圖一、pET-32b(+)載體輿圖。(A)載體 pET-32b(+)。圖上標記出接上 Aβ42 片段的 BamHI 與 NotI 切位。(B) pET-32b(+)的 Tag 及 MCS。帶 有組胺酸標記(His-Tag)可使用親和性管柱純化目標蛋白，硫氧還蛋白 標記(Trx-Tag)可增加目標蛋白溶解度。
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圖二、pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體。(A) pGEX-5X-3 重組質體 上包含Aβ42 序列及其兩端的 BstYI、NotI 限制酶切位共 163 bp 序列。
(B) pET-32b(+)-Trx-His6-Aβ42 重組質體限制酶切割圖譜。以 NotI、
BstYI 限制酶雙切載體(lane 1)及重組質體(lane 2)後，以 1.0%洋菜膠體 電泳確認切出包含 Aβ42 的 163 bp 片段。Lanes M1 (1kb marker)、M2 包含片段大小標記。
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圖三、Trx-His6-Aβ42 融合蛋白的誘導表現及純化。Lane 1 包含經 IPTG 誘導表現、金屬離子親和層析法純化的 Trx-His6-Aβ42 融合蛋白，lane 2、lane 3 則分別包含未純化的誘導表現、未誘導表現蛋白。(A)為 coomassie blue 染色、(B)為 His 抗體染色結果。
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圖四、Trx-His6-Aβ42 融合蛋白 聚集情 況與正控制組之 測試。 (A) Trx-His6-Aβ42 融合 蛋白 於 37 ℃、 0 ~ 48 小時之 聚集 情況 。 (B) Trx-His6-Aβ42 融合蛋白分別以 congo red (0.2 ~ 20 μM)、curcumin (0.1
~ 10 μM)處理後以 10 μM thioflavin T 測量其螢光讀值。
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圖五、以 Trx-His6-Aβ42 與 Thioflavin T 螢光結合量來分析 20 μM、
10 μM 與 5 μM 濃度之合成化合物抑制聚集產生之情形。負控制組為 Trx-His6-His6 (Trx-His6)蛋白於 0 ~ 2 天之螢光結合量。*為 P < 0.05，
**為 P < 0.01，***為 P < 0.001。
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圖六、pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體。(A) Aβ42 序列兩端包 含 HindIII、BamHI 限制酶切位，linker 序列兩端包含 BamHI、EcoRI 限制酶切位，GFP 序列(部分)兩端包含 EcoRI、NotI 限制酶切位序列。
(B) pcDNA5/FRT/TO 載體及供選殖置入的 HindIII、NotI 切位。(C) pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP 重組質體的限制酶切割圖譜。HindIII、
NotI 雙切載體(lane 1)及重組質體(lane 2)後，以 1.0%洋菜膠體電泳確 認切出包含 Aβ42-GFP 的 890 bp 片段。Lane M 包含片段大小標記。
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圖七、誘導表現Aβ42-GFP 細胞建立流程圖。(A) Flp-In 293 宿主細胞 染色體上有 FRT 序列及 Tet repressor (TetR)基因，及 Zeocin、blasticidin S 抗生素篩選基因。(B)共轉 pcDNA5/FRT/TO/Aβ42-GFP、pOG44 質 體入宿主細胞。(C)藉同源性重組將 Aβ42-GFP 融合基因置入宿主細 胞染色體上。成功轉染之細胞可使用 doxycycline 誘導 Aβ42-GFP 表 現。(D)以 Flp-In SH-SY5Y 為宿主細胞，FRT 序列後帶有抗 neomycin 篩選基因。
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圖八、Aβ42-GFP 細胞株之誘導 Aβ42-GFP 表現分析。(A) Aβ42-GFP 之 293 Flp-In 細胞與 SH-SY5Y Flp-In 細胞，未誘導(-Dox)或以
doxycycline 誘導(+Dox) Aβ42-GFP 表現 2 天後，進行活細胞影像觀 察，以相位差(phase-contrast)顯微鏡及螢光(fluorescent)顯微鏡觀察的 影像圖。(B)高通量螢光分析。(C)經由 Real-time 定量之 RNA 表現。
(D)西方墨點法分析蛋白表現。(E)為將 Aβ42-GFP 與 GFP 細胞株之西 方墨點法分開呈色，Aβ42-GFP 為 standard 30 秒，GFP 為 standard 10 秒。
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圖九、293 Aβ42-GFP 細胞株藥物篩選。(A)實驗流程圖，接種 0.8 x 104 個細胞於 96 孔盤，於 24 小時加入植物萃取物或合成化合物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導，並於第 96 小時進行高通量分析。(B)篩選圖五 實驗所分析出之具有潛力的合成化合物。(C)篩選來自工研院之植物 萃取物。以 Untr. (untreated)為 100 %，*為 P < 0.05，**為 P < 0.01，
***為 P < 0.001。
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圖十、293 Aβ42-GFP 細胞處理植物萃取物與合成化合物之 chaperones 檢測。接種 2x105個細胞於 6 孔盤，於 24 小時加入植物萃取物或合 成化合物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導，並於第 96 小時進行西方轉
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漬分析。(A) HSPA1A 蛋白表現與定量分析，以-Dox 組為 100 %。(B) Hsp27 蛋白表現與定量分析，以-Dox 組為 100 %。(C) HSPA5 蛋白表 現與定量分析，以-Dox 組為 100 %。(D) Aβ42-GFP 蛋白表現與定量 分析，以+Dox 組為 100 %。*為 P < 0.05，**為 P < 0.01，***為 P <
0.001。
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表一、合成化合物資料表(Janreddy et al., 2011) Polyphenol Thiophene
M.W. M.W. M.W. M.W.
NC001-1 185.22 NC009-1 318.12 NC002-5 378.92 NC004-1 296.30 NC001-2 215.24 NC009-2 332.13 NC002-6 276.91 NC004-2 312.30 NC001-3 213.27 NC009-3 394.15 NC004-3 312.30 NC001-4 245.27 NC009-4 396.03 NC001-5 243.30 NC009-6 346.15 NC001-6 292.17 NC009-7 270.13 NC001-7 249.26 NC009-8 346.16 NC001-13 296.27 NC009-9 348.04 NC009-10 298.16