢光分析 Trx-His6-Aβ42 蛋白聚集情況
使用圖三純化後之蛋白，以 10 μM Trx-His6-Aβ42 蛋白濃度於 37
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curcumin (0.1 ~ 10 μM)時，在20 μM congo red與10 μM curcumin時分 別下降至40% (P = 0.000)與60% (P = 0.005)，故congo red與curcumin 可作為本篩選平台之正控制組之藥物，且curcumin作用濃度較低。
數據呈現Trx-His6-Aβ42蛋白在經由curcumin (20 μM、10 μM、5 μM) 處理之正控制組抑制Aβ42聚集至54% (P = 0.000)、68% (P = 0.000)、
76% (P = 0.005)。而在Trx-His6-His6蛋白於2天內並無特別明顯之聚 集，並且與Trx-His6-Aβ42蛋白螢光值相差約四倍。在測試合成化合物
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方面，NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6與NC009-7 5種化合 物於濃度20 μM時，分別能使蛋白質聚集降至79% (P = 0.010)、70% (P
= 0.011)、78% (P = 0.022)、71% (P = 0.000)、84% (P = 0.004)，但未 較curcumin更好抑制Aβ42聚集的能力。
四、Doxycycline 誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株之建立
pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重 組 質 體 ， 圖 六 A 顯 示 選 殖 入
pcDNA5/FRT/TO 的 Aβ42 序列。將所構築的重組質體以 HindIII 及 NotI 雙切，經洋菜膠體電泳分析可得到 890 bp 之 Aβ42-GFP 片段(圖六 C)。
將 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體(圖六)，以 Flp-In T-Rex 系 統 進 行 293 及 SH-SY5Y 細 胞 株 之 建 立 。 將 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 及 pOG44 質體(包含 Flp recombinase)共 轉入 Flp-In 宿主細胞中，而後利用 hygromycin 與 blasticidin 進行成功 轉染細胞之篩選(圖七)。並建立 Flp-In GFP 細胞，作為對照。
上述成功建立之細胞株，加入 doxycycline 誘導 GFP、Aβ42-GFP 表現 2 天後，進行活細胞影像系統觀察，可觀察到螢光訊號之產生(圖 八 A)。螢光定量後，293 細胞及 SH-SY5Y 細胞 Aβ42-GFP 誘導後螢 光量分別為 GFP 螢光量 5.1% (P = 0.001)、5.7% (P < 0.001)，皆達到
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顯著差異(圖八 B)。
檢測 293 Aβ42-GFP 與 SH-SY5Y Aβ42-GFP 細胞經 doxycycline 誘導二天Aβ42-GFP 基因表現 RNA (圖八 C)。293 GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 30 倍，293 Aβ42-GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 25 倍，SH-SY5Y Aβ42-GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 28 倍，
SH-SY5Y Aβ42-GFP 細胞在 RNA 上的誘導表現約 25 倍，各細胞間 RNA 誘導表現相差不遠。
於圖八 D 西方轉漬分析之結果可看出 Aβ42-GFP 表現量相較於 GFP 低 。 但 將 相 同 量 之 蛋 白 分 別 呈 色 後 ( 圖 八 E) ， 仍 可 偵 測 到 Aβ42-GFP (曝光 30 秒)蛋白的誘導表現，但相對曝光時間較 GFP (曝 光 10 秒)長 20 秒。
五、誘導表現 Aβ42-GFP 細胞株之藥物篩檢
利用高通量影像分析 293 Aβ42-GFP 細胞抑制聚集螢光亮度檢 測。藥物篩檢流程於圖九 A 中表示，293 Aβ42-GFP 細胞以 1 μM、2.5 μM、5 μM 之 curcumin 前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 Aβ42-GFP 蛋白的表現，於 3 天後以 hochest33342 染核經高通量活細 胞影像儀分析細胞螢光亮度。於圖九 B、C 中，以 DMSO 處理的組 別當控制組，經1 μM、2.5 μM、5 μM curcumin 處理後分別可提升
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Aβ42-GFP 蛋白之螢光亮度至 109% (P = 0.022)、114% (P = 0.007)、
122% (P = 0.005)。
圖九 B、C 中，以 curcumin 處理為正控制組，待測植物萃取物與 合成化合物溶於 DMSO 中，最後作用濃度為 0.1% DMSO，觀察蛋白 聚集的螢光狀況後，以 DMSO 處理之組別螢光亮度為 100%，其中以 3 μM 之 NC009-1、NC009-2、NC009-6 與 1 μg/ml 之 NTNU-043、
NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071，分別可將螢光量提升至 147% (P
= 0.004)、124% (P = 0.034)、118% (P = 0.000)、120% (P = 0.004)、121%
(P = 0.017)、123% (P = 0.010)、132% (P = 0.001)。
六、候選藥物處理 Aβ42-GFP 細胞株活化 Chaperone 之情況
利 用 西 方 轉 漬 法 分 析 293 Aβ42-GFP 細 胞 經 curcumin 以 及 NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1、NC009-2、
NC009-6藥物處理後，活化不同chaperones之情況。如圖十B所示誘導 Aβ42-GFP蛋白表現後，Hsp27蛋白表現量下降至64% (P = 0.012)，而 藥物NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1、
NC009-2處理後有顯著增加，分別提升至91% (P = 0.027)、99% (P = 0.015)、82% (P = 0.026)、83% (P = 0.028)、89% (P = 0.034)以及83% (P
= 0.028)；然而HSPA1A (圖十A)與HSPA5 (圖十C)於誘導後與加藥處
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理並無顯著差別。於圖十D中以誘導Aβ42-GFP表現組為100%，經藥 物NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071處理後，相較於 誘導Aβ42-GFP表現組有顯著的增加，分別提升至158%、178%、
186%、174%且達到顯著差異(P < 0.05)。
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