圖一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 質體建構。(A) tauRD序列以 linker 連接 DsRed 螢光蛋白之建構。(B)人類神經系統中最長 tau441蛋白及第 280 個賴胺酸缺失的促 tau 聚集突變(∆K280) (Khlistunova et al., 2006)。(C)真核表現載體 pcDNA5/FRT/TO 及以 tauRD-DsRed 片段接合 入的 NotI 切位。
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圖二、誘導表現 tauRD-DsRed 細 胞 建 立 流 程 圖 (Flp-In™ T-REx™
System, Invitrogen)。(A) Flp-In 293 宿主細胞帶有 FRT 序列、Tet repressor (TetR)基因及抗 Zeocin、抗 blasticidin S 抗生素篩選基因。(B) 共轉 pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed、pOG44 質體入宿主細胞。(C)以 hygromycin 篩選重組後之細胞，使用 doxycycline 誘導 tauRD-DsRed 表現。(D) Flp-In SH-SY5Y 宿主細胞，帶有 FRT 序列及抗 neomycin 篩選基因。
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圖三、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體。(A) pcDNA5/FRT/TO 載體、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 質體輿圖及標示出的 EcoRI 限制 酵素切位。(B) pcDNA5/FRT/TO 載體(Vec)、pDsRed-Monomer-C1 質 體 (DsRed) 、 pcDNA5/FRT/TO/K18 tauRD-DsRed 重 組 質 體 、 pcDNA5/FRT/TO/∆K280 tauRD-DsRed 重組質體以 EcoRI 切割(+)後的 0.8%洋菜膠體電泳照片，lane M 包含片段大小標記。(C) 野生型 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 重組質體定序結果。
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圖四、K18 及∆K280 tauRD-DsRed 293 細胞記述。(A)即時定量 PCR 分 析 doxcycline 誘導二天後 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 之 mRNA 表現量
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(左)與誘導倍率(右)。(B)西方轉漬分析 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 融 合蛋白表現(左)及定量(右)。(C) Hoechst 染核(藍色)後以高通量影像分 析 DsRed 紅色螢光亮度(上)及定量(左下)。(D)以剛果紅(Congo red，
1、10、20 µM)前處理野生型(K18)及促 tau 聚集突變型(∆K280)細胞 8 小時後，以 doxcycline 誘導 tauRD-DsRed 融合蛋白表現三天後的 DsRed 紅螢光亮度分析，未處理前剛果紅者為 100%。P < 0.05 具有統計上 的顯著差異。
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圖五、K18 及∆K280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞記述。(A)即時定量 PCR 分析 doxcycline 誘導一至二天後 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 之
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mRNA 表現量(左)與誘導倍率(右)。(B)西方轉漬分析 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現(左)及定量(右)。(C)野生型(K18)及促 tau 聚集突變型(∆K280)細胞以 retinoic acid (10 µM)誘導神經分化，第二 天加入 doxcycline 誘導 tauRD-DsRed 表現七天後的神經突觸生長性狀 (包含總突觸生長及突起數、分支數)。P < 0.05 具有統計上的顯著差 異。
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圖六、中草藥及植物萃取物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩 選。(A)實驗流程圖。接種 2×104 ∆K280 細胞於 96 孔盤，於 24 小時 後加入中草藥或植物萃取物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導ΔK280
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tauRD-DsRed 融合蛋白表現。三天後進行高通量分析。(B-C)篩選具有 潛力的中草藥及植物萃取物。未處理者之紅色螢光亮度為 100%，以 剛果紅(Congo red，1、10、20 µM)為正控制組。NH-008、NH-021 (順 天堂水萃取之中草藥)濃度為 50、500 µg/ml，NTNU-043 ~ NTNU-395 (工研院酒精萃取之植物藥)濃度為 1 ~ 10 µg/ml。以 Hoechst 33342 染 核(藍色)計數細胞數目，紅線表示 80%存活率。*為 P < 0.05；**為 P
< 0.01。
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圖七、吲哚喹啉衍生物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選。
(A)實驗流程圖。接種 2×104 ∆K280 細胞於 96 孔盤，於 24 小時後加 入吲哚喹啉衍生物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現。三天後進行高通量分析。(B)篩選具有潛力的吲哚喹 啉衍生物。未處理者之紅色螢光亮度為 100%，以剛果紅(Congo red，
1、10、20 µM)為正控制組。NC009-1 ~ NC009-7 (臺灣師大化學系姚 清發老師提供)濃度為 1、3、10 µM。以 Hoechst 染核(藍色)計數細胞 數目，紅線表示 80%存活率。*為 P < 0.05；**為 P < 0.01。
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圖八、GSK-3β 抑制劑類似物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物 篩選。(A)實驗流程圖。接種 2×104 ∆K280 細胞於 96 孔盤，於 24 小 時後加入 GSK-3β 抑制劑類似物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現。三天後進行高通量分析。(B)篩選具有潛 力的 GSK-3β 抑制劑類似物。未處理者之紅色螢光亮度為 100%，以 剛果紅(Congo red，1、10、20 µM)為正控制組。NTNU-001 ~ NTNU-010 (工研院提供)濃度為 1、3、10 µM。以 Hoechst 染核(藍色)計數細胞數 目，紅線表示 80%存活率。*為 P < 0.05；**為 P < 0.01。
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圖九、GSK-3β 抑制劑類似物及吲哚喹啉衍生物於ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之藥物篩選。(A)實驗流程圖。第一天接種 1×105 ∆K280 細胞於 24 孔盤，培養液含 10 µM RA 以誘導神經分化。24 小時後(第 二天)加入 GSK-3β 抑制劑類似物(NTNU-003、NTNU-008，10 µM)或 吲哚喹啉衍生物(NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6、NC009-7，
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10 µM)，再於 8 小時後加入 Dox (1 µg/ml)誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融 合蛋白表現，並於第四、七天更換含 Dox、RA、待檢測化合物的培 養液，第八天進行高通量分析。(B)促 tau 聚集突變型(∆K280)細胞及 以 剛 果 紅 (Congo red) 、 NTNU-008、 NC009-7 處 理 後 及 未 處 理 者 (Untreated)之神經突觸生長性狀代表圖。(C)以未處理化合物之神經突 觸 總 生 長 為 100% (Untr.) ， 剛 果 紅 (Congo red) 、 NTNU-003 、 NTNU-008、NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6、NC009-7 之 神經突觸生長性狀定量圖。
*
為 P < 0.05；**
為 P < 0.01。52
圖十、ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞處理先導藥物之蛋白檢測。
(A) 剛 果 紅 (Congo red) 及 GSK-3β 抑 制 劑 類 似 物 (NTNU-003 、 NTNU-008)前處理後之 GRP78、HSP27、ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表 現與定量分析，以- Dox 組(GRP78、HSP27)或+ Dox 組(ΔK280 tauRD-DsRed)為 100%。(B)吲哚喹啉衍生物(NC009-1、NC009-2、
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NC009-3、NC009-6、NC009-7)前處理後之 HSP27、ΔK280 tauRD-DsRed 蛋 白 表 現 與 定 量 分 析 ， 以 - Dox 組 (HSP27) 或 + Dox 組 (Δ K280 tauRD-DsRed)為 100%。