一、tauRD-DsRed 293 細胞誘導表現
經由 Flp 重組酵素辨識 FRT 序列，以位置專一性重組(site specific
recombination)將野生型 K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed 基因重組入宿主細胞染色體上後，透過 hygromycin B 抗 生素篩選，得到 tauRD-DsRed 及ΔK280 tauRD-DsRed 之 293 細胞株。
此兩細胞株以 doxcycline 誘導表現 K18、ΔK280 tauRD-DsRed 後，雖 皆 可 在 螢 光 顯 微 鏡 下 觀 察 到 融 合 的 紅 螢 光 表 現 ， 但 Δ K280 tauRD-DsRed 細胞紅螢光量顯著低於 K18 tauRD-DsRed 細胞，且正控制 組的 congo red 在較低 10 µM 濃度即顯著提升 DsRed 紅螢光亮度(圖 四)，故以ΔK280 tauRD-DsRed 細胞作為藥物篩選平台。
二、小分子化合物及植物萃取物對蛋白錯誤折疊作用
在正常狀態下，蛋白質自然摺疊，位於蛋白疏水區部位會包覆在 內部。在構型改變為速率決定步驟的過程中，由於錯誤折疊的中間體 其輸水區暴露在親水環境下，進一步聚集使得蛋白分子間更加穩定，
形成低聚物 β-sheet 結構。在此過程中可透過一些化合物，幫助穩定
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蛋白自然摺疊，或對於錯誤折疊 β-sheet 結構進行抑制或者反轉，或 防止錯誤折疊蛋白進一步聚合，或透過誘發細胞本身的清除機制清除 錯誤摺疊蛋白聚合物等，來幫助減緩蛋白質錯誤摺疊(Soto, 2003)。例 如剛果紅可嵌合至Aβ42 胜肽的 β-sheet 上，來抑制或干擾 Aβ 聚集產 生(Carter and Chou, 1998; Taniguchi et al., 2005)。
除剛果紅外，一些 phenothiazines、polyphenols 及 porphyrin ferric dehydroporphyrin IX 等亦有抑制 tau 聚集的效果(Carter and Chou, 1998;
Taniguchi et al., 2005)。本研究中，所檢測的中草藥水萃取物 NH021 或植物酒精萃取物 NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-224、
NTNU-309、NTNU-313、NTNU-319、NTNU-331、NTNU-379 等，
皆可顯著提升ΔK280 tauRD-DsRed 紅螢光亮度(圖六)，其中 NTNU-319 含 具 有 抑 制 GSK-3 活 性 的 falcarindiol (Yoshida et al., 2013) ， NTNU-331 含 Kaempferol 及 quercetin 黃酮類，可增加 3T3-L1 細胞對 葡萄糖的吸收(Fang et al., 2008)，NTNU-379 含 flemicoumarin、黃酮 類成分(Fu et al., 2013)等。前人研究發現植物之黃酮類化合物可抑制 tau 聚集(Taniguchi et al., 2005)。由於植物萃取物成分多樣且複雜，在 細胞內可能藉不同於幫助蛋白摺疊機制，來提升 DsRed 紅螢光亮度。
在小分子化合物部分，由臺師大化學系姚清發老師所合成的吲哚 基喹啉為骨架之衍生物，是透過實驗室建立試管外 Trx-His-Aβ 結合
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Thioflavin T 螢光分析試驗，所篩選出具有抑制 Aβ42 胜肽聚集的化合 物(黃鉦翔, 2013)。前人研究亦指出吲哚衍生物可抑制澱粉樣纖維化作 用(Cohen et al., 2006; Morshedi et al., 2007)。另外，在喹啉衍生物方面 發現具有抑制 tau 聚集效果(Navarrete et al., 2012)。本研究以細胞模式 檢測吲哚基喹啉衍生物，亦發現 NC009-1、NC009-2、NC009-3、
NC009-6、NC009-7 可顯著提升ΔK280 tauRD-DsRed 紅螢光亮度(圖 七)。
三、Chaperones 對防止蛋白錯誤折疊作用
先前研究顯示，熱休克蛋白(heat shock proteins)可藉蛋白酶體 (proteasome)選擇性清除磷酸化及錯誤摺疊的 tau 蛋白(Dickey et al., 2006)。Sahara 等人依據 Braak NFT staging 來分析人腦中不同程度的 神經纖維糾結病理，發現可溶性蛋白質的量與 HSP90、HSP40、
HSP27、α-crystallin 及 CHIP 之間具有正相關性，熱休克蛋白的量並 與顆粒狀 tau 寡聚物(granular tau oligomer)呈負相關，推論熱休克蛋白 可調節可溶性 tau 蛋白的量，故在形成早期神經纖維糾結病徵過程 中，熱休克蛋白在神經退化性疾病的保護作用上扮演重要的角色 (Sahara et al., 2007)。熱休克蛋白 HSC70 (HSPA8)可與 tau 蛋白的微管 結合區域結合，此 HSC70 結合位具 tau 聚集生成的 β-sheet 結構，故
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HSC70 的結合可抑制 tau 聚集產生(Sarkar et al., 2008)。前人研究顯 示，GSK3β 抑制劑 lithium 可以提升 HSP70 (HSPA1A)的表現(Bijur and Jope, 2000)。根據前人研究中發現，在阿茲海氏症及亨丁頓舞蹈症所 引起腦部疾病，GRP78 (HSPA5)蛋白對內質網壓力及未摺疊蛋白反應 具有保護、修補細胞作用(Avila et al., 2013)。在阿茲海默氏症病患中，
可觀察到 HSP27 熱休克蛋白表現量的上升，對神經細胞具有保護性 的作用，並防止磷酸化 tau 蛋白聚集、細胞凋亡(Abisambra et al., 2011) 。
四、先導藥物對ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 的作用
在正常成熟神經細胞，tau 蛋白主要分佈於軸突上，然而在阿茲 海默氏症主要病理特徵中，tau 蛋白聚集錯誤分布於細胞體-樹突 (somatodendritic)，並與初期突觸損失有關聯(Li et al., 2011)。本研究 亦建立誘導表現野生型 K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed 之 SH-SY5Y 細胞。加入 doxcycline 誘導 tauRD-DsRed 表 現後 ，K18 野生型及ΔK280 促 tau 聚集突變型之 tauRD-DsRed mRNA 表現量沒有顯著差異，但西方轉漬分析 tauRD-DsRed 融合蛋白時，野 生型、促 tau 聚集突變型細胞間呈現顯著差異，而此差異並未見於 K18、ΔK280 tauRD-DsRed 的 293 細胞。推測可能因為在 SH-SY5Y
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細胞中ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白的溶解度較差，導致抗體雜合訊 號降低。
野生型 K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed 之 SH-SY5Y 細胞，以 10 µM RA 處理七天誘導神經分化的總突觸生 長、分支數、突起數等神經性狀分析結果顯示，野生型細胞顯著優於 促 tau 聚集突變型細胞，故可以此作為檢測先導藥物的參數。本實驗 中，透過ΔK280 SH-SY5Y 細胞株，以 retinoic acid 促使其分化後，
再處理經由ΔK280 293 細胞已篩選出之候選化合物，其中 congo red、NTNU-008、NC 009-1 及 NC009-7 可使得ΔK280 tauRD-DsRed 紅色螢光之神經突觸總生長增加(圖九)。進一步分析先導藥物處理後 的蛋白表現，發現 GSK-3β 抑制劑類似物 NTNU-008 可提升 GRP 78、
HSP27 蛋白表現，吲哚喹啉衍生物 NC009-1、NC009-7 可提升 HSP27 蛋白表現，且三者皆可提升ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白的抗體雜合 訊號(圖十)。未來可進一步評估三者在 SH-SY5Y 細胞中是否可有效 增加ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白的溶解度。
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