一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體的確認
構築的野生型 pcDNA5/FRT/TO/K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突 變型pcDNA5/FRT/TO/ΔK280 tauRD-DsRed 重組質體，以 EcoRI 限制 酶切割後，經由 0.8%洋菜膠體電泳可分別得到包含 tauRD、linker 的 462 bp 片段，及包含 DsRed 的 1.5 kb 片段(圖三 B)。野生型 K18 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD序列定序結果顯示第 280 位置賴氨酸的 密碼子 AAG 剔除(圖三 C)。
二、Doxycycline 誘導表現 tauRD-DsRed 293 細胞株之建立
野生型 K18 及促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞透 過 hygromycin 抗生素篩選後，以 doxcycline 誘導，利用即時聚合酶 鏈鎖反應分析細胞誘導二天後 mRNA 基因表現量。如圖四 A 所示，
與內生性的 HPRT1 相較，野生型細胞未誘導、誘導的 tauRD-DsRed mRNA 量約為 HPRT1 mRNA 之 1.0、9.4 倍，促 tau 聚集突變型細胞 未誘導、誘導量約為 HPRT1 mRNA 之 0.9、8.4 倍；與未誘導相較，
野生型、促 tau 聚集突變型細胞誘導倍率各約為 9.0、9.7 倍，兩者間
21
沒有顯著差異(P > 0.05)。圖四 B 為 doxcycline 誘導兩天後蛋白表現 量，可偵測到約 43 kDa 的 tauRD-DsRed 融合蛋白表現，野生型、促 tau 聚集突變型細胞間 tauRD-DsRed 蛋白表現量亦沒有顯著差異(100% vs.
90%，P > 0.05)。圖四 C 為螢光顯微影像，DsRed 螢光亮度分析結果 顯示，ΔK280 螢光亮度較低，兩者達統計上差異(100% vs. 73%，P =
0.015)。圖四 D 顯示野生型 K18 細胞在以 20 µM congo red 處理後可 使螢光亮度顯著提升(126%，P = 0.045)，促 tau 聚集突變型 ΔK280 細 胞則以 10、20 µM congo red 處理後，螢光亮度皆顯著提升(126%，P
= 0.029 及 146%，P = 0.008)。
三、tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞誘導表現
野生型 K18 及促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細 胞透過 hygromycin 抗生素篩選後，以 doxcycline 誘導，利用即時聚 合酶鏈鎖反應分析細胞誘導一、二天後 mRNA 基因表現。如圖五 A 所示，與內生性的 HPRT1 相較，野生型細胞未誘導、誘導一、二天 的 tauRD-DsRed mRNA 量約為 HPRT1 mRNA 之 2.0、18.5、20.9 倍，
促 tau 聚集突變型細胞未誘導、誘導一、二天的量約為 HPRT1 mRNA 之 0.6、5.4、5.5 倍；與未誘導相較，野生型、促 tau 聚集突變型細胞 誘導一至二天的倍率各約為 9.4 ~ 10.6、9.6 ~ 9.9 倍，兩者間沒有顯著
22
差異(P > 0.05)。圖五 B 為 doxcycline 誘導兩天後蛋白表現量，可偵測 到約 43 kDa 的 tauRD-DsRed 融合蛋白表現，野生型、促 tau 聚集突變 型細胞間 tauRD-DsRed 蛋白表現量有顯著差異(100% vs. 49%，P = 0.009)。以 10 µM RA 處理七天誘導神經分化的神經性狀分析結果顯 示，兩者在總突觸生長(total outgrowth) (21.1 vs. 13.9 µm，P = 0.004)、
分支數(branches) (1.5 vs. 1.0，P = 0.041)及突起數(process) (2.5 vs.
1.8，P = 0.025)上達到統計上差異(圖五 C)。
四、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之中草藥及植物 萃取物篩選
利用高通量影像分析 tauRD-DsRed 螢光亮度，來檢測中草藥及植物 萃取物抑制ΔK280 聚集情形。藥物篩檢流程顯示於圖六 A，ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞以剛果紅或待檢測中草藥及植物萃取物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現，3 天後以 Hochest 33342 染核，經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮 度。如圖六 B 所示，以未處理者之紅色螢光亮度為 100%，做為正 控制組的剛果紅(Congo red)於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢 光亮度分別為 109% (P = 0.004)、118% (P = 0.017)。順天堂水萃取之 中草藥 NH-021 於 500 µg/ml 濃度前處理後，DsRed 螢光亮度為 116%
23
(P = 0.035)。工研院酒精萃取之植物藥 NTNU-043、NTNU-057、
NTNU-059 於 10 µg/ml 濃度前處理後，DsRed 螢光亮度為 106% (P = 0.032)、106% (P = 0.044)、105% (P = 0.044)。圖六 C 顯示另一批的 工研院酒精萃取之植物藥檢驗結果，剛果紅於 10 µM、20 µM 前處 理後，DsRed 螢光亮度分別為 108% (P = 0.038)、113% (P = 0.015)，
NTNU-224 (1、3、10 µg/ml)、NTNU-309 (10 µg/ml)、NTNU-313 (10 µg/ml)、NTNU-319 (10 µg/ml)、NTNU-331 (10 µg/ml)、NTNU-379 (3、10 µg/ml)前處理後，DsRed 螢光亮度分別為 102 ~ 109% (P = 0.017
~ 0.005)、114% (P = 0.011)、120% (P = 0.021)、107% (P = 0.011)、
110% (P = 0.009)、104 ~ 114% (P = 0.023 ~ 0.006)。上述有顯著增加 DsRed 螢光亮度的中草藥及植物萃取物處理，以 Hochest 33342 染核 計數活細胞後，細胞存活率皆有 80%以上。
五、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之吲哚基喹啉衍 生物篩選
利用高通量影像分析 tauRD-DsRed 螢光亮度，來檢測吲哚基喹啉 衍生物抑制 ΔK280 聚集情形。藥物篩檢流程顯示於圖七 A，ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞以剛果紅或待檢測吲哚基喹啉衍生物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現，3 天後
24
以 Hochest 33342 染核，經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。
如圖七 B 所示，以未處理者之紅色螢光亮度為 100%，做為正控制組 的剛果紅(Congo red)於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢光亮度分 別為 109% (P = 0.004)、118% (P = 0.017)。台灣師大化學系姚清發老 師提供之吲哚基喹啉衍生物 NC009-1 (3、10 µM)、NC009-2 (10 µM)、
NC009-3 (10 µM)、NC009-6 (10 µM)及 NC009-7 (10 µM)前處理後，
DsRed 螢光亮度分別為 108 ~ 116% (P = 0.041 ~ 0.038)、113% (P = 0.020)、109% (P = 0.020)、107% (P = 0.022)、106% (P = 0.018)。上述 有顯著增加 DsRed 螢光亮度的吲哚基喹啉衍生物處理，以 Hochest 33342 染核計數活細胞後，除 NC009-1、NC009-2、NC009-3 的 10 µM 處理後細胞存活率分別為 60%、73%、79%外，其餘皆有 80%以上。
六、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之 GSK-3β 抑制 劑類似物篩選
利用高通量影像分析 tauRD-DsRed 螢光亮度，來檢測 GSK-3β 抑
制劑類似物抑制 ΔK280 聚集情形。藥物篩檢流程顯示於圖八 A，
ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞以剛果紅或待檢測 GSK-3β 抑制劑類似 物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表
25
現，3 天後以 Hochest 33342 染核，經高通量活細胞影像儀分析細胞 螢光亮度。如圖八 B 所示，以未處理者之紅色螢光亮度為 100%，做 為正控制組的剛果紅於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢光亮度分 別為 109% (P = 0.004)、118% (P = 0.017)。工研院提供之 GSK-3β 抑 制劑類似物 NTNU-001、NTNU-003、NTNU-008 (10 µM)前處理後，
DsRed 螢光亮度分別為 118% (P = 0.020)、107% (P = 0.010)、111% (P
= 0.025)。上述有顯著增加 DsRed 螢光亮度的 GSK-3β 抑制劑類似物 處理，以 Hochest 33342 染核計數活細胞後，細胞存活率分別為 38%、
77%、94%。
七、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之先導藥 物篩選
將剛果紅、GSK-3β 抑制劑類似物(NTNU-003、NTNU-008)及吲 哚喹啉衍生物(NC009-1 ~ NC009-7)進一步處理 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 神經 細胞 ， 以 檢測其是 否 改善 神 經突觸總 生長性 狀 。 SH-SY5Y 細胞檢測流程顯示於圖九 A，細胞以 10 µM RA 誘導神經 分化後，第二天加入剛果紅、GSK-3β 抑制劑類似物或吲哚喹啉衍生 物(10 µM)前處理 8 小時，再誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現。
七天後分析ΔK280 tauRD-DsRed 細胞之神經突觸總生長。圖九 B 顯示
26
剛果紅、NTNU-008、NC009-7 前處理及未前處理者的神經突觸生長 情形。如圖九 C 的量化圖所示，以未處理化合物之神經突觸總生長為 100%，正控制組的剛果紅前處理後，神經突觸總生長為 110% (P = 0.026)，NTNU-008、NC009-1、NC009-7 前處理後神經突觸總生長分 別為 139% (P = 0.006)、115% (P = 0.020)及 124% (P = 0.002)。
八、先導藥物處理促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之蛋白表現分析
如 上 述 般 以 剛 果 紅 、 GSK-3β 抑 制 劑 類 似 物 (NTNU-003 、 NTNU-008) 及 吲 哚 喹 啉 衍 生 物 (NC009-1 ~ NC009-7) 處 理 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 神經細胞，七天後分析ΔK280 tauRD-DsRed、
HSP27 或 GRP 78 蛋白表現情形。如圖十所示，以誘導後之ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現量為 100% (+ Dox)，前處理 NTNU-008、NC009-1 及 NC009-7 後，ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現量分別顯著提升至 246% (P = 0.026)、157% (P = 0.044)及 257% (P = 0.004)。以未誘導Δ K280 tauRD-DsRed 蛋白表現(- Dox)之 HSP27 之蛋白表現為 100%，誘 導ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現七天後，HSP27 蛋白表現量並無顯著 變化(100% ~ 115%，P > 0.05)，但 NTNU-008、NC009-1 及 NC009-7 前處理導致 HSP27 之蛋白表現量分別顯著提升至 189% (P = 0.046)、
27
124% (P = 0.020)及 130% (P = 0.016)。以未誘導ΔK280 tauRD-DsRed 蛋 白 表 現 (- Dox) 之 GRP78 之 蛋 白 表 現 為 100% ， 誘 導 Δ K280 tauRD-DsRed 蛋白表現七天後，GRP78 蛋白表現量並無顯著變化 (96%，P > 0.05)，但前處理 NTNU-008 導致 GRP78 之蛋白表現量顯 著提升 174% (P = 0.027)。作為正控制組的剛果紅並未影響ΔK280 tauRD-DsRed、HSP27 或 GRP 78 蛋白表現。
28